Murine linker ventriculaire papillaire spier kan worden gebruikt voor cardiale contractiliteit in vitro onderzoeken. Dit artikel beschrijft in detail de isolatie en experimentele protocollen cardiale contractiele kenmerken te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Samentrekbaarheid Metingen op Geïsoleerde papillairspieren voor onderzoek naar Cardiac inotropie in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Papillaire spier geïsoleerd uit volwassen muisharten kan worden gebruikt voor cardiale contractiliteit te bestuderen in verschillende fysiologische / pathologische aandoeningen. De contractiele eigenschappen kunnen worden geëvalueerd onafhankelijk van externe invloeden zoals vasculaire tonus en neurohormonale toestand. Het schildert een wetenschappelijke benadering tussen enkele cel metingen met geïsoleerde hartspiercellen en in vivo studies zoals echocardiografie. Aldus papillaire spier preparaten dienen als een uitstekend model voor hartfysiologie / pathofysiologie bestuderen en kunnen worden gebruikt voor onderzoeken zoals modulatie door farmacologische middelen of verkenning van transgene diermodellen. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren van het murine linker anterior papillaire spier cardiale contractiliteit in een orgaanbad setup onderzoeken. In tegenstelling tot spier strip preparaat geïsoleerd van de ventriculaire wand, kan de papillaire spier in toto worden bereid zonder de spier Tissue ernstig. Het orgel bad installatie bestaat uit verschillende temperatuur-gecontroleerde, vergast en-elektrode uitgerust orgel bad kamers. De geïsoleerde papillairspier is vastgesteld in het orgel bad kamer en elektrisch gestimuleerd. De opgeroepen twitch kracht wordt opgenomen met een druk transducer en parameters zoals trillen kracht amplitude en twitch kinetiek geanalyseerd. Verschillende experimentele protocollen kunnen worden uitgevoerd om de calcium- en frequentieafhankelijke contractiliteit en dosis-respons curven van contractiele middelen zoals catecholaminen en andere geneesmiddelen te onderzoeken. Daarnaast kunnen pathologische aandoeningen zoals acute ischemie worden gesimuleerd.
Inleiding
Het onderzoek naar eiwitten zoals ionkanalen verwijzende hun rol cardiale contractiliteit essentieel verschillende pathomechanismen ontdekken en nieuwe therapeutische strategie te bepalen om hartziekten zoals ischemie en hartfalen.
Contractiele functie van zoogdier hartspiercellen bekend worden gemoduleerd door verschillende ionkanalen, transporters en andere eiwitten. Actiepotentiaal opgeroepen activering van spanningsafhankelijke sarcolemmale L-type Ca 2+ kanalen leidt tot Ca 2+ influx van extracellulaire ruimte en vervolgens Ca 2+ geïnduceerde Ca 2+ vrijkomen (CICR) 1, die cellulaire 2 krimp triggers. Ca 2+ -signaling een centrale rol in de cardiale contractiliteit en aanpassing speelt fysiologische of pathologische stress. Catecholamines activeren cardiale β-adrenerge receptoren en stimuleren zo adenylylcyclase (AC), die cAMP synthetiseert. Wordt geactiveerd, Protein kinase A (PKA) fosforyleert verschillende intracellulaire en membraan-geassocieerde eiwitten zoals L-type Ca 2+ kanalen, fosfolamban en ryanodine receptoren resulteert in een wijziging van Ca 2+ transiënten en hartcontractiliteit 1,3,4. cAMP wordt afgebroken door fosfodiesterase (PDE). Activering van Gs-gekoppelde uitzondering β-adrenoceptoren receptoren leidt tot accumulatie van cAMP.
De techniek van contractiliteit meten in geïsoleerde ventriculaire spier stroken gevestigde voor groter zoogdiersoorten 5-8. Op basis van de mogelijkheid van gen targeting in muizen is het belangrijk om methoden vast te murine hartfysiologie analyseren. Echter, de bestaande gegevens over de fysiologische eigenschappen van geïsoleerde spier voorbereidingen in muizen verschillen afhankelijk van experimentele omstandigheden 9-12.
