Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Samenvatting

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Samenvatting

Naast parenchymale hepatocyten, de lever bestaat uit niet-parenchymcellen (NPC), te weten Kupffer cellen (KC), lever endotheelcellen (LEC) en leverstellaatcellen (HSC). Tweedimensionale (2D) kweek van primaire humane hepatocyten (PHH) wordt nog steeds beschouwd als de "gouden standaard" voor in vitro testen van geneesmiddelmetabolisme en hepatotoxiciteit. Het is bekend dat de 2D-monocultuur van PHH lijdt aan dedifferentiatie en functieverlies. Recent werd aangetoond dat hepatische NPC een centrale rol in de lever (patho-) fysiologie en het behoud van PHH functies spelen. Lopend onderzoek houdt de reconstructie van in vivo weefselarchitectuur van 3D- en co-kweekmodellen de beperkingen van 2D monoculturen te overwinnen. Eerder gepubliceerde we een methode om humane levercellen isoleren en onderzocht de geschiktheid van deze cellen voor het gebruik in celkweken in Experimental Biology and Medicine ^1. Op basis van de brede belangstelling voor deze technique het doel van dit artikel is een meer gedetailleerd protocol voor de levercel isolatiewerkwijze zoals een video, die een gemakkelijke weergave van deze techniek zal verschaffen.

Menselijke lever cellen werden uit menselijk leverweefsel monsters van chirurgische ingrepen geïsoleerd door een twee-staps EGTA / collagenase P perfusie techniek. PHH werden gescheiden van de NPC door een eerste centrifugatie bij 50 x g. Dichtheidsgradiënt centrifugatie stappen werden gebruikt voor het verwijderen van dode cellen. Individuele levercel populaties werden geïsoleerd van de verrijkte NPC fractie met behulp van specifieke cel eigenschappen en celsortering procedures. Naast het PHH isolatie waren we in staat om te scheiden KC, LEC en HSC voor verdere teelt.

Tezamen de gepresenteerde protocol maakt de isolatie van PHH en NPC in hoge kwaliteit en kwantiteit van één donor weefselmonster. De toegang tot het gezuiverde levercel populaties kan het ontstaan ​​van in vivo als menselijke li toestaanver modellen.

Inleiding

Menselijk leverweefsel is zeer complex en bestaat uit twee verschillende mobiele eenheden, parenchymcellen en niet-parenchymale cellen (NPC). Parenchymale levercellen bevatten hepatocyten en cholangiocyten. Hepatocyten vertegenwoordigen 60 tot 70% van de totale levercellen en zijn goed voor het grootste deel van de metabolische leverfuncties, bijvoorbeeld galzuur en een aanvulling factor synthese, de biologische omzetting en de energiestofwisseling ^2,3.

De kleinere NPC fractie vormt 30-40% van de levercellen. NPC onder andere cel populaties, namelijk Kupffer cellen (KC), lever endotheelcellen (LEC) en de leverstellaatcellen (HSC). Deze heterogene celfractie speelt een centrale rol in fysiologische processen in de lever. Bovendien NPC deelnemen bij het ​​veroorzaken acute leverbeschadiging, bijvoorbeeld drugs geïnduceerde leverschade (DILI) en in chronische lever verwondingen, zoals cirrose ^4.

