Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Photopatterning eiwitten en cellen in een waterige omgeving met behulp van TiO

7.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53045

⸱

26 oktober 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences, Tohoku University, 2CREST, Japan Science and Technology Agency, 3School of Fundamental Science and Engineering, Waseda University, 4Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 5Graduate School of Biomedical Engineering, Tohoku University, 6Faculty of Science and Engineering, Waseda University

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het wijzigen van de celaffiniteit van een scaffoldoppervlak in een waterige omgeving. De methode maakt gebruik van titaandioxide fotokatalyse om organische film in het foto-bestraalde gebied af te breken. We laten zien dat het kan worden gebruikt om microdomeinen van scaffold-eiwitten te creëren, zowel ex situ als in situ.

Samenvatting

Organische verontreinigingen geadsorbeerd op het oppervlak van titaniumdioxide (TiO2) kan worden afgebroken door fotokatalyse onder ultraviolet (UV) licht. Hier beschrijven we een nieuw protocol toepassen van de TiO 2 fotokatalyse lokaal veranderen cell affiniteit van het substraatoppervlak. Voor dit experiment werd een dunne TiO 2-film werd sputter coating op een glazen dekglaasje en de TiO 2 oppervlak werd vervolgens gemodificeerd met een organosilaan monolaag afgeleid van octadecyltrichloorsilaan (OTS), die celadhesie remt. Het monster werd ondergedompeld in een celkweekmedium en gerichte UV licht werd bestraald met een achthoekige gebied. Wanneer een neuronale cellijn PC12-cellen werden uitgeplaat op het monster cellen gehecht alleen de UV-bestraalde gebied. We tonen verder aan dat deze modificatie van het oppervlak kan ook worden uitgevoerd in situ, dat wil zeggen, zelfs wanneer de cellen groeien op het substraat. Een juiste modificatie van het oppervlak vereist een extracellulaire matrix pProtein collageen aanwezig in het medium ten tijde van UV bestraling. De hier gepresenteerde techniek kan eventueel worden toegepast in patroonvorming meerdere celtypen te construeren gemengde cultuursystemen of willekeurig manipuleren cellen onder kweek.

Inleiding

Halfgeleiderlithografie processen en zijn derivaten - zoals fotolithografie 1,2, electron-beam lithografie 3-6 en microcontact afdrukken 7-10 - zijn inmiddels uitgegroeid tot een gevestigde praktijk in de celbiologie aan levende cellen te groeien in een bepaalde positie en geometrie. De patroon werkwijze berust op het gebruik van microfabricated substraten bestaande uit micro-eiland cel permissief coating in een niet-permissieve achtergrond. Dergelijke substraat dient als een template patroon van de cellen. Deze technologieën hebben ons de nieuwe werkwijzen om cellen en hun functie ingenieur bij enkel- en meercellige level, uittreksel de intrinsieke eigenschappen van de cellen, en de doorvoer van celgebaseerde drugonderzoek 11 verhogen.

De mate-van-vrijheid in cel patroonvorming zou enorm toenemen als het patroon geometrie in situ kan worden veranderd, dat wil zeggen, terwijl cellen gekweekt op de sppervlakte. De conventionele werkwijzen voor patroonvorming niet direct hier toegepast, aangezien samples verwerken atmosfeer of in vacuüm. Daarom diverse nieuwe oppervlakte modificatie technieken zijn voorgesteld, die gebaseerd zijn, bijvoorbeeld op fotoreactieve verbindingen 12,13 of laser ablatie 5,14, om er maar een paar te noemen. De voorgestelde werkwijzen zijn goed beoordeeld door Robertus et al. 15, en recenter door Choi et al. 16 en 17 Nakanishi.

