Een Screenbare In Vivo Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Samenvatting

Het multicellulaire modelorganisme Caenorhabditis elegans is een kleine nematode van ongeveer 1 mm groot in volwassenheid die genetisch en experimenteel hanteerbaar is. Het is economisch en gemakkelijk te kweken en te doseren in vloeibaar medium, waardoor het zeer geschikt is voor screenings met gemiddelde doorvoer. We hebben eerder het gebruik van transgene luciferase-expresserende C. elegans-stammen gevalideerd om een snelle in vivo beoordeling van de ATP-niveaus van de nematode te bieden.^1-3 Hier presenteren we de benodigde materialen en procedure om bioassays uit te voeren met de bioluminescente C. elegans-stammen PE254 of PE255 (of een van hun afgeleide stammen). Het protocol maakt in vivo detectie mogelijk van subletale effecten van geneesmiddelen die mitochondriale toxiciteit kunnen identificeren, evenals voor in vivo detectie van mogelijke gunstige geneesmiddeleffecten. Representatieve resultaten worden gegeven voor de chemicaliën paraquat, rotenone, oxaloacetaat en voor vier firefly luciferase-remmende verbindingen. De methodologie kan worden opgeschaald om een platform te bieden voor het screenen van geneesmiddelenbibliotheken op verbindingen die in staat zijn om mitochondriale functie te moduleren. Preklinische evaluatie van geneesmiddeltoxiciteit wordt vaak uitgevoerd op geïmmortaliseerde kankerachtige menselijke cellijnen die ATP voornamelijk uit glycolyse halen en vaak tolerant zijn voor mitochondriale toxica.^4,5 In tegenstelling tot C. elegans is deze afhankelijk van oxidatieve fosforylering om de ontwikkeling tot volwassenheid te ondersteunen, waardoor een parallel wordt getrokken met de mens en een unieke kans wordt geboden voor de evaluatie van verbindingen in de fysiologische context van een volledig levend multicellulair organisme.

Inleiding

Het algemene doel van deze procedure is de snelle kwantificering van de energiestatus van C. elegans in vivo teneinde dit als een eindpunt in samengestelde screening. De grondgedachte is gebaseerd op de transgene expressie van vuurvlieg luciferase in de nematode C. elegans ^1-3 via het plasmide pSLGCV ⁽¹ https://www.addgene.org/49862). Het luciferase-enzym wordt gefuseerd met het groen fluorescent eiwit GFP en constitutief en alomtegenwoordig tot expressie gebracht in het cytoplasma (de luciferase peroxisoom targeting signaal werd verwijderd). Dit leidt tot lichtemissie wanneer het substraat luciferine exogeen wordt geleverd. Omdat de worm transparant, licht kan worden gemeten in een luminometer als relatieve lichteenheden (RLU). Cellulaire ATP brandstoffen de bioluminescentie reactie en de beschikbaarheid bepaalt de lichtniveaus geproduceerd. Bijgevolg luminometrie biedt convenient betekent het beoordelen van de relatieve ATP niveaus en bij uitbreiding de mitochondriale functie, omdat ATP productie vindt voornamelijk plaats in de mitochondriën. Een koppeling tussen de mitochondriale functie en bioluminescentie niveau is al eerder aangetoond door de silencing van mitochondriale elektronen transportketen genen en daarmee gepaard gaande verminderde lichtopbrengst. ¹

De bioluminescentie stammen gegenereerd werden aangeduid PE254 (feIs4) en PE255 (feIs5) ¹ (zie lijst materialen) en kan onderling uitwisselbaar. ³ een aantal studies deze sensor stammen gebruikt om verslag cellulaire ATP-niveaus in vivo na blootstelling aan verschillende lichaamsvreemde stoffen zoals natriumazide ^1, cadmium ^2, rioolwater slib extract ^3, 5'-fluor-2-deoxyuridine ⁶ en een tabak-specifieke nitrosamine ^7. De stammen zijn ook nuttig om de effecten van blootstelling aan ultraviolette straling monitoren C ^{8 en de effecten van het verstoren van de mitochondriale ademhalingsketen functie. 1,9 Een vroege versie van de luminescentie sensor expressie van het luciferasegen zonder GFP-fusie (PO39) is ook gebruikt bij het ​​onderzoek van de effecten van zware metalen en een respiratoire . ontkoppelrail 10 Stammen PE254 en PE255 dragen de luciferase: GFP fusie en GFP fluorescentie bleek proportioneel toenemen met nematode massa, het aanbieden van een geschikt middel voor de normalisering van de luminescentie waarden 6,9 De effecten van differentiële hoeveelheid wormen per putje kan ook. door het opnemen van meerdere technische replicaten in de assay (minimaal 5 putjes per conditie) meegenomen. 3}

Het protocol biedt de mogelijkheid om in vivo opvolging van energieniveaus (in tegenstelling tot technisch bewerkelijke in vitro ATP bepalingen) waardoor verbinding screening en herpositionering in de fysiologische context van een hele multicellular organisme. De procedure kan worden uitgebreid tot verschillende genetische achtergronden door het kruisen van het geïntegreerde transgen in chromosomaal beschikbare mutante stammen en / of silencing genen door RNA interferentie; dus, het optimaal gebruik maken van C. elegans als modelorganisme. De methode moet helpen verminderen late fase falen van kandidaat-geneesmiddelen als gevolg van mitochondriale toxiciteit en een bijdrage leveren aan vermindering van de hogere dierproeven.

Protocol

OPMERKING: Voer alle stappen onder steriele omstandigheden (laminaire stroming kast) en met pre-gesteriliseerde materialen (autoclaaf 126 ° C, 11 min). Een LB plaat met uitgestreken E. coli OP50 bewaard bij 4 ° C nodig, streak uit op verse LB-platen en restreak maandelijks.