In de afgelopen jaren, human levercellen zijn er meer en meer van essentieel belang in onderzoek en ontwikkeling van de drug het testen, de ontwikkeling van geneesmiddelen en de identificatie van nieuwe biochemische pathways in leverziekten geworden. Voor in vitro testen PHH monoculturen worden nog steeds beschouwd als de "gouden standaard" ^5. De belangrijkste beperking van de huidige homotypische levermodellen is dedifferentiatie en verlies van functie van de levercellen binnen een paar dagen ^4. De oprichting van 3-dimensionale (3D) kweektechnieken is gebleken dat deze beperkingen kunnen worden gecompenseerd ^4,6. Maar zelfs de moderne 3D-cultuur technieken zijn niet in staat om al hepatotoxische werkingsmechanismen ⁷ weer te geven. Ontbrekende NPC populaties in de bestaande in vitro modellen besproken als een mogelijke reden voor deze discrepantie met de in vivo situatie. Aangetoond is dat de communicatie cel-cel tussen de verschillende celpopulaties lever speelt een centrale rol in fysiologische homeostase, maar ook in pathophysiologic ⁸ verwerkt. Daarom is de wetenschappelijke aandacht richt zich meer en meer op NPC en hun cel-cel interacties. Het doelgericht gebruik in co-cultuur tissue engineered systemen zou een oplossing voor de grote vraag in vitro levermodellen ^8,9 die zo dicht mogelijk bij de in vivo situatie mogelijke zijn.

Momenteel is de belangrijkste uitdaging is de ontwikkeling van een gestandaardiseerde menselijke lever co-cultuur model, dat duidelijk omschreven delen van PHH en NPC bevat. Bijgevolg worden isolatietechnieken voor de heterogene levercellen nodig en die moeten worden geoptimaliseerd om zuivere celpopulaties krijgen. Hoewel gestandaardiseerde protocollen voor isolatie PHH bestaan ^​​10, de gestandaardiseerde isolatie van humane NPC nog in ontwikkeling. Meeste gepubliceerde NPC isolatie protocollen gebaseerd op experimenten met niet-menselijke cellen ^11,12. Slechts een paar publicaties beschrijven de isolatie proces van menselijke NPC en de meeste hebben alleen betrekking opwerkwijzen voor de isolatie van een enkele celtype ^11-16. De belangrijkste celeigenschappen die zijn aangewend voor celscheiding zijn grootte, dichtheid, hechtingsgedrag, en de expressie van oppervlakte-eiwitten. Op basis van deze kenmerken hebben we een vereenvoudigde protocol te isoleren PHH, KC, LEC en HSC, die voorheen in Experimental Biology and Medicine ¹ werd gepubliceerd. Vanwege de grote belangstelling voor deze techniek was het doel van dit artikel om een ​​gedetailleerd protocol voor de levercel isolatiewerkwijze zoals een video, waardoor het reproduceren van de techniek makkelijker te verschaffen. Het protocol omvat ook werkwijzen voor kwaliteitscontrole evaluatie van opbrengst en levensvatbaarheid en voor identificatie en zuiverheid beoordelingsproces met specifieke immunokleuring.

Protocol

Let op: Alle cellen werden geïsoleerd uit resected non-tumor menselijke lever weefsel, dat bleef na gedeeltelijke leverresectie met primaire of secundaire levertumoren. Geïnformeerde toestemming van de patiënten werd verkregen volgens de ethische richtlijnen van de Charité - Universitätsmedizin Berlijn.

1. Voorbereiding van de materialen en oplossingen

1. Steriliseren alle instrumenten en materialen vooraf bacteriële besmetting tijdens de isolatie te vermijden.
2. Bereid de oplossingen die voor de perfusie van de lever weefsel monster, de isolatiewerkwijze van hepatocyten en niet-parenchymale levercellen en de kweek van primaire humane levercellen volgens de tabellen 1 en 2, met uitzondering van spijsvertering-oplossing die vers is bereid voorafgaand aan gebruik. Alle oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C en het wordt aanbevolen om deze binnen 4 weken na bereiding gebruikt.
3. Steriliserenalle oplossingen met behulp van een 0,22 pm fles top filter.

2. Voorbereiding van de perfusie Equipment

1. Opgezet uitrusting voor perfusie en digestie van het leverweefsel monster zoals weergegeven in figuur 1A.
2. Stel het waterbad temperatuur tot 39 ° C om een ​​optimale collagenase P activiteit mogelijk tijdens de perfusie en de spijsvertering.