Hier in dit artikel beschrijven we een nieuw protocol van in-situ modificatie van het oppervlak, die profiteren van de fotokatalytische afbraak van organische moleculen neemt een titaniumdioxide (TiO2) oppervlak 18,19. In deze werkwijze wordt een TiO 2 film ingevoegd tussen het glassubstraat en de organische film die de cellen interfaces en de organische film wordt ontleed in situ door het plaatselijk bestralen ultraviolette (UV)licht om een ​​gebied van belang (λ <388 nm). We tonen aan dat het nieuwe protocol kan worden gebruikt om micropatterns van extracellulaire matrixeiwitten en levende cellen zowel ex situ als in situ te creëren. TiO 2 biocompatibel, chemisch stabiel, en optisch transparant, kenmerken waarvan maakt kinderen te voeren in cel-kweek-experimenten. Dit protocol voorziet in een materiaal-wetenschap gebaseerde alternatief voor het wijzigen van celcultuur steigers in celcultuur omgeving.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van TiO 2 gecoate dekglaasje

  1. Nummer de dekglaasjes met een diamant kraspen. Dit helpt niet alleen bij te houden van elke dekglaasjes maar ook voor zorgen dat de juiste zijde van het monster gericht. Reinig de dekglaasjes, eerste stromend DDH 2 O vervolgens door onderdompeling in piranha-oplossing (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Na 10 minuten, spoel de dekglaasjes grondig 8 maal DDH 2 O. Droog de ​​dekglaasjes onder een stroom N2.
  2. Stel TiO 2 doel in het radiofrequentie (RF) sputtering systeem. Bevestig de dekglaasjes op een monster houder van het sputteren apparatuur met behulp van een polyimide tape. Plaats de monsterhouder in de sputterkamer. Evacueren van de kamer tot de druk bereikt 2,0 x 10 -4 Pa.
  3. Introduceren Ar gas in de kamer en stel de depositie druk tot 4,0 mTorr. Terwijl de sluiter gesloten, geleidelijk te verhogende RF-vermogen tot 70 W.
  4. Open de sluiter en sputteren gedurende 15 minuten om een film te verkrijgen met een dikte van 120-150 nm (Figuur 1: Stap A). Groeisnelheid van de folie moet worden afgeleid voor elke machine.

2. Coating met Cell-afstotende Film

  1. Hydrofiliseren de TiO 2 oppervlak door behandeling van het monster met O2 plasma, volgens de instructies van de fabrikant van het plasma reactor. Wij behandelen het monster gedurende 5 minuten bij 200 W met O2 stroom van 100 sccm. Dompel het monster in DDH 2 O en controleer of het oppervlak is superhydrofiel. Droog het oppervlak grondig onder een stroom N2.
  2. Bereid 1 mM octadecyltrichloorsilaan (OTS) door toevoeging van 39,6 ul OTS tot 100 ml tolueen. Dompel het monster in de oplossing gedurende 1 uur bij KT. Voeren deze stap in een N 2 -gevulde handschoen zak (Figuur 1: Stap B).
  3. Om fysisch gesorbeerde moleculen te verwijderen, sonicate het monster in tolueen, aceton, ethanol, en DDH 2 O 5 minuten elk, in die volgorde. Spoel het monster vier maal in vers DDH 2 O en droog het oppervlak onder een stroom N2. De ondergrond moet hydrofoob met een contact hoek van 100-110 ° zijn.

3. Ex-situ Surface Patterning

  1. Werken in een laminaire stroming kap, trek enkele krassen met een diamant kraspen op het oppervlak. De markeringen helpen bij het bijhouden van de verwerkte regio's en ook het brengen van microscopen in beeld. Steriliseer de OTS-beklede TiO 2 door onderdompeling van het monster in 70% ethanol gedurende 5 minuten. Tweemaal Spoel vervolgens het monster in gesteriliseerde DDH 2 O.
  2. Plaats het monster in een 35-mm schaal en voeg 2 ml van de PC12 groeimedium (zie stap 4.2). Incubeer gedurende 3 uur in een CO2-incubator (37 ° C). Deze procedure moet laten serumalbuminen absorberen op het oppervlak. Geadsorbeerd albuminen remmen daaropvolgende adsorptie van andere proteins en cellen (Figuur 1: Stap C).
  3. Tijdens het wachten, het opzetten van de omgekeerde fluorescentie microscoop.
    1. Zet de booglamp, plaatst u de UV-filter kubus, en stel het objectief naar 20X.
    2. Meet lichtintensiteit I (W cm -2) met UV-intensiteit meter en bereken bestralingstijd t (in seconden) voor een dosis van d (in J cm -2) als: t = d / I.
      Bijvoorbeeld, bestralen met een dosis van 200 J cm -2 behulp van een lichtbron van 600 mW cm -2 is 333 sec bestraling vereist.
    3. Gebruik een micrometer en sluit het velddiafragma om de grootte van het gebied te bestralen, bijvoorbeeld 200 urn.
  4. Na 3 uur incubatie, het medium aangevuld met 200 pl 3,0 mg ml -1 type IV collageen (Col-IV; eindconcentratie 300 ug ml-1).
  5. Breng de 35-mm schotel naar de microscoop podium. Vind de scratch mark, richten de microscoop op het monsteroppervlak en bestralen UV-licht bij een dosis van 200 J cm -2 (Figuur 1: Stap D). Het gebied van UV straling kan worden gewijzigd ofwel door aanpassing van de opening van het velddiafragma of door vervanging van het velddiafragma met een metalen masker van arbitraal geometrie.
  6. Vervang het medium met vers kweekmedium (zonder Col-IV) en plaats het monster opnieuw in de incubator.