1. Bacteriële Eten (Escherichia coli OP50) Voorbereiding

1. Dag 1. Inoculeer 2 x 5 ml LB twee universele flesjes met een enkele kolonie van E. coli OP50 en plaats in schudincubator bij 37 ° C (220 rpm) gedurende 8 uur.
2. Na 8 uur incubatie Gebruik 2 ml E. coli OP50 LB cultuur aan elk van 3 x 200 ml LB. te enten Plaats kolven schudincubator (220 rpm) O / N (17 uur) bij 37 ° C.
3. Weeg 20 x 50 ml centrifugebuizen en schrijf gewicht op de buis.
4. Dag 2. Met behulp van een serologische pipet monster 30 ml O / N E. coli OP50 cultuur in de vooraf gewogen centrifugebuizen. Centrifuge bij 7741 xg, 10 ° C, 8 min.
5. Decanteer het supernatant voorzichtig, houdt de buis geïnverteerd deksel en laat enkele minuten staan. Met behulp van een pipet verwijderen overtollige supernatans die mogelijk hebben verzameld in het deksel. Weeg de buis en bereken het gewicht van de pellet.
6. Bereken het benodigde volume van een suspensie van 30 g / l te bieden en merk dit volume van de buis. Datum, label en plaats buisjes bij -20 ° C voor gebruik binnen 1-3 maanden bij - 80 ° C als opslag langer dan 3 maanden.
7. Bereid bacteriële suspensie voor de teelt van nematoden; toestaan ​​bacteriële pellet te ontdooien en voeg benodigde hoeveelheid S compleet medium ^11,12 aan elke buis, vortex voorzichtig pellet opnieuw in suspensie, inhoud pool van verschillende buizen aan het vereiste volume te verkrijgen. Werken onder steriele omstandigheden.

2. Bereiding van Drug Standaarden in een 96-well plaat formaat

NB: Bij gebruik van een drug bibliotheek, zijn drugs platen voorzien op éénconcentratie van verbinding in DMSO. Primaire screening zullen verbindingen te testen op een enkele concentratie. Instructies voor de bereiding van geneesmiddelen plaat voor bevestiging van de verbinding testen bij een bereik van concentraties van 0-160 uM, geselecteerd na statistische significantie bij 10 uM. De volgende stappen kunnen worden aangepast aan andere concentraties te testen.

LET OP! Volg de nodige voorzorgsmaatregelen voor de behandeling van drugs (in het algemeen geconfronteerd met masker, veiligheidsbril, handschoenen zijn vereist).

1. Bereid drug plaat met werkstandaarden voor bevestigend onderzoek: weeg de vereiste hoeveelheid verbinding in steriele 1,7 ml microcentrifugebuis voorbereiding 16 mM verbinding in DMSO (dwz 100x geconcentreerd opzichte gewenste top concentratie belichting).
2. In serie verdunde 16 mM stock 1: 2 in DMSO verkrijgen 8, 4, 2, 1, 0,5 en 0,25 mM normen (steriele omstandigheden). Deze zijn 100x geconcentreerd en verdund tot aan eindconcentraties van 0 (alleen medium),2,5, 5, 10, 20, 40, 80 en 160 uM (in 1% DMSO) gedurende blootstelling aan het geneesmiddel.
3. In een laminaire stroming kast plaatst 20-50 pl per putje van verbinding normen in een kolom van een 96-well plaat, bijvoorbeeld plaatpositie A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0,5 mM, G1: 0,25 mM geneesmiddel en H1: DMSO. Gebruik verschillende kolommen voor verdunningsreeks van verschillende geneesmiddelen.
4. Aliquot voertuig naar de putjes van kolom 12 in de drug plaat.
   Opmerking: Dit zal testen voertuigcontrole vastgesteld kolommen naast het testen langs rij H vergemakkelijken, zodat voertuig getest in posities representatief voor de gehele plaat.
   OPMERKING: Elk geneesmiddel dienblad bevestigende screening geldt verdunningsreeksen maximaal 11 verschillende geneesmiddelen te testen plus de voertuigcontrole.
5. Etiket en zegel plaat, dek af met aluminiumfolie en plaats bij -20 ° C tot nodig.

3. Nematode Experimenten

OPMERKING: Voer alle stappen under steriele omstandigheden, aseptisch en met vooraf gesteriliseerde materialen en reagentia. Onderhouden C. elegans stammen routinematig op NGM platen met E. coli OP50. ¹² Voorgestelde tijden voor de verschillende protocol stappen worden gegeven in tabel 1.