3. Perfusie en de spijsvertering van de lever weefselmonster (1,5 uur)

1. Selecteer een weefselmonster met een intacte Glisson de capsule uit de uitgesneden leverweefsel. Bij het snijden van het weefselmonster, probeer dan een klein snijvlak met een goed zichtbare schepen te verkrijgen. Vermijd warme ischemie tijden door het vervoer en de behandeling van de lever weefselmonster op ijs tot perfusie.
2. Neem het weefselgewicht onder steriele omstandigheden en plaats het leverweefsel monster in een petrischaal in de laminaire luchtstroom. Reinig het oppervlak van het weefselmonster met een steriel kompres uit remaining bloed en spoel de canule set met behulp van 1x perfusie-oplossing Ik ervoor te zorgen dat alle canule waren permeabel.
3. Gebruik weefsel lijm op de olijven van de canules in enkele grotere bloedvaten te repareren. Afhankelijk van de grootte van de lever weefsel monster en het aantal vaartuigen op het oppervlak, gebruik van een canule set met 3-8 canules. Test de perfusie en te controleren op lekkages. Sluit alle bloedvaten, die duidelijke 1x perfusie-oplossing I, met weefsel lijm lekken.
4. Plaats de canule leverweefsel monster in een Büchner trechter zijn geperforeerde filterschijf (Figuur 1A).
5. Stel het debiet van de peristaltische pomp van 7,5 ml / min en 14,6 ml / min, afhankelijk van het aantal canules gebruikt en de weerstand van het leverweefsel. Stel het debiet telkens om ervoor te zorgen dat er een stroom maar langzaam perfusie. Perfuseren het weefsel totdat het bloed wordt uitgespoeld, maar ten minste 20 min. Let op het weefsel helderder worden in gebieden met een goede perfusiop.
   Opmerking: In sommige gevallen kan het nodig zijn één van de canules met plastic klem of klemmen aan de binnendruk van een gebied te vergroten door zacht drukken met een spatel tegen de lever capsule, de doorbloeding te optimaliseren. Een volledige kleurverandering tot een lichtgele tot lichtbruin kleur geeft een goede perfusie.
6. Verander de perfusievloeistof om de spijsvertering-oplossing bevattende collagenase P (tabel 1).
7. De volgorde van de installatie (Figuur 1A) voor de vertering stap. Speelt daarom een kringloop van spijsvertering-oplossing volgens figuur 1B tot 15 minuten.
   Opmerking: Het is van cruciaal belang voor de perfusie onmiddellijk te stoppen wanneer de lever weefselmonster voldoende verteerd. Een goede vertering kan worden waargenomen, wanneer het weefsel komt geen elasticiteit bepaald door handhaving capsule vervormingen, wanneer deze wordt ingedrukt met een spatel.

4. Isolatie van hepatocyten (1 uur)

1. Turn de peristaltische pomp uit en zet het leverweefsel monster in een glazen schaal. Spoel de buitenkant van het weefselmonster met ijskoude stop-oplossing (Tabel 1). Verwijder de canules uit de lever weefselmonster. Gebruik een scalpel om de lever weefselmonster geopend door incisie in het midden van het gebied waar de canules werden vastgemaakt. Houd zorg dat de Glisson's capsule blijft intact.
2. Spoel de binnenkant van het weefselmonster en het gehele weefselmonster met ijskoude stop-oplossing. Schud het weefsel voorzichtig aan de cellen uit het weefsel los te maken.
3. Verzamel de celsuspensie en filteren door middel van een blik trechter (plastic trechter gevoerd met gaas kompres) in 50 ml plastic buizen. Voeg meer Stop-oplossing voor de lever weefselmonster tot een eindvolume van 500 ml wordt verbruikt.
4. Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g, 5 min, 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof later niet-parenchymale cel isolatie. Was de celpellet met PBS (Figuur 2A).
5. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw bij 50 xg, 5 min, 4 ° C. Verzamel de supernatant en resuspendeer de pellet in Hepatocyte Incubation medium (tabel 2, figuur 2B).
6. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid van de verkregen celsuspensie met behulp van trypan blauw kleuring. Tel het aantal levende en dode cellen in een Neubauer telkamer. Bereken het aantal cellen, levensvatbaarheid en opbrengst van PHH via de formule.
   