4. Cultuur van de Cel

  1. Routine cultuur van PC12 cellen wordt uitgevoerd op een collageen gecoate plastic schaaltje uitgevoerd.
    1. De vacht van een 60-mm weefselkweek schotel met Col-IV, eerst nat het oppervlak met DDH 2 O en zuig alle DDH 2 O.
    2. Bereid 300 ug ml -1 Col-IV door verdunning van de oorspronkelijke oplossing (3 mg ml -1) 10x met DDH 2 O.
    3. Voeg 200 ul van 300 ug ml-1 Col-IV per 60 mm schaal. Laat de oplossing verspreid over het oppervlak.
    4. Droge tHij schotel in een laminaire stroming kap gedurende ongeveer 1 uur.
    5. Tweemaal Spoel het oppervlak met 4 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS). Wanneer deze niet onmiddellijk met de gecoate schaal, spoel de schaal een keer met 4 ml van DDH 2 O. Na het opzuigen van DDH 2 O, slaan de schotel in de incubator. Probeer niet te houden opgeslagen voor meer dan twee weken.
  2. PC12-cellen worden gekweekt in een kweekmedium bestaande uit: Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (laag glucose) + 10% foetaal runderserum + 5% paardenserum + 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Incubeer de cellen in een CO2 incubator (37 ° C, 5% CO 2) en plaats de helft van het medium elke andere dag. Passage cellen voordat ze samenloop.
    1. Zuig het groeimedium en voeg 2 ml PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 runderserumalbumine (BSA) + 10 mM EDTA) voorverwarmd tot 37 ° C. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. Tik voorzichtig de schotel naar alle ce loslls.
    2. Verzamel cellen in een 15 ml conische buis. Spoel de schaal met 3 ml verse D-PBS, voorverwarmd tot 37 ° C.
    3. Centrifugeer de buis bij 150 x g gedurende 4 min.
    4. Zuig het supernatant en voeg 1 ml van het kweekmedium.
    5. Voor routine cultuur, split de cellen 1: 3 tot 1: 5.
  3. Aan cellen plaat op de UV-gemodificeerde OTS / TiO 2 monster, tellen celdichtheid en voeg 3,0 x 10 5 cellen in een 35-mm schaal (Figuur 1: Stap E). Incubeer de schotel in de bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 1-2 dagen. Zowel naïef en zenuwgroeifactor (NGF) -differentiated PC12-cellen kunnen worden toegepast voor de patroonvorming experimenten. Voor NGF differentiatie, 100 ng ml -1 7S-NGF voor het uitplaten van de cellen op het monster wordt toegevoegd aan het groeimedium enkele dagen. NGF-differentiatie lijkt de adhesibility van de PC12-cellen te verhogen en vergemakkelijkt de manipulatie, met name bij de in-situ patroonvorming experiments.

5. In-Situ Surface Patterning

  1. Na 1-2 dagen van cultuur op de ex-situ gemodificeerd oppervlak, bevestigen dat de cellen hechten en alleen groeien op de UV-bestraalde gebied. Stel de microscoop, zoals beschreven in stap 3.4.
  2. Breng het monster om een nieuwe 35-mm weefselkweek schaaltje met het groeimedium, 100 ng ml -1 NGF (bij gebruik van NGF-gedifferentieerde cellen) en Col-IV 100 ug ml-1.
  3. Plaats de schotel op de microscoop podium. Zoek de juiste positie en bestralen UV licht met een dosis van 200 J cm -2 (Figuur 1: Stap F, G). De nieuw gecreëerde permissieve gebied wordt aangegeven met een sterretje in Figuur 1: Stap G.
  4. Proberen om de verwerking van een enkel monster binnen 30 minuten te voltooien. Na bestraling overdracht van de sample in het medium zonder Col-IV.
  5. Wees uiterst voorzichtig bij het uitvoeren van de schotel met cultured cellen en overbrengen van het monster van schotel naar schotel te voorkomen losmaken van de gevormde cellen.

figure-protocol-1
Figuur 1. Schematische weergave van het totale proces. Zie de tekst voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 2A toont een dwarsdoorsnede scanning electron microscopy (SEM) beeld van sputteren afgezette TiO 2 film. Uit de waarnemingen, dikte van de film werd geschat op ongeveer 150 nm. Opvallend hierbij is de vlakheid van de afgezette TiO 2 film. Verdere analyse van atomaire kracht microscopie (AFM) bleek dat de wortel-gemiddelde-kwadraat (RMS) ruwheid van het oppervlak was 0,2 nm (figuur 2B).

Wanneer de TiO 2 oppervlak gemodi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In onze huidige protocol, werd TiO 2 film gevormd door RF-magnetron sputteren. Wij zijn voorstander van deze methode van afzetting, omdat het ons toelaat om reproduceerbaar te bereiden een fotokatalytische TiO 2 film met een sub-nm ruwheid. Hoewel sputterdepositie processen zijn bekend om materialen wetenschappers en elektronische ingenieurs, kan het niet zijn vrij toegankelijk voor biologen. In dat geval zou roterend bedekken TiO 2 film een alternatieve keuze 23 zijn. In deze...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de heer Kotaro Okubo voor de vriendelijke assistentie met SEM-beelden. Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), en door onderzoeksbeurzen van de Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation en de Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glazen dekglasWarner InstrumentsCS-15R1515 mm diameter, #1.5 dikte
Diamant graveerstiftOgura Jewel IndustryD-Point Pen
RF sputtering systeemANELVASPC350
TiO2 sputtering doelKojundo Chemical LabTitanium (IV) oxide, doelRuiheid, 99,9%
Plasma reactorYamatoPR301
n-octadecyltrichlorosilaan (OTS)Aldrich104817
TolueenWako204-01866
Weefselkweekbakje (35 mm)Greiner627160
Weefselkweekbakje (60 mm)BD Falcon353002
Type-IV collageenNitta GelatinCellmatrix Type IV
D-PBSGibco14190-144
Dulbecco's aangepast Eagle's medium (DMEM)Gibco11885-084
Foetaal runderserumGibco12483-020Voor gebruik warmte-inactiveren en door een 0,22 μm filter halen
Paarden serumGibco26050-088Voor gebruik door een 0,22 μm filter halen
Penicilline-streptomycine (100x)Nacalai tesque26253-84
7S zenuwgroeifactor (NGF)Alomone LabsN-130
Bovien serum albumine (BSA)SigmaA2153
EDTADojindoN001Voorraad oplossing in 0,5 M
TiO2 nanodeeltjeTaycaTKD-701
```

Referenties

  1. Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929(2014).
  2. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
  3. Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
  4. Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01(2011).
  5. Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
  6. Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
  7. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).
  8. Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164(2011).
  9. Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
  10. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
  11. Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514(2010).
  12. Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
  13. Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
  14. Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012(2014).
  15. Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
  16. Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
  17. Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
  18. Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021(2014).
  19. Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
  20. Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
  21. Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
  22. Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
  23. Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
  24. Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

OppervlaktemodificatieCeladhesieUV bestralingCollageenpatroneringPC12 cellenSputtercoatingOctadecyltrichloorsilaanBlokkeren met serumalbumineFluorescentiemicroscopie
Photopatterning eiwitten en cellen in een waterige omgeving met behulp van TiO
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.