Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het oog is een klein en afgesloten orgaan, wat het een ideaal doelwit maakt voor gentherapie. Recentelijk zijn verschillende strategieën toegepast op gentherapie bij retinopathieën door gebruik van niet-virale en virale genoverdracht naar het netvlies en het retinale pigmentepitheel (RPE). Subretinale injectie is de beste aanpak om virale vectoren rechtstreeks aan RPE-cellen te leveren. Voordat de klinische proef van een gentherapie wordt uitgevoerd, is het onvermijdelijk om de werkzaamheid van de therapie te valideren in diermodellen van verschillende retinopathieën. Daarom wordt subretinale injectie in muizen een fundamentele techniek voor een oculaire gentherapie. In dit protocol bieden we de eenvoudige en reproduceerbare techniek voor subretinale injectie van virale vectoren bij experimentele muizen. Deze techniek is aangepast van de intravitreale injectie, een techniek die veel wordt gebruikt in oogheelkundige klinieken. De representatieve resultaten van RPE/choroid/scleral complex flat-mount zullen helpen om de werkzaamheid van deze techniek te begrijpen en het volume en de titer van virale vectoren aan te passen voor de mate van gentransductie.
Inleiding
Oogheelkunde, heeft gentherapie ontpopt als de behandeling modaliteit in monogene erfelijke retinopathieën. Er zijn geërfd retinopathieën geassocieerd met genen in retinale pigment epitheel (RPE), met inbegrip van Leber congenitale amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3 en choroideremia 4. Het onderzoek gebied van gentherapie is uit te breiden, zowel in preklinische studies en klinische proeven met behulp van virale vectoren zoals adeno-geassocieerde virus (AAV), lentivirus (LV) en adenovirus (Ad) 5. Verschillende virale vectoren hebben verschillende tropisme in de retina. Voor een veilige en effectieve gentherapie, virale vectoren moeten zorgvuldig worden geselecteerd op basis van doelcellen en doelgenen.
De route van genoverdracht is ook belangrijk voor effectieve genoverdracht aan doelcellen dus moet zorgvuldig worden eveneens gekozen. De twee meest voorkomende methoden voor intra-oculaire aflevering van virale vectoren zijn subretrechtelijke injectie en intravitreale injectie 6. Laatstgenoemde, intravitreale injectie, is op grote schaal gebruikt om geneesmiddelafgifte te choroïdale neovascularisatie in natte leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en maculair oedeem bij diabetische retinopathie 7 behandelen. Intravitreale route verschaft blootstelling van virale vectoren voor glasvocht en binnenste retina, maar de diffusie van de vectoren naar de buitenste retina beperkt. Anderzijds, de subretinale route biedt rechtstreekse afgifte van virale vectoren aan de mogelijke ruimte tussen retina en RPE, induceren een gelokaliseerd bleb. Daarom wordt subretinale injectie momenteel beschouwd als meer efficiënte route voor het richten RPE en fotoreceptorcellen. Qua chirurgische benadering, pars plana wordt gekozen als een veilig gebied voor intravitreale injectie retinale schade bij menselijke patiënten te voorkomen. Door simpelweg het wijzigen van deze aanpak aan muizen, konden we virale vectoren subretinally of intravireally injecteren via limbale aanpak.
In deze videoartikel tonen we een eenvoudige en handige methode van subretinale injectie van virale vectoren in muizen RPE. Na enkele punctie bij posterior aan limbus met een 30 G 1/2 naald wordt een 33 G stompe naald uitgerust microliter spuit ingevoegd in de subretinale ruimte via de limbale prikplaats. De virale vectoren van 1,5-2 ul volume geïnjecteerd om de potentiële ruimte tussen retina en RPE induceren subretinale blebs. Deze werkwijze kan onder directe visualisatie worden uitgevoerd middels chirurgische microscoop. Herhaalde praktijk zal garanderen reproduceerbare resultaten, zelfs zonder directe visualisatie van de blaar formatie. Dit zal helpen de onderzoekers om nauwkeurige en tijdbesparende experimenten uit te voeren voor subretinale gentherapie bij muizen RPE.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Geluid Onderzoek en de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Seoul National University Institutional Animal Care en gebruik Comite en Seoul National University Hospital Bioveiligheid Comité.
1. Voorbereiding Injection Kit en virale vectoren
- Bereid de microliter spuit uitgerust met een 33 G stompe naald gesteriliseerd met ethyleenoxide gas. Verdun de virale vectoren in PBS voor de adequate titer in de micro tube (dwz 1 x 10 6 TU / ul). Spoel de spuit enkele malen met virale vectoren om elke dode ruimte te verwijderen in de spuit.
2. Subretinal Injectie van virale vectoren
- Verdoven volwassen muizen (dwz, 6-8 weken oud) een intraperitoneale injectie van het mengsel van tiletamine en zolazepam (1: 1, 2,25 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine hydrochloride (0,7 mg / kg lichaamsgewicht) of een andere geschikte anesthesie regime.
- Verwijden leerlingen met een oog druppel fenylefrine 0,5% en tropicamide 0,5%.
- Bereid de microliter spuit door belading met 1,5-2 ul virale vectoren.
- Open het ooglid en steken het oog op de evenaar voor gemakkelijke injectie bloot en focus op onder de operatiemicroscoop. Handhaaf het uitstekende ooghoogte tot de voltooiing van de injectie, of verplaatsing van de naald kan optreden tijdens de injectie. Om de oogbol stevig vast te houden, plaats de vingers buiten de orbitale rand.
- Breng een druppel oftalmische viscoelastische oplossing van het hoornvlies.
- Plaats een rond dekglaasje op de top van het hoornvlies tot het netvlies te visualiseren.
- Doorboren klein gaatje aan lichte de limbus met een steriele 30 G 02/01 naald voor de verdere subretinale injectie. Maak het gat inferieure for het rechteroog en superieur voor het linkeroog voor het gemak.
OPMERKING: Als het gat is gemaakt op tijdelijke of nasale, is het moeilijk om te worden gedekt door het ooglid na de injectie. Initiële punctie moet iets worden achter de limbus de limbale vaten die langs de limbus en gemakkelijk herkenbaar voorkomen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het raken van de lens met een naald tijdens het maken van de eerste lekke band. Steek het hele afschuining van de naald om de lens punctie te voorkomen. - Plaats de 33 G stompe naald van microliter spuit door de pre-lekke gat en de aanpak van de naald in de subretinale ruimte tot het moment waarop een milde weerstand wordt gevoeld.
LET OP: Voor de subretinale injectie, de beste aanpak hoek van de naald is ongeveer 45 graden tegen iris vliegtuig, en de stompe naald moet naar achteren worden geschoven in de richting van pupil- omgeving. Gestippelde vierkant aangegeven de voorgestelde naald pad over het glasachtig holte van de subretinale spuitgietenn in figuur 1.
OPMERKING: Er zullen geen weerstand voelde toen piercing (of passeren) de retinale lagen zoals ze zijn erg zacht. Aldus, de eerste gevoel van lichte weerstand geeft aan dat de naald reeds aangeraakt RPE laag en het inbrengen van de naald moet worden gestopt. Wees voorzichtig om geen sclerale weefsel dringen met hoge druk, omdat de naald in de potentiële subretinale ruimte moet worden geplaatst. Als de naald prikt de sclerale weefsel door overmatige kracht, gaat het in de oculaire orbitale ruimtes zonder weerstand. (Deze stap is essentieel)
Figuur 1. Schematisch diagram van de Subretinal Injection. H & E gekleurde dwarsdoorsnede van de muis oog die de structuren met een naald route voor de subretinale injectie aangegeven (gestippeld vierkant). Vergroting: 40X, Schaal bar: 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Injecteer de virale vectoren (dat wil zeggen, 1 x 10 6 TU / ul) voorzichtig in de subretinale ruimte zonder tremor om ongewenste weefselschade te voorkomen en de naald zachtjes trekken. Houd de oogbol vast tijdens de injectie zoals beschreven in 2.4.
- Let op de vorming van subretinale bleb na de injectie onder operationele microscoop om ervoor te zorgen dat er geen netvlies bloeden.
Figuur 2. Subretinal Belb Vorming zonder retinale bloeding. Microscopische mening van subretinale belb na de subretinale injectie onder operatiemicroscoop blijkt succesvolle blaar vorming zonder retinale bloeding.m / files / ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Sluit voorzichtig het ooglid aan de injectieplaats voor zelfdichtende dekken. Terug de muizen naar huis kooi en levend houden totdat de evaluatie.
OPMERKING: Nadat de onderzoekers wennen aan de procedures, kunnen ze de herhaalbare resultaten met snelle procedures komen door het overslaan van deze stappen (2,5, 6 en 10)
3. Evaluatie van de werkzaamheid van Gene Levering in retinaal pigment epitheel
- Offer de muizen in de CO 2 kamer. Ophelderen met een schaar de ogen.
- Bevestig de ogen in 4% paraformaldehyde oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur tot enkele dagen.
- Pak het hoornvlies met fijne pincet en punctie het hoornvlies met micro-schaar. Verwijder de cornea na scharende langs de limbus. Verwijder de lens met een tang.
- Trim de ciliaire lichaam met mICRO-schaar waardoor netvliesloslating. Trek de hele netvlies van de RPE / choroid / sclera complex. Snijd de RPE / choroid / sclerale complex radiaal vanaf de omtrek naar het centrum Bij oogzenuw meerdere malen 4-8 bladeren voor vlakke montage maken.
- Flip de RPE / choroïd / sclerale complex RPE naar beneden te maken, en trim alle resterende weefsels aan de sclerale zijkant waaronder de spieren, bindweefsel en de oogzenuw. Deze stap is belangrijk om een vlakke RPE / choroïd / sclerale complexer omdat het resterende weefsel maakt het complex ongelijk.
- Incubeer het complex met primaire en secundaire antilichaam voor uw specifieke onderzoeksdoeleinden (optioneel, zie de verwijzingen voor gedetailleerde methoden). Flat-mount de RPE / choroïd / sclerale complexen op het glas glijbaan en absorberen de PBS met een absorberende spons.
- Voeg 30 ul van de montage-oplossing en plaats de deksel dia. Observeer het monster voor de werkzaamheid van vector levering onder fluoresceïne microscoop. Laat de monsters inde koelkast voor verdere observatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de effectiviteit van de subretinale injectie op viraal gen transductie evalueren van dit protocol, gebruikten we in de handel verkrijgbaar LV vectoren met CMV promoter die zowel GFP en RFP de indicator. Ogen werden enucleated na de juiste tijd volgens het onderzoek doel. Voor representatieve resultaten zijn ogen enucleatie 10 weken en 20 weken na de subretinale injectie. Na volledige verwijdering van de retina volgens de hierboven beschreven werkwijze, de vlakke onderstel van RPE / choroid / sclera complex werd geëva...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze video artikel beschreven we de limbale-aanpak subretinale injectietechniek in detail met representatieve resultaten van RPE / choroïd / sclerale flat-mount. Dit is een eenvoudige en handige techniek voor subretinale injectie van virale vectoren in RPE. Directe visualisatie van bleb formatie tijdens de injectie is een belangrijke stap voor accurate levering voor de beginners. Er zijn enkele subretinale injectie technieken geïntroduceerd in Journal of Visualized Experimenten 8-10. Subretinale ruimte is ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de Seoul National University Research Grant (800-20140542), de Pioneer Research Program van NRF / MEST (2012-0009544), en de Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program van NRF / MEST (2009-0090895), en de verlening van NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | Voor eenvoudige injectie met één hand |
| 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initiële punctie voor subretinale injectie |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresceïne microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Gebruikt om vectoren te verdunnen |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Gebruikt om vectoren te verdunnen |
| Troperin (Phenylephrin 0.5% - Tropicamide 0.5%) | Hanmi | Voor dilatatie | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Steriele) | Bausch&Lomb | Voor topische anesthesie | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride en zolazepam hypochloride) | Virbac | Voor algemene anesthesie | |
| Rompun injectie (Xylazine HCl) | Bayer | Voor algemene anesthesie |
Referenties
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932(2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