De beschreven werkwijze wordt gebruikt om cardiale contractiliteit van de linker ventrikel papillaire spier pre analyserenpreparaten in vitro. Onderzoek van cardiale contractiliteit wordt uitgevoerd in afwezigheid van invloeden wijzigen cardiale contractiliteit in vivo, zoals bloeddruk, neurohumorale stimulatie en fysieke of metabolische stress. Het kloppen tarief van de aanbestedende spier voorbereiding kan rigoureus worden gedefinieerd en willekeurig veranderd. Twitch kracht kan worden geanalyseerd in het kader van specifieke stimuli zoals calciumconcentratie, kloppen frequentie of temperatuur. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om verschillende signaalweg componenten onderzoeken en hartfunctie van genetisch gemodificeerde muismodellen vergelijken door regeling genoemde proefomstandigheden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: De basisstappen van de isolatieprocedure worden weergegeven in figuur 1 Alle stappen worden in detail beschreven in het volgende protocol.. Papillairspier isolatie, montage in orgaanbad kamer, verwerving en analyse wordt uitgevoerd in een opeenvolgende en verplichte termijn.
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake de bescherming van dieren en werden goedgekeurd door de Ethische Review Board van de Universiteit van Heidelberg.
1. Bereiding van Instrumentation
- Voor samentrekbaarheid metingen gebruik een multichambered orgel bad setup. Componenten van een ex vivo contractiliteit orgaanbad opstelling getoond in figuur 2.
OPMERKING: Om de hoeveelheid tijd tussen de voorbereiding van de papillairspier en het begin van de experimentele protocol, het opzetten van apparatuur te minimaliseren en voorafgaand buffers te bereiden op het verzamelen van experimentele tissue.This provides de grootste hoeveelheid tijd die het weefsel levensvatbaar blijft om experimenten uit te voeren. - Opstarten computer en data-acquisitie apparatuur. Zet orgel bad warmte (ingesteld op 32 ° C) en laat eenheden vooraf ingestelde temperatuur.
- Bereid de acquisitie apparatuur. Start de opname data zoals vermeld in de software handleiding.
- Controleer en gedrag kalibratie (indien nodig) op elk kanaal en nul alle kanalen aan het elektrische signaal uit de respectievelijke krachtopnemer (die bij dat kanaal) toegevoerd standaardiseren op een door een gecertificeerde gewicht geleverd 2 g kracht.
- Zet gastoevoer (95% O2 / 5% CO 2) tot orgaanbad kamers. Continu gas alle kamers tijdens de gehele protocol metingen.
2. Voorbereiding van Buffers en Fysiologische Solutions
- Bereid een Krebs-Henseleit bufferoplossing met eindconcentraties van 119 mM NaCl bereiken; 25 mM NaHCO 3; 4,6 mM KCl; 11MM glucose; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl2; 1,64 mM MgSO 4; 1,18 mM KH 2PO 4 en pH op 7,4 (zie tabel 1 Fysiologische oplossing).
- Maak afzonderlijke Krebs-Henseleit bufferoplossing gebruikt tijdens de isolatie zoals beschreven in stap 2.1 met extra 30 mM 2,3-butaandion monoxime (BDM) en 50 IE heparine / ml. Koel oplossing tot 4 ° C (zie Tabel 1 Bereiding oplossing). Voor ischemie simulatie bereiden ischemie-oplossing zoals beschreven in Tabel 1.
- Voor het protocol van de Ca 2 + - afhankelijke contractiliteit, voeg Ca 2+ naar de Krebs-Henseleit bufferoplossing om de gevraagde uiteindelijke concentratie.
OPMERKING: bereiden deze oplossingen direct voor het gebruik ervan en Gass met carbogen om neerslaan van Calciumcarbonaat voorkomen. Voorverwarmen oplossing tot 32 ° C voor gebruik.
