Deeltjesvolg-microreologie onderzoekt de viscoëlasticiteit van materialen. Hier wordt de techniek gebruikt om de viscoëlasticiteit, creep-compliantie en effectieve crosslinking-rollen van verschillende matrixcomponenten van een bacteriële biofilm te bepalen. De matrix bestaat uit polymere stoffen die door de bacteriën worden uitgescheiden en de componenten bepalen de structuur en mechanische eigenschappen van de biofilm.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Situ Mapping van de mechanische eigenschappen van Biofilms per Particle volgen Microreologie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bacteriecellen zijn in staat om aan het oppervlak gehechte biofilmgemeenschappen, bekend als biofilms, te vormen door zichzelf in extracellulaire polymere substanties (EPS) te omhullen. De EPS dient als een fysische en beschermende schaal die de bacteriecellen huisvest en bestaat uit een verscheidenheid aan materialen waaronder eiwitten, exopolisachariden en DNA. De samenstelling van de EPS kan veranderen, waardoor de mechanische eigenschappen van de biofilm worden hermodelleerd om zich verder te ontwikkelen of alternatieve biofilmstructuren, zoals streamers, te ondersteunen als reactie op omgevingssignalen. Desondanks zijn er weinig kwantitatieve beschrijvingen van hoe EPS-componenten bijdragen aan de mechanische eigenschappen en functie van biofilms. Reologie, de studie van de stroming van materie, is van bijzonder belang voor biofilms omdat veel biofilms in stromingsomstandigheden groeien en constant worden blootgesteld aan schuifspanning. Het biedt ook meting en inzicht in de verspreiding van de biofilm op een oppervlak. Hier wordt deeltjesvolg-microreologie gebruikt om de viscoëlasticiteit en effectieve verknopingsrollen van verschillende matrixcomponenten in verschillende delen van de biofilm tijdens ontwikkeling te onderzoeken. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om mechanische eigenschappen van biofilms op micro-schaal te meten, wat nuttige informatie zou kunnen opleveren voor het controleren en ontwerpen van biofilms.
Inleiding
De meeste bacteriële cellen zijn in staat om zowel plankton (vrij levende) en oppervlak bevestigd (zittend) vormen van de groei 1 in dienst. In het oppervlak gehecht groeiwijze, bacteriële cellen scheiden en omsluiten zich in grote hoeveelheden extracellulaire polymere stoffen (EPS) biofilms te vormen. De EPS bestaat voornamelijk uit proteïnen, exopolysaccharide, extracellulair DNA en essentieel voor biofilmvorming 2. Het dient als een fysieke scaffold waarmee bacteriën kunnen gebruiken om ruimtelijk te differentiëren en beschermt de bacteriën tegen schadelijke omgevingsfactoren en gastheerreacties. Verschillende componenten van EPS hebben versc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Biofilm Teelt
- Bereiding van bacteriële stammen
- 1 dag voor cultivatie biofilm bereiden planktonische bacterieculturen enten van 2 ml van de geschikte groeimedium uit bevroren bacteriecultuur. Gebruik Luria-bouillon medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 gistextract, en 10 g L -1 trypton) voor mucoïde P. aeruginosa en de Δ pel en Δ PSL defecte mutanten. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 200 rpm geschud. Verdun overnachtkweken tot een OD 600 van 0,40 met behulp van een spectrofotometer.
- Monteer stroomcel instelling, die is eerder beschreven 14, bij voorkeur een m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De lokale visco-elastische eigenschappen van de biofilm in verschillende gebieden van de biofilm, waarbij de holten (gemiddeld boven de biofilm), vlakten (vlakke laag ongedifferentieerde cellen) en microkolonies (zie labels in figuur 2A) inclusief onderzocht. De tijdelijke veranderingen in de visco-elastische eigenschappen van de biofilm gedurende rijping van dagen 3-5 werden bepaald. De MSD van de deeltjes in de holtes werd gebruikt als een controle en vergelijkbaar met de MSD deeltjes in zuiver medium.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Microreologie is een nuttig instrument voor de lokale rheologische metingen in heterogene systemen, zoals microbiële biofilms. Het is een niet-destructieve techniek, zodat de real-time monitoring van reologische veranderingen binnen dezelfde biologische monster over meerdere tijdstippen. In dit protocol werd deeltjes volgen Microreologie toegepast op Pel en Psl exopolysaccharide mutanten om te onderzoeken hoe ze invloed hebben op de elasticiteit en effectieve verknoping van de biofilm matrix. PSL is voorstander van de o.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek wordt ondersteund door de National Research Foundation en het ministerie van Onderwijs van Singapore onder haar Research Centre of Excellence Programma, de Start-up Subsidies (M4330002.C70) van de Nanyang Technological University, en ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) van het ministerie van Onderwijs, Singapore. De auteurs danken Joey Yam Kuok Hoong voor deelname aan de demonstratie van dit protocol.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Fluorspheres | Invitrogen | F-8821 | 1,0 μm rode fluorescente (580/605) microspheres met carboxylaat modificatie |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Epifluorescente microscoop | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Peristaltiekpomp |
| Flow Cell Chambers | Technische Universiteit van Denemarken | ||
| Bubble Trap | Technische Universiteit van Denemarken | ||
| Siliconen buis | Dow Corning | 3 mm buitendiameter, 1 mm binnendiameter | |
| Klare kunststof connectoren | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 in. (1,588 mm) |
| Clips | Om buisjes vast te klemmen | ||
| Dekglasjes | Thermo Scientific™ Nunc™ | 50 x 24 mm | |
| Spuit 3 ml | Terumo | ||
| 27 G Naald | Terumo | ||
| 2 L Opslag/Media Flessen | VWR® | ||
| Karren | Om biofilm opstelling te houden |
Referenties
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Yang, L., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