   opbrengst (getelde cellen) = geteld cellen x verdunningsfactor x volume van de cel suspensie (ml) x 10.000
   
   opbrengst (hepatocyten / (g leverweefsel monster)) = (opbrengst (hepatocyten / (ml media)) x Volume celsuspensie (ml)) / (gewicht van leverweefsel monster (g))
   
   levensvatbaarheid (%) = 100% x (aantal levende cellen) / (totaal aantal cellen)

5. Zuivering van hepatocyten (1 uur)

Opmerking: Deze zuiveringsstap wordt aanbevolen, wanneer de levensvatbaarheidlager dan 70%.

1. Voer alle stappen op het ijs. Bereid een 25% dichtheidsgradiënt door 5 ml dichtheidsgradiënt oplossing en 15 ml PBS dichtheidsgradiënt centrifugatie.
2. Zet maximaal 50 miljoen cellen in totaal uit de hepatocyten rijke celsuspensie voorzichtig en langzaam bovenop de 25% dichtheidsgradiënt laag zodat een duidelijke scheiding van de beide lagen wordt verkregen (Figuur 2C). Zet de buizen voorzichtig in de centrifuge en centrifugeer bij 1250 xg, 20 min, 4 ° C zonder rem (figuur 2D).
3. Zuig de resterende celsuspensie en de dode cellen in de interfase. Afhankelijk van het vetgehalte men zou ook zuig het dichtheidsgradiënt oplossing.
   Opmerking: PHH met een laag vetgehalte vormen een dichte pellet en de dichtheidsgradiënt kan volledig worden opgezogen. PHH met een hoog lipidegehalte vormen een diffuse pellet en veel van levensvatbare cellen in de dichtheidsgradiënt oplossing boven de pellet overblijven.
4. Resuspendeer de hepatocyte pellets met PBS en centrifugeer opnieuw bij 50 xg, 5 min, 4 ° C. de pellets zwembad, opnieuw wassen met PBS en resuspendeer gezuiverd PHH in Hepatocyte Incubation medium. Voer cel tellen zoals beschreven in stap 4.6.

6. Teelt van hepatocyten

1. Bereid de celkweek gerechten voor het zaaien van PHH door ze te coaten met een extracellulaire matrix, bijvoorbeeld rattenstaart collageen (collageen type I). Bereid de rattenstaart collageen volgens de door Rajan et al protocol. ¹⁷
2. Verdun de rattenstaart collageen voorraad oplossing 1: 200 in PBS. Transfer 100 ul / ^cm2 rattenstaart collageen oplossing in de cultuur gerechten, zorg dat het hele oppervlak is bedekt. Incubeer de celkweek kunststoffen voor 20 min bij kamertemperatuur. Zuig de resterende rattenstaart collageen oplossing.
3. Seed 15 x 10 ⁴ levercellen / ^cm2 in Hepatocyte incubatiemedium over cultuur disheS gecoat met rattenstaart collageen. Cultiveren van de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende ten minste 4 uur. Na 4 uur de hepatocyten gehecht en het medium kan worden veranderd.
4. Voeren onderzoeken afhankelijk van de experimentele opstelling. Een cultuur van 48 uur is aanbevolen om de cellen te herstellen van de isolatiewerkwijze.