3. Voorbereiding van de Gassing Tube en Dissection Dish gebruikt tijdens de Papillaire Excision Procedure
- Sluit een zachte gaszingen buis (uitwendige diameter van 2-4 mm) op de gasaansluiting (100% zuurstof, carbogen alternatief) met deskundig werken.
- Maak een gesloten ring van de vergassing buisfitting in de dissectie schotel. Prik de vergassing buis meerdere malen dat een continu borrelen is verzekerd. Deze vergassing buis kan meerdere keren gebruikt worden.
- Bereid dissectie schotel met een silicoon elastomeer aan de onderkant (0,5 cm dik), zodat de pennen kunnen worden geplakt in. Dit gerecht kan meerdere keren gebruikt worden.
4. Isolatie van Left Anterior papillairspier van Muizen
LET OP: Voordat u begint met de isolatie van de papillairspier, controleren of de gasleidingen vrij zijn van blokkades.
- Bereid orgaanbad opstelling als genoemd in het protocol 1-3 voordat de bereiding van de papillaire spieren. Bereid alle oplossingen op de dag van het experiment.
- Offeren de muis (ongeveer 8-12 weken oud) door cervicale dislocatie according tot expert werken en institutionele richtlijnen.
- Fix het dier in dorsale positie door de vaststelling voorpoten en achterpoten op een dissectie bord, open de thorax lateraal aan beide kanten door het doorsnijden van de ribben met scherpe bot schaar, knip dan het membraan met een dwarse doorsnede. Verwijder het pericardium. Nu het hart en de aorta toegankelijk.
- Fix het hart met stompe tang op het vasculaire truncus dicht bij het hart en snel scheiden het hart met een schaar van de longen en het omliggende weefsel.
- Transfer het kloppende hart van een petrischaal gevuld met gekoelde voorbereiding oplossing vergast met zuurstof (stap 2.2). Laat het hart te kloppen en zacht stimuleren hart contracties via het aanraken van de cardiale apex met een tang.
- Zodra het hart is volledig exsanguinous, overbrengen naar de dissectie schotel gevuld met gekoelde voorbereiding oplossing (stap 2.2) en vergast met O 2. Vanaf deze stap bij het gebruik van een stereomicroscoop.
- Bevestig de heakamertemperatuur met een puntig door het rechter ventrikel zodat het hart wordt vanuit dorsale (rechterventrikel ligt rechts van de bediener).
- Met behulp van microchirurgische schaar scheiden beide atria op de atrioventriculaire niveau cut bindweefsel van de ventrikels en gooi. Voer een snede door de ventriculaire wand van de AV-klep-niveau om de apex van het hart vermijden van mechanische druk.
- Open het ventrikel en bevestig de linker-zijdige vrije wand met een pincet, dus met een blik op zowel de linker ventrikel papillairspieren.
- Iets verder, van ventriculair weefsel lateraal aan weerszijden van de linker anterior papillairspier behoud van een deel van de valvulaire zeil op de papillaire spier preparaat contact komen of strekken de papillaire spier zoveel mogelijk. Ontleden resterende ventriculaire wandweefsel van de papillaire spier.
- Bevestig zijde draden (7/0, metric 0,5) aan beide zijden van de papillaire spier prepreiding, een op de valvulaire zeil en een op de musculaire deel. Bevestig het preparaat in het orgaanbad kamer gevuld met orgaanbad oplossing en begast met carbogeen, de temperatuur 32 ° C wordt aanbevolen.
5. Evenwicht en stimulatie van de papillairspier
- Het stimuleren van de papillairspier voorbereiding met rechthoekige pulsen (duur van 2 ms en stroom van 100 mA) op stimulatie frequentie van 1 Hz onmiddellijk na de fixatie in het orgel bad.
- Zorgen voor een frequente wisseling van het orgel bad oplossing, hetzij door voortdurende verandering of door veelvuldige handmatige verandering (om de 5 min) volgens de opzet van het type orgel bad gebruikt.
- Geleidelijk verhogen van de voorspanning tot maximale twitch kracht bereikt. Maximale twitch kracht wordt bereikt als de verhoging van de voorspanning niet wordt gevolgd door een verdere vergroting van de twitch kracht.
- Na 45-60 min van verevening, start de experimentele protocol.
6. Suggereerde Experimentele protocollen voor contractiliteit Metingen
LET OP: Het experimentele protocol hieronder beschreven omvat standaard manoeuvres om hartcontractiliteit karakteriseren onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. In de representatieve sectie beschrijven we deze protocollen in detail toont ook representatieve resultaten (zie ook tabel 2).
- Registratie en analyse van de experimentele protocollen
- Gebruik voor het opnemen van een geschikte software met voldoende tijdsresolutie (overname tarief ≥ 1 kHz).
- Analyseren parameters waaronder twitch kracht amplitude (hoogte), de tijd om de spanning (TTP) en de helft van de maximale ontspanning tijd (R 50 / TFall, respectievelijk) zoals vermeld in het programma (zoals bijvoorbeeld Grafiek 5.5 van ADInstruments, zie figuur 4) piek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het protocol van dit manuscript voor contractiliteit metingen van geïsoleerde muizen papillairspier voorbereiding is afgestemd op optimale omstandigheden reproduceerbare experimentele resultaten onder fysiologische omstandigheden te bereiken. Om een optimale experimentele omstandigheden bepalen voerden we proefprojecten wisselende orgel bad temperatuur en extracellulaire calciumconcentratie (zie ook 12). Het hier beschreven protocol werd uitgevoerd met een extracellulaire calciumconcentratie van 1,5 mM en een...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit manuscript beschrijven we een methode om de contractiliteit van murine papillairspier onderzoeken in vitro die kan worden gebruikt om verschillende wetenschappelijke vragen hart fysiologie en pathologie in muizen beantwoorden en de analyse van transgene lijnen en de ontdekking van nieuwe farmaceutische benaderingen ondersteunen aan het hart disfuncties te behandelen. We illustreren het gebruik van deze methode om fysiologische, pathologische en farmacologische eigenschappen van de hartspier contractilite...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelling-Prozessen", FR 1638 / 1-2) en door de DZHK (Duitse Centre for Cardiovascular Research, een onderdeel van het Duitse Centres of Health Research , dat is een BMBF (Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek) initiatief).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Natriumchloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Kaliumchloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Natriumpyruvaat | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calciumchloride dihydraat | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesiumsulfaat heptahydraat | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Monobasisch kaliumfosfaat | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butaanedion monoxim | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Gevaarsteken H 302, oplosbaar in DMSO |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Gevaarsteken H 315-H319-H335 |
| Natriumheparine 250.000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Gevaarsteken H 315-H 317-H319- H334-H335 |
Referenties
- Endoh, M. Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers. Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Bers, D., Despa, S. M. Na/K-ATPase—an integral player in the adrenergic fight-or flight response. Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).
- Bers, D. M. Cardiac excitation–contraction coupling. Nature. 415, 198-205 (2002).
- Pieske, B., et al. al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium. Basic Res Cardiol. 92, Suppl 1. 75-86 (1997).
- Corbin, J. Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart. Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).
- Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip. Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).
- Näbauer, M., et al. Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts. Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).
- Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle. J Physiol. 507, 175-184 (1998).
- Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).
- Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type. Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).
- Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice. JMCC. 74, 307-317 (2014).
- Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation. J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).
- Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure. Basic Res Cardiol. 97, Suppl 1. 163-171 (2002).
- Koch-Weser, J., Blinks, J. R. The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility. Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).
- Bocalini, D. S. Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay. Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).
- Juggi, J. S. Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart. J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).
- Lakatta, E. G. Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy. Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).
- Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human. Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).
- Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. The force-interval relationship in human myocardium. J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).
- Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3rd, Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium. JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).
- Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud. Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).
- Lee, J. A., Allen, D. G. Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle. Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