1. Dag 1 taak: het opzetten van vloeibare cultuur van biosensor stam voor de volgende synchronisatie.
   1. Nemen aaltjes van de ene 6 cm NGM plaat (met veel jonge larven waar voedsel net opraken) in 2 ml S compleet en overbrengen naar kolf met 30 g / l E. coli OP50 in S compleet (totaal volume 30 ml in een 250 ml conische glazen fles). Incubeer 3 dagen bij 20 ° C, 160 rpm.
2. Dag 4 taak (rekening met ongeveer 30-35 min): bleekmiddel cultuur om eieren te oogsten en te synchroniseren worm bevolking. Het uitvoeren van alle centrifugeren stappen voor 1 min, 600 x g.
   1. Bereid bleekwater oplossing vlak voor gebruik: voor elke 16 ml van 0,156 M KOH / NaOH voeg 4 ml bleekwater.
   2. Pour 2 x 14 mlworm cultuur in 15 ml conische centrifugeren buizen. Sta wormen om zich te vestigen door de zwaartekracht (3 min). Verwijder en gooi vloeistof boven vestigde nematoden. Voeg 5 ml bleekwater oplossing aan elke buis en start de timer. Combineer volumes in één buis.
   3. Omkeren buis zachtjes gedurende 2 minuten, controleert onder stereoscoop voor het breken van de wormen en de vrijlating van de eieren in suspensie. Wanneer de meeste eitjes worden vrijgegeven of in een maximumtijd van 2 min in bleekwateroplossing centrifuge.
   4. Verwijder supernatant voorzichtig. Was pellet 1x met 14 ml S compleet en centrifuge.
   5. Gooi supernatant, voeg 10 ml bleekwater oplossing en start de timer (deze tweede bleekmiddel stap zorgt ervoor dat het grootste deel van de worm karkassen desintegreren en worden niet langer gezien onder de stereoscoop). Na een maximale tijd in bleekwater oplossing van 2 min, centrifuge.
   6. Was pellet 3x in S voltooid, voorzichtig decanteren supernatant en resuspendeer pellet in 14 ml S compleet na elke centrifugeren. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer ei pellet in 14 ml S complete.
   7. Breng het volume op een conische glazen kolf. Incubeer 18-24 uur bij 20 ° C, 160 rpm.
      OPMERKING: Geoogste eitjes O / N arrestatie en ontwikkeling op het eerste instar larven (L1) gebrek aan voedsel, dus zullen ze allemaal op hetzelfde groeistadium.
3. Dag 5 taak: het opzetten van gesynchroniseerde worm culturen voor drug tests.
   OPMERKING: Worms gesuspendeerd in verhongering medium hebben de neiging zich te houden aan hydrofobe plastic oppervlakken zoals pipetpunten en buisjes. 0,01% tween-20 een surfactant hier gebruikt om plastic oppervlakken meer hydrofiel te maken en laat een grotere nauwkeurigheid bij het tellen (0,01% Triton-X100 kan ook worden gebruikt). Wanneer aaltjes zijn in de bacteriële aangevulde medium, ze niet de neiging vast te houden aan plastic.
   1. Bepaal aantal gearceerde L1 in fles, houden fles op schudden platform (160 rpm).
      1. Neem 3x 100 ui monsters van kolf (gebruik een schone tip per keer) in afzonderlijke 1,7 ml microbuisjes met 900 ul vloeibare medium 0,01% Tween-20.
         OPMERKING: Aspire 100 ul monster in de schone tip slechts een keer. Toen doseren, pipet op en neer een paar keer in de tween aangevuld medium elke wormen vast te houden aan de punt los.
      2. Tel de nematoden in 4x 10 ul druppeltjes uit elke drievoud verdunning buis. Bereken de gemiddelde waarde en schat het aantal wormen in de conische glazen kolf.
   2. Bereken het volume van uitgekomen nematode schorsing vereist voor het opzetten van een ml cultuur 2 x 20 met 10 aaltjes per 10 ul. Verhoog berekende volume met 10% om rekening te houden voor een aantal daaropvolgende nematode verlies tijdens het centrifugeren stappen.
   3. Giet volume nodig naar 2 x 15 ml centrifugeren buizen (pre-gewogen). Weeg buizen werkelijke volume afgegeven, vortex voorzichtig te krijgen en aan te passen aan het volume te richten door het verwijderen van overtollige volume met een pipet 5 ml (alleen de steriele tip moet de buis te voeren).
   4. Make up volume op 14 ml met verse S compleet wash nematoden. Centrifuge (1 min, 600 g). Verwijder en gooi supernatant met zorg de nematode pellet niet te verstoren.
   5. Voeg 5 ml S, compleet met 30 g / l E. coli OP50 voor gepelleteerde nematoden. Breng de 5 ml per buis een conische glazen kolf met 15 ml S compleet met 30 g / l E. coli OP50. Noteer de tijd nematoden werden voor het eerst voorzien van voedsel.
   6. Schud fles voorzichtig (160 rpm), neem 9 x 10 ul druppels op microscopische preparaten (gebruik verse tips elke keer) om aaltjes te tellen en te bevestigen gemiddelde van ongeveer 10 (± 2) per 10 ul.
   7. Plaats nematode kolven schudincubator bij 20 ° C, 160 rpm gedurende 42-44 uur.
4. Dag 7 taak: overdracht van nematoden tot 96 well platen en initiëren blootstelling aan het geneesmiddel.
   1. Combineer nematode culturen in één fles, houden wervelende fles voorzichtig en plaats 3 x 4 ml nematode cultuur in een 60 ml steriele trog. Plaats trog op een platform te schudden (160 rpm).
   2. Gebruik 8 channel pipet tot 25 pi opgeschort nematoden per putje van 96 en zwarte microtiterplaten aliquot met een platte transparante bodem (voor het nemen van zowel de luminescentie en fluorescentie metingen, of witte platen voor luminescentie alleen). Bedek met plaat deksel en zet apart.
      1. Na het opzetten van elke 2 borden, leg eens 2 x 2,5 ml nematoden in trog om verloren volume te vervangen (houd een "dood volume in dieptepunt van ongeveer 7 ml).
      2. Opgezet 13/14 platen met nematoden. 11 nematode platen nodig zal zijn om twee 96-well platen drugs te testen. De 12 ^e nematode plaat wordt geladen uitsluitend met drager als controle. De 13 ^ste plaat wordt gebruikt om achtergrondfluorescentie op dag 8 (zie hieronder) vast. Een extra bord kunnen worden bereid voor gebruik moet fouten optreden tijdens de set-up.
   3. Aliquot 74 pi S volledig aan elk putje en laat de plaat in een vochtige kamer (zie lijst materialen) in een schudden incubator (20 ° C, 160 rpm) until klaar voor portie testverbindingen op het vooraf geselecteerde ontwikkelings tijd (bijvoorbeeld 45 uur en 30 minuten na de maaltijd verstrekt). [Volume per put is nu 99 ul].
   4. Ontdooien drug plaat (s) te testen.
   5. Gebruik meerkanaalspipet opzetten nematode platen met drugs, veranderende tips elke keer. Sta 5 min per 96 well plaat voor aliquoting drug.
      1. Neem 1 pl van 1 ^ste kolom van drugs bord en toe te voegen aan de kolommen 1-5 van een plaat met nematoden; herhaal van ² e kolom in de drug plaat in de kolommen 8-12 van de plaat met nematoden. Voeg 1 pl voertuig kolommen 6 en 7 van de nematode plaat.
         LET OP: 100 verdunning van de verbinding / het voertuig: Het totale volume per putje in de nematode plaat zal 100 ul resulteert in een 1 zijn.
      2. Herhaal proces door het toevoegen van 1 pl van de ³ e / ⁴ e kolom van de drug plaat kolommen 1-5 / 8-12 van de tweede nematode plaat; voeg voertuig kolommen 6 en 7 van de nematode plaat.
      3. Blijven resterende drug plaat kolommen te testen. Opzetten minste één nematode plaat met vehikel in alle putjes van monsters van kolom 12 geneesmiddel plaat. Plaats platen terug in vochtige kamers in schudden incubator (20 ° C, 160 rpm) voor 20-22 uur (zie noot voor dag 8).
   6. Deel bereiden luminescentie buffer voor de volgende dag: voeg DMSO en 10% Triton-X-100 om het vereiste volume S voltooid 1% DMSO en 0,15% Triton X-100 te verkrijgen. Sta 5 ml per plaat lezen voor luminescentie, plus 1 ml voor priming luminometer injector.
5. Dag 8 taak: Lees experimentele eindpunten - fluorescentie en bioluminescentie. (GFP fluorescentie metingen worden aanbevolen als een middel om bioluminescentie gegevens te normaliseren.)
   OPMERKING: Doel om eindpunten gelezen door 66-67 uur na voedsel om nematoden verstrekt om significante nageslacht productie onder de beschreven experimentele condities te voorkomen.
   1. Opgezet plaat te gebruiken als achtergrond controle voor GFP lezingen. Combine ook de inhoud van ¹³ de plaat in een 15 ml buis. Sta nematoden te vestigen (2-3 min). Gebruik bovenstaande om een ​​microplaat (zwart met transparante bodem) te laden met 100 pi bacteriesuspensie per putje.
      1. Acht achtergrond controle plaat onder de microscoop noteren putten waar de nematoden kan worden gezien. Sluiten deze uit de achtergrond schatting gebruikt in de daaropvolgende data-analyse.
   2. Lees fluorescentie van elke 96-well plaat, waaronder de achtergrondcontrole. (Instellingen: optiek van de onderkant van de plaat; filters 485/20 excitatie; 528/20 emissie.)
   3. Bereid buffer voor luminescentie metingen: voeg luciferine (20 mM) aan deel bereid buffer (van de vorige dag) tot luminescentie buffer te verkrijgen met 1% DMSO (1x), 0,15% Triton-X100 (3x) en 0,3 mM luciferine (3x ). Prime luminometer injector 6x met 150 ul luminescentie buffer.
      1. Vorige stap neemt 1% DMSO als voertuig tijdens blootstelling aan het geneesmiddel. Wanneer het voertuig is water, aan te passen aan de concentration DMSO in luminescentie buffer tot 3% (dat wil zeggen, 3x).
   4. Werk met een bord op een moment. Verdeel 50 ul luminescentie buffer per putje. (150 ui eindvolume op goed; 3x verdunning van luminescentie buffer: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 en 0,1 mM luciferine uiteindelijke concentraties.) Onmiddellijk op te schudden platform en start timer.
      1. Na 3 min te schudden platform (160 rpm), lezen luminescentie (1 seconde per meting).

4. Data Analysis

1. Trek de gemiddelde GFP achtergrond lezen van fluorescentie resultaten. Verdeel bioluminescentie door respectieve GFP lezen.
   1. GFP als een hoge waarde wordt gedetecteerd nematoden blootgesteld aan een verbinding meet fluorescentie van de verbinding op zichzelf om eventuele verbinding fluorescentie. Indien hoger dan gemiddeld, gebruik dit als de achtergrond plaats.
2. Express bioluminescentie, GFP genormaliseerde bioluminescentie eennd GFP fluorescentie data als percentage van de gemiddelde waarde voor voertuigcontrole in elke plaat.
3. Plot gemiddelde waarden en foutbalken voor elke concentratie.
4. Test voor statistische significantie met 2-weg-analyse van variantie (ANOVA) met de gevolgen van de 'Concentratie', 'Experiment' en hun interactie (elk meetpunt verwijst naar een enkele goed), en gebruik de Dunnett-test als post-hoc-test (vs . controle voertuig).
   OPMERKING: Als het "experiment" of de "interactie" termen significant zijn, kunnen verdere experimenten nodig zijn om antwoord te bevestigen. Wanneer er geen variatie tussen de experimenten blijkt uit observatie van data percelen, kan een one-way ANOVA worden uitgevoerd op samengevoegde gegevens van onafhankelijke experimenten.
   1. Voor de statistische analyse van de plaat (platen) met enige voertuig, selecteert alle putjes in kolommen 6 en -7 alle putjes in rij H als controlegroep (deze positie in verbinding testen routinematig voertuig geeft).

Resultaten

Representatieve resultaten van de methode te illustreren werden verkregen voor rotenon (figuur 1), paraquat (figuur 2), oxaalacetaat (figuur 3) en 4 verbindingen die werden opgehaald als vuurvlieg luciferase remmers tijdens screening van een geneesmiddelenbibliotheek ¹³ (figuur 4). De blootstelling aan geneesmiddel werd gestart op de L4 stadium in alle gevallen, maar paraquat blootstellingexperimenten startten met 41 uur na eten first verstrekt nematoden in vergelijking met 45-46 uur voor de overige verbindingen. Het protocol maakt een zekere flexibiliteit in de keuze van de tijd voor het opstarten van het geneesmiddel blootstelling en lengte belichting. Echter, voor screening doeleinden, vaste tijden moet worden nageleefd keer geselecteerd voor reproduceerbaarheid tussen experimenten. Eindpunten moet worden gemeten door 66-67 uur ontwikkelingsstoornissen tijd om uitgebreid eieren leggen en uitbroeden van nakomelingen in de putten te voorkomen. Richtlijnen voor timings worden geleverd in Tstaat 1.

Rotenone een mitochondriaal complex I remmer, verminderde bioluminescentie nadat zowel relatief korte (2 uur) en langere blootstelling (24 uur) een reeks concentraties (figuur 1). In dit geval werden geen GFP metingen, maar het aantal gebruikte technische duplo (n = 6) voldoende om zelfs eventuele verschillen in de worm getallen tussen wells ^3. De 24 uurs blootstelling een tijdvenster waarover nematoden groeien en langzamere ontwikkeling als gevolg van complex I remming werd geacht bij te dragen aan de afname van de bioluminescentie. Dit werd bevestigd door visuele waarneming onder stereoscoop met een vertraagde ontwikkeling waargenomen, met name bij concentraties van 20 uM en hoger; Naast enkele dodelijkheid werd opgemerkt vanaf 40 pm (kwalitatieve observaties niet gekwantificeerd). Geen sterfte waargenomen na blootstelling 2 hr maar gevolgen worm beweging waargenomen. Een scherpe daling van de bioluminescentie ten opzichte van controles inzitRred bij de laagste concentratie van rotenone geteste 2.5 uM, waarbij effecten werden niet gemakkelijk gedetecteerd door een snelle visuele waarneming bij 2 uur blootstelling. Deze afname bioluminescentie strookt met verminderde cellulaire ATP. Maximale remming werd bereikt met de laagste concentratie van rotenon gebruikte (2,5 uM) dat aangeeft dat verdere experimenten specifiek gericht rotenon tussen 0 en 5 pM [concentratiebereik 0-160 uM dient plaats werd geselecteerd als onderdeel van een vergelijking met andere drugs aanvankelijk geïdentificeerd als significante effecten bij 10 uM (elders gepubliceerd)].

Het herbicide paraquat beïnvloedt mitochondriale functie door de toename van reactieve zuurstofverbindingen. Hier tonen we het effect op bioluminescentie van C. elegans stam PE254 na blootstelling aan een reeks concentraties van 24 uur (Figuur 2). Aangezien de stam draagt ​​een luc :: GFP-fusie, GFP fluorescentie werd also gemeten als middel normalisatie. ^6,9 Paraquat verminderde bioluminescentie, GFP fluorescentie en genormaliseerde bioluminescentie aanzienlijk. De Dunnet post-hoc-test gaf aan dat de concentraties paraquat met significante verschillen ten opzichte van voertuig controle waren 4 en 8 mM van bioluminescentie en genormaliseerde bioluminescentie, en 2 mM van genormaliseerde bioluminescentie. De enige concentratie GFP fluorescentie aanzienlijke vermindering was 8 mm, een concentratie die de groei-effecten en de af en toe een dode worm werden gezien (kwalitatief waarnemingen). De daling van bioluminescentie (en genormaliseerde bioluminescentie) groter dan die van de fluorescentie, in overeenstemming met een verminderde mitochondriale functie en effecten op ATP productie.

De citroenzuurcyclus tussenliggende oxaloacetaat getest op C. elegans stam PE254 bij één concentratie van 8 mM, leidde tot een toename van bioluminescentie (figuur 3). Geen GFP fluorescerennvu metingen werden verkregen of extra visuele waarneming uitgevoerd; maar dergelijke reactie op één enkele concentratie zou verdere bevestigende blootstelling aan een reeks concentraties en meer gedetailleerde observaties van de effecten verdienen. Een verhoging van bioluminescentie van deze verbinding is niet verrassend aangezien het kan worden gepostuleerd leiden tot grotere activiteit van de citroenzuurcyclus, met uiteindelijk een grotere productie van ATP (Toch zou het wenselijk te controleren op de gevolgen van luciferaseniveaus door beoordeling van GFP fluorescentie te in latere experimenten). De oxaalacetaat datasets weergegeven onthullen de mate van variabiliteit in respons waargenomen bij luciferase gebaseerde experimenten. In onze ervaring deze variabiliteit is een kenmerk van het testsysteem bijzonder minder nadelige blootstellingsomstandigheden.

De vuurvliegluciferase remmende verbindingen DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 en DDD00023047 werden getest, zowel in vitro door te kijken naar effecten op de purified enzym en in vivo met de C. elegans luc: GFP-expressie stam. Er was geen bewijs dat elk van de geteste verbindingen veroorzaakte dood nematode onder blootstellingsomstandigheden. Alle 4 verbindingen beïnvloed de luciferaseactiviteit in vitro bij de 2 geteste concentraties 25 en 100 uM (Figuur 4A). DDD00001434 doodde de activiteit van het gezuiverde luciferase bijna volledig, hetgeen een geloofwaardige rechtvaardiging voor de grote daling in vivo bioluminescentie (figuur 4B) ontvangen. Hoewel de in vitro en in vivo assays zijn niet direct vergelijkbaar, de reactie op DDD00023047 was vergelijkbaar in beide assays. DDD0001477 en DDD00000635 veroorzaakt een grotere daling in vivo dan in in vitro. Deze verbindingen werden geleverd aan de levende wormen 22 uur vóór de luciferine substraat en resultaten kunnen geven dat ze niet gemakkelijk werden verplaatst van de luciferase actieve plaats wanneer luciferine werd beschiketiket. Als alternatief kan DDD0001477 en DDD00000635 een extra effect op de cellulaire ATP-niveaus. Dit zou moeten worden beoordeeld met middelen die vuurvlieg luciferase inhouden. Van de nota is de sterke verbetering van het GFP-signaal in levende wormen blootgesteld aan samengestelde DDD00000635. Dit zal hierna worden besproken.

Figuur 1. De mitochondriale complex I inhibitor rotenone verminderde de energiestatus van C. elegans zoals gemeten door bioluminescentie van stam PE254. Synchronized L4 stadium wormen (45-46 uur na levensmiddelen ontvangen L1 larven) blootgesteld aan 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 en 160 uM rotenon in 1% DMSO gedurende 2 hr (kort) of 24 uur (lange blootstelling) voorafgaande lezingen van bioluminescentie respectievelijk op 48 en 69 uur van de worm ontwikkeling na de maaltijd verstrekt. Bioluminescentie (relatieve lichteenheden eenheid, RLU) werd uitgedrukt als percentage van het vehikel (1% DMSO) waarden. Foutbalken tonen SEM technische replicaten bij elke concentratie rotenon (n = 6). Alle geteste concentraties resulteerde in een statistisch zeer significant verschil met dragercontrole (p <0,001).

Figuur 2. De oxidatieve stressor paraquat verminderde de energie status van C. elegans stam PE254 op een concentratieafhankelijke wijze (gemeten door bioluminescentie). Synchronized L4 stadium wormen (gemakshalve in dit geval op 41 uur na levensmiddelen ontvangen L1 larven) werden blootgesteld aan 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 of 8 mM paraquat voor 24 uur. GFP fluorescentie (unit relatieve fluorescentie-eenheden, RFU) werd gebruikt om data bioluminescentie (RLU eenheid), beide eindpunten verkregen bij 65 uur ontwikkeling normaliseren. Gegevens zijn uitgedrukt als percentage van de controles (1% DMSO). Foutbalken verbeelden SEM van technische repliceert(n = 5 voor verschillende concentraties; n = 18 voor de controles). One-way ANOVA: *** p <0,001 ten opzichte van voertuigcontrole.

Figuur 3. De citroenzuurcyclus tussenliggende oxaloacetaat (8 mm) verbeterde de bioluminescentie van C. elegans stam PE254. Synchronized L4 stadium wormen (45-46 uur na voedsel verstrekt aan L1 larven) werden blootgesteld aan vers bereide 8 mm oxaloacetaat 18 uur ± 30 min. Bioluminescentie (RLU eenheid) werd bij een ontwikkelingstijd van 63,5 hr ± 1 uur en werd uitgedrukt als een percentage van de controle over het voertuig (DDH ₂ O). Verschillende kolommen vertegenwoordigen verschillende data sets 8 technische replicaten binnen hetzelfde experiment op verschillende 96 putjes verdeeld. Foutbalken tonen SEM technische replicaten (n = 8). 2-weg-ANOVA met 'set' en 'concentratie' als factoren: ̵6, Set 'p> 0,05,' concentratie 'p <0,001 en interactie term p> 0,05.

EEN

B

Figuur 4. Het testen van de antwoorden op 4 verbindingen uit de Dundee drug discovery verbinding bibliotheek ¹³ (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 en C4: DDD00023047) met bekende remmende werking op vuurvliegluciferase luminescentie. (A) Effect van verbindingen op de activiteit van gezuiverde vuurvlieg luciferase (gemeten als lichteenheden, RLU), uitgedrukt als percentage van controle over het voertuig. De ATP bioluminescentie CLSII kit (Roche, Manheim, Duitsland) werd gebruikt volgens de instructies van dezelfde hoeveelheid luciferase enzym hoeveelheden verdeeld putjes (witte 96-well microtiterplaten). ATP werd verschaft bij een eindconcentratie van 10 uM en 1 gl van verbinding (eindconcentratie aangegeven) of DMSO (1%) werd toegevoegd. Luminescentiesignaal geïntegreerd gedurende 10 sec. Foutbalken tonen SEM technische replicaten (n = 4). Analyse: One-way ANOVA; * p <0,05 en *** p <0,001 ten opzichte van voertuigcontrole. Verschillen tussen 25 en 100 uM van groot belang voor C1 (DDD00001434; p <0,001), en significante C2 en C3 (respectievelijk DDD0001477 en DDD00000635; p <0,05). (B) In vivo metingen van bioluminescentie, bioluminescentie genormaliseerd tot GFP fluorescentie en GFP fluorescentie van C. elegans stam PE254 op 67 uur tijd ontwikkelingsstoornissen na blootstelling aan testverbindingen voor 22 uur. Foutbalken tonen SEM technische replicaten (n = 8). Statistische analyse (One way-ANOVA) uitgevoerd op samengevoegde gegevens van 3 data sets (3 xn = 8). * p <0,05 en *** p <0,001 ten opzichte van respectievelijke voertuigcontrole. Differences tussen 25 en 100 uM alleen statistisch significant (p <0,05) voor de genormaliseerde bioluminescentie na blootstelling aan C4 (DDD00023047).

Tijdstip	Dag 1	Dag 2	Dag 3	Dag 4	Dag 5	Dag 6	Dag 7	Dag 8
10/09								Stap 5
10-11								Stap 5
11-12							Stap 4	Stap 5
12-13							Stap 4
13-14
14-15
15-16
16-17	Stap 1				Stap 3
17-18
18-19				Stap 2

Tabel 1. Overzicht van het protocol stappen uit op elke dag van de nematode experimenten worden uitgevoerd (hoofdstuk 3) en stelde timings.

Discussie

Het modelorganisme C. elegans een krachtige experimentele systeem. Het is gemakkelijk te kweken en vormt overvloedige genetisch identieke nakomelingen met 3,5 dag levenscyclus van ei tot reproduceren volwassene (via juveniele larvenstadia L1 tot L4). Vanwege zijn geringe omvang kan gemakkelijk worden gekweekt in 96-putjes platen, vergemakkelijkt compound screening. We presenteren een fenotypische screening protocol gebaseerd op stammen van C. elegans die als in vivo sensoren energieniveaus. ¹⁴ Het protocol is toepasbaar op elk laboratorium, hoewel een 96-wells plaat luminometer en een steriele kast vereist. Het is belangrijk om besmetting in testen voorkomen door goede laboratoriumtechniek. Als handmatig werken, het maximum aantal nematode platen haalbaar is 13 per experiment waardoor het testen van 2x 96-well platen drug en met twee voertuigen platen. Representatieve resultaten gepresenteerd voor het mitochondriale complex I inhibitor rotenone, de superoxide generator paraquat, de citroenzuurcyclus tussenliggende oxaloacetaat en vier verbindingen met bekende vuurvliegluciferase remmende activiteit. De eerste twee verbindingen tot een afname van bioluminescentie zoals voorspeld dat oxaalacetaat leidde tot een verbetering, waarschijnlijk veroorzaakt door een grotere productie van ATP. De oxaloacetaat datasets tonen ook aan de intrinsieke variabiliteit in experimenten gebaseerd op vuurvliegluciferase als verslaggever. Een minimum van drie onafhankelijke experimenten raadzaam robuustheid van de reacties te bepalen onbekende verbindingen.

Remming van vuurvlieg luciferase-activiteit werd geïdentificeerd met een in vitro assay met behulp van een commerciële kit. ³ Eén van de verbindingen resulteerde in een aanzienlijke toename van GFP-fluorescentie in overeenstemming met de remmer verhoging van het niveau van GFP-gelabeld vuurvliegluciferase door binding aan het luciferase enzym actief site, en waardoor het stabieler. ¹⁵ In sommige gevallen(niet in dit geval) kan leiden tot verhoogde bioluminescentie als de remmer wordt verplaatst overmaat ondergrond. ¹⁵ Het is daarom belangrijk geen resultaten foutief interpreteren van verbindingen die interageren met het firefly enzym een verminderde of verhoogde ATP niveaus / mitochondriale functie. Veranderingen in luminescentiesignaal vaak correleren met aanvullende metingen van gezondheid, zoals beweging, ontwikkeling en groei. Als voorbeeld, een verbinding een verdacht luciferase-inhibitor als een dramatische daling bioluminescentie signaal wordt gedetecteerd maar wormen te onderscheiden van de controles door microscopische waarneming. Een toename van GFP-fluorescentie, niet verklaard door groei of samengestelde autofluorescentie kan ook wijzen op een remmer. Een aantal van de luciferase-remmers ¹⁵ zijn bekend en hebben in PubChem ingevoerd. Daarom is in de eerste plaats, het is een goede gewoonte om informatie over luciferase remmers gehouden door PubChem raadplegen; gevolgd door tressant van de verbinding effecten bij in vitro assays met gezuiverd enzym ³ en / of bevestiging van effecten op de mitochondriale functie door additionele middelen. ^16,17

GFP fluorescentie metingen kan de detectie van vuurvlieg luciferase niveaus (en de mogelijke opsporing van bepaalde luciferase-enzym inhibitoren als hierboven besproken) die sterk voor het meten van dit eindpunt samen bioluminescentie indien mogelijk. Normalisatie van bioluminescentie metingen aan GFP is ook een middel voor de boekhouding van variaties in worm getallen tussen wells (hoewel dit kan ook worden bereikt door opname van meerdere technische replicaten). Voor grotere gevoeligheid, is het belangrijk om achtergrondfluorescentie aftrekken metingen. Het protocol beoordeelt bijdrage van de bacteriële suspensie naar de achtergrond fluorescentie echter nematode autofluorescentie is niet goed voor (een beperking van de huidige test, bijzonder kritisch voor een vergrijzende stusterft omdat nematode autofluorescentie toeneemt met de leeftijd). Autofluorescentie van testverbindingen moet ook worden onderzocht in parallel. GFP normalisering zou noodzakelijk lijkt waar onderzoekers willen protocol passen aan cellulaire ATP pools te vergelijken in verschillende genetische mutanten of na silencing van verschillende genen, om te controleren voor enige stam verschillen op het niveau van expressie van het transgen bioluminescentie.

Kritische parameters in de protocollen zijn ontwikkelingsstadium waarin belichting wordt geïnitieerd, de duur van de blootstelling, en het verkrijgen van vergelijkbare aantallen nematoden in verschillende putjes. Blootstelling kan beginnen in elk stadium van de ontwikkeling van de aaltjes, maar L3 podium of ouder is de voorkeur. Vanaf deze fase op, nematoden is afhankelijk van oxidatieve fosforylering voor de ontwikkeling naar volwassenheid, zoals blijkt uit een significante toename van de mtDNA inhoud, zuurstofverbruik en ATP niveaus. ^18,19,20 De huidige protocol initieert expoure in het L4 stadium. De reden aliquoting nematoden tot 96-well platen enkel in dit stadium (niet wanneer zij voor het eerst werden voorzien van voedsel in de L1 fase), is dat hoewel platen in vochtige kamers worden geplaatst om verdamping te minimaliseren, een mate van verdamping komt nog in onze schudincubator, gezien als zeer kleine druppels die op de deksels (kan dit geen probleem met andere schudden incubators zijn). Door aliquoting nematoden platen vlak voor toevoeging van het geneesmiddel normen, is de feitelijke concentratie geneesmiddel los van eventuele kleine variatie in volume door verdamping. Het laden van een nematode bord met het voertuig alleen nuttig is om te controleren of nematoden gelijkmatig verdeeld tussen de putten. Elke significante verschillen gevonden voor het voertuig alleen plaat zou een indicatie van een slechte techniek in het afgeven van de nematoden te putten.

De duur van de blootstelling is een belangrijke factor om te overwegen. Als effecten op energie-status, onafhankelijk van de groei zijn van belang, het protocol kan worden aangepast om kortere blootstelling (van bijna onmiddellijke reactie op bijvoorbeeld 2 uur) plaats. Anderzijds, toegang van verbindingen in C. elegans weefsels kan enige tijd duren. Bijvoorbeeld 12-24 uur moeten maximumcapaciteit concentraties resveratrol en 5-fluor-2'-deoxyuridine (FUDR) bereiken. ²¹ daarom een langere blootstelling (18 tot 24 uur) kan gerechtvaardigd blootstelling maximaliseren. De belichtingstijd te beperken tot tijden die niet toestaan ​​dat aanzienlijke niveaus van voortplanting plaatsvinden in de put. Wij bevelen aan dat de totale ontwikkelingstijd van nematoden onder 66-67 uur wordt gehouden. Hoewel handig, worden nematoden gravid door toen en eileggen hebben geopend. Toch vonden we bioluminescentie lezingen uit ei voorbereidingen verwaarloosbaar (niet getoond). The sur 5-promoter gedreven transgenexpressie wordt eerst gedetecteerd slechts 2-2 en een half uur na de bevruchting op 100 cellig stadium ²² en de chitinous eierschaal is waarschijnlijk ingang van luciferine beperken. Anderen hebben echter gevonden dat bebroede eieren die niet significant bijdragen aan het metabolisme van zwangere volwassenen. ^23, omstandigheden die aanzienlijke nageslacht productie te vermijden. Indien gewenst, kan de experimentele tijdschaal worden verschoven terug: we hebben eerder gestart blootstelling aan een milieu-toxine in de late L3 larvale stadium (36 uur) en bioluminescentie en GFP metingen bij 55 uur uitgevoerd ² alternatief genetische achtergronden die zijn voorwaardelijk steriel. kan worden gebruikt voor de productie van nakomelingen te voorkomen, bijvoorbeeld de fer-15 (B16) II; fem-1 (hc17) IV dubbele mutant die bij 15 ° C kan worden gehandhaafd, maar steriel bij 25 ° C. ²⁴ Het gebruik van FUDR steriliteit induceren wordt niet aanbevolen, omdat dit kan op zichzelf invloed nematode metabolisme. ²⁵ De test kan ook worden uitgevoerd in stammen met meer doorlaatbaar nagelriemen zoals gedeeltelijk verlies-van-function bus-8 mutanten die multidrug-gevoelig vanwege permeabiliteit van geneesmiddelen te verhogen. ²⁶ zijn deze korter blootstelling en lagere concentraties verbinding te vergemakkelijken. De voorwaarden voor het toevoegen van luciferine deze nematoden ook moeten aanpassen namelijk 1% DMSO en 0,05% Triton-X100 in de luminescentie buffer niet verplicht luciferine beschikbaarheid te verbeteren.

Het protocol maakt gebruik van 1% DMSO als vehikel voor aflevering verbinding. Hoewel niet dodelijk, deze concentratie van DMSO heeft een aantal biologische effecten als we in een eerdere publicatie besproken. ³ Veel van de beschikbare geneesmiddelen bibliotheken worden bereid in 100% DMSO in concentraties die geschikt zijn voor cel-gebaseerde testen zullen na verdunning voertuig tot 0,1%. Hogere concentraties verbinding vereist om responsen opwekken in C. elegans vergelijking met humane cellen, zodanig dat het vaak niet mogelijk is om assays te voeren bij minder dan 1% DMSO. Ook het gebruik van stammen metmeer doorlaatbaar nagelriemen kan leiden tot het testen met lagere concentraties van het voertuig. Concentraties van DMSO meer dan 1% worden niet aanbevolen.

Een set incubatietijd met luciferine voorafgaand aan de metingen moeten worden nageleefd. Zoals eerder aangetoond, luminescentie bereikt zijn maximale niveaus in de tweede minuut na toevoeging van luciferine, die betrekkelijk stabiel voor de eerste 5 min, gevolgd door een langzame geleidelijke afname van de luminescentie in de volgende 30 min ^1. Kinetic antwoorden op een bepaalde chemische stof kan tijdens deze eerste fase van 30 minuten na de eerste dosering van luciferine uitgevoerd.

Het protocol omvat een hongerdood stap na collectie van eieren om de synchronisatie van de nematode bevolking te bereiken. We raden synchronisatie van nematode testen populatie sinds verschillende ontwikkelingsstadia verschillen in cellulaire ATP-niveaus en kunnen anders reageren op de proef verbindingen. Door het uitvoeren van de hongersnood in de S compleetmedium tegenstelling tot M9 worden de arcering nematoden voorzien van een koolstofbron (ethanol), zodat larven niet ontwikkelen, maar niet volledig uitgehongerd. ^27,28 Ook is aangetoond dat L1 aangehouden worden klaar voor snelle respons op voedsel en L1 normale groeisnelheid wordt binnen 3 uur na de maaltijd beschikbaar. ²⁹ echter de mogelijkheid dat de honger stap het metabolisme van C. kunnen veranderen elegans kan niet worden uitgesloten. ³⁰ Daarom is de lengte van de honger mag niet hoger zijn dan 24 uur (18 uur voldoende is voor synchronisatie). Bepaalde laboratoria de mogelijkheid om een ​​Copas Biosorter voor leeftijd synchronisatie omzeilen van de honger stap geheel hebben. Andere laboratoria kunnen een voorkeur voor het uitbreiden van de nematode populatie op vaste media (NGM platen met OP50) voorafgaand aan het bleken (stap 3.1) en dit zal ook goed werken. We maken gebruik van S medium tijdens blootstelling verbinding als een standaard medium voor nematode kweken, however andere media kunnen worden geselecteerd, bijvoorbeeld K medium of EPA matig hard water worden vaak gebruikt voor ecotoxicologische studies. ^31,32

Het protocol biedt de mogelijkheid om het scherm en de kandidaten voor verdere testen op het vlak van de effecten op de mitochondriale functie te identificeren. In het stadium van de primaire screening is het waarschijnlijk dat sommige verbindingen zullen zijn gemist als gevolg van één concentratie getest derhalve drug schermen zijn niet volledig beschouwd. Treffers kan worden gevalideerd door het gebruik van technieken voor het beoordelen van de verschillende aspecten van de mitochondriale functie zoals zuurstofverbruik, C. elegans stammen met GFP tot expressie mitochondria, vlekken voor mitochondriële membraanpotentiaal en / of ROS metingen. ^16,33,34 Het grootste belang van de methode is een middel hebben voor het screenen groot aantal verbindingen en / of omstandigheden bij de meercellige organismale niveau en belangrijker om te kunnen profiteren van the genetische volgzaamheid van C. elegans om werkingsmechanismen te onderzoeken. De techniek kan helpen versnellen en nieuwe routes naar de ontdekking van interessante verbindingen en targets. Verwacht wordt dat de combinatie van de sensor met genetische achtergronden geassocieerd met humane ziekte screening van bibliotheken van verbindingen in een ziekte relevante context veel te bieden hebben.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Orion II Microplate Luminometer	Berthold Detection Systems		met injector en de Simplicity 4.2 Software; gegevens overbrengen naar Excel aan het einde van de plaatmeting
FLx800 fluorimeter	Biotek		met Gen5 Software; gegevens overbrengen naar Excel aan het einde van de plaatmeting
Ks 130 basic shaking platform	Ika	#0002980000
Innova 4349	New Brunswick Scientific		Gekoelde incubator shaker
Eppendorf centrifuge 5804R	Eppendorf		met eppendorf rotor A-4-44  (voor 50/15  ml buizen)
Stripette, Costar	Corning	#4489	Serologische pipet
Cellstar 50 ml buizen	Greiner bio-one	#227661
Cellstar 15 ml buizen	Greiner bio-one	#188261
Cellstar 60 mm weefselkweekplaten	Greiner bio-one	#628160
Superfrost Microscoopglazen	VWR	#631-0909
Steriele spatel	Corning	#3007; #3004	voor het afwegen van chemicaliën
0.22 mM Millex GP filters	Millipore	#SLGP033RS
Axygen eppendorf buizen 1,5 ml	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96 well assay plaat	VWR	#3603	Zwarte plaat met heldere bodem en deksel
Nunc 96 well assay plaat	Fisher Scientific	#236105	Witte plaat met deksel
Reservoir reagens 60 ml	Thermo Scientific Finnpipette	#9510027	gebruikt als trog voor nematoden in protocol sectie 4.4.1
Opslagdoos/vochtige kamer	Roche Diagnostics	#10 800 058 001	174 x 101 x 56,6 mm, gebruikt als vochtige kamer met natte papieren handdoeken; 2x 96-well platen met deksels passen er in, de onderste zit bovenop een microplaat deksel
Bleekmiddel: natriumhypochloriet oplossing 4-4,99% chloorgehalte	Sigma Aldrich	#239305	Opslaan in aliquots bij 4  °C,  afsluiten met Parafilm om verlies van chloor te voorkomen en afdekken met folie
D-Luciferine, kaliumzout	Biotium Inc	# 10101-2	Molecular Probes kan ook als leverancier worden gebruikt; bereid een 20 mM stock in ddH2O, bewaar bij -20 °C in aliquots
[header]
Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	Zuiverheid 99,99%
Triton X100	Alfa Aesar	#A16046	Verdunnen tot 10% in ddH2O
Nystatine	CalBiochem	#475914
C. elegans bioluminescentie stammen	Eigen laboratorium van de auteur	PE254, PE255	bevatten geïntegreerde arrays feIs4 en feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectievelijk op chromosoom V en X; selecteer voor homogene en sterke expressie van luc::GFP door middel van fluorescentiemicroscopie (bijv. kies 15 wormen) af en toe.
E. coli OP50	CGC
Algemene chemicaliën	Sigma Aldrich/Fisher Scientific