7. Isolatie van niet-parenchymale levercellen (1,5-2 uur)

1. Centrifugeer de verzamelde supernatant (stap 4,5 en 4,6) bij 72 xg, 5 min, 4 ° C om de resterende erythrocyten en hepatocyten elimineren. Verzamel de supernatanten en centrifugeer ze twee keer twee celpellets kwamen: 300 xg, 5 min, 4 ° C voor de sedimentatie van HSC, LEC deels KC en 650 x g, 7 min, 4 ° C gedurende sedimentatie van de resterende KC.
2. Pool zowel pellets en resuspendeer ze in HBSS. Bereid een 25% en 50% dichtheidsgradiënten door mengen dichtheidsgradiënt oplossing en PBS dichtheidsgradiënt CENTRIFugation (25% dichtheidsgradiënt oplossing: 5 ml dichtheidsgradiënt oplossing en 15 ml PBS, 50% dichtheidsgradiënt oplossing: 10 ml dichtheidsgradiënt oplossing en 10 ml PBS, zie figuur 2). Plaats de 25% dichtheidsgradiënt oplossing voorzichtig bovenop de 50% dichtheidsgradiënt oplossing laag.
3. Zet de NPC suspensie langzaam en voorzichtig bovenop de 25% dichtheidsgradiënt oplossing laag op een manier die een duidelijke scheiding van de beide lagen wordt verkregen.
4. Centrifugeer de celsuspensie op de dichtheidsgradiënt bij 1800 x g, 20 min, 4 ° C zonder rem (figuur 2,2).
5. Aspireren dode cellen en celresten uit de bovenste laag. De NPC liggen in de interfase tussen 25% en 50% dichtheidsgradiënt laag (figuur 2). Verzamel NPC, was ze met HBSS en centrifugeer de celsuspensie het toepassen van de hierboven beschreven dual centrifugeren (stap 7.2.).

8. Scheiding van Kupffer cellen (AdherenceScheidingsstap) (1 uur)

1. Voer een celgetal van de KC in de NPC fractie zoals beschreven in stap 4.6. (Voor de verschijning van KC in suspensie zie figuur 3B). Centrifugeer de NPC fractie de bovenbeschreven tweevoudige centrifugatie (stap 7,2) en resuspendeer de NPC in Kupffer cel enten medium (tabel 2).
2. Het zaad van de KC-houdende fractie op plastic celkweek schepen bij een dichtheid van 5 x 10 ⁵ KC / ^cm2. Incubeer de KC kweken gedurende 20 min in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, _5% CO2. Primaire KC zich op celcultuur plastic binnen een korte tijd (Figuur 2.3).
3. Verzamel de supernatant dat niet gehandeld NPC, voornamelijk bestaande uit LEC en HSC. de supernatanten voor latere scheiding van LEC Pool (zie paragraaf 9) en HSC (zie paragraaf 10). Was de hechtende KC met HBSS en te kweken in Kupffer celkweekmedium (Tabel 2) bij 37 ° C, 5% CO₂ in een bevochtigde incubator.

9. Scheiding van endotheelcellen (1,5 uur)

1. Centrifugeer de verzamelde supernatant (stap 8,5.) Bij 300 xg, 5 min, 4 ° C. Was de pellet met PBS. Na centrifugatie bij 300 xg, 5 min, 4 ° C resuspendeer de cellen in stellaatcel / endotheelcellen scheidingsmedium en voer een celgetal van alle resterende cellen zoals beschreven in stap 4.6.
2. Resuspendeer 1 x 10 ⁷ miljoen cellen in 1 ml stellaatcel / endotheelcellen scheidingsmedium, voeg 20 pl blokkeeroplossing van de MACS-KIT en 20 pl van de CD31 microparels voor immunokleuring en incubeer de resulterende suspensie gedurende 15 minuten bij 4 ° C temperatuur (figuur 2,4).
3. LEC gescheiden van HSC zoals beschreven in het merk gebruikt protocol voor de magnetisch geactiveerde celsortering systeem MACS (figuur 2,5). Elueer magnetisch behield CD31-positieve LEC en op te schorten ze in Stellaatcellen Cell / endotheelcellen kweekmedium (tabel 2).
4. Voer cel tellen voor LEC zoals beschreven in stap 4.6. Zaad LEC in een dichtheid van 1,25 x 10 ⁵ cellen / ^cm2 in celkweek schepen gecoat met rattenstaart collageen (zie stap 6.1). Cultiveren van de cellen bij 37 ° C, 5% _CO2 in een bevochtigde incubator.

10. Scheiding van stellaatcellen (0,5 uur)

1. Ongelabelde HSC passeren de scheidingskolom in de MACS procedure. Verzamel de HSC-fractie (zie stap 9.5, Figuur 2.5). Voer cel tellen zoals beschreven in stap 4.6.
2. Zaad HSC met een dichtheid van 5 x 10 ⁴ cellen / ^cm2 in cel kweekvaten gecoat met rattenstaart collageen (zie stap 6,1) in stellaatcel / endotheelcellen cultuurmedium (Tabel 2) en te kweken bij 37 ° C, 5% _CO2 in een bevochtigde incubator.

Tabel 1: perfusie en isolatieoplossing.

Tabel 2: Cultuur en isolatie media.

Resultaten

De scheiding in een parenchymale en niet-parenchymale fractie via dichtheidsgradiënt centrifugering zoals een reinigingsprocedure combinatie met het gebruik van hechtingseigenschappen en MACS leidt tot succesvolle PHH en NPC isolatie. PHH en NPC kan worden geïsoleerd in hoge kwaliteit en kwantiteit. Figuur 1 toont de representatieve instellingen van het apparaat voor de lever perfusie en de spijsvertering. 10% FCS werd aan de collagenase P met Perfusion toegevoegd - oplo...

Discussie

De gepubliceerde protocol beschrijft een techniek om pure PHH en NPC, namelijk KC, HSC en LEC isoleren, tegelijkertijd in hoge kwaliteit en zuiverheid van hetzelfde monster van het menselijk leverweefsel. De meerderheid van de publicaties over levercel isolaties bestrijkt slechts één van die celpopulaties ^18-20 en isolatie procedures uitgevoerd met menselijk weefsel zijn zeldzaam (beoordeeld door Damm et al.) ^21. Aanpassing van gelegd met dierlijk weefsel (bijvoorbeeld rat lever) ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Algemein Materiaal
PIPETBOY	Eppendorf
pipetten	Eppendorf
microscoop	Carl Zeiss
microscoop	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urinbeker	Sarstedt	2041101
perfusor spuit 50 ml	B.Braun	12F0482022
fles stopfilter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml polypropyleen conische buis	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml polypropyleen conische buis	BD Biosciences	352096
weefselkweek plaat	BD Biosciences	533047	24 well
serologische pipetten	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipet tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1.000 µl
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isolatieapparatuur
waterbad	Lauda
peristaltische pomp	Carl Roth
circulatiethermostaat	Lauda
pH meter	Schott
fijne schalen	Sartorius
stand
Büchner trechter	Haldenwanger
plastic trechter
siliconen buis
kanules met olijfpunten
glasbakje
tang
scalpel	Feather	12068760
Neubauer telkamer	Optic Labor
cellifter	Costar
Chirurgische drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
kompres	Fuhrmann	40013331
steriele chirurgische handschoenen	Gammex PF	1203441104
weefsel lijm	B. Braun	1050052
glas fles	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Scheidingsoplossing	Biochrom	L6145	Dichtheid 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	zonder Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumine	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1.064.041.000
KCl	Merck	49.361.000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mediaapparatuur
DMEM	PAA	E15-005	Laag Glucose (1 g/L) (zonder L-Glutamine)
HEPES Bufferoplossing 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicilline/streptomycine	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	zonder L-Glutamine
Natrium Pyruvaat	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blauw Oplossing	Sigma-Aldrich	T8154	0,4%
William’s E	GIBCO	32551-020
met GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Humaan-Insuline	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteïne	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Foetaal kalfs serum (FCS)	PAA	A15-101
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Apparatuur voor Immunokleuringen
CD 68	R&D Systems, USA		monoklonaal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyklonaal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoklonaal
Vimentin	Santa Cruz		monoklonaal
GFAP	Sigma Aldrich		monoklonaal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Geit anti-Muis IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Geit anti-konijn IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumine (