Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Samenvatting

In deze studie werd een methode beschreven voor het synthetiseren van ultrakleine populaties van biocompatibele nanodeeltjes, evenals verschillende in vitro methoden om hun celinteracties te beoordelen.

Samenvatting

Nanodeeltje-gebaseerde afleveringsvoertuigen hebben grote belofte getoond voor intracellulaire targetingtoepassingen, door een mechanisme te bieden om specifiek cellulaire signalering en genexpressie te wijzigen. In een eerdere onderzoek werd de synthese van ultrakleine vaste lipidennanodeeltjes (SLN's) voor topikale geneesmiddelafgifte en biomarkerdetectietoepassingen aangetoond. SLN's zijn een goed bestudeerd voorbeeld van een nanodeeltje-afleveringssysteem dat is opgekomen als een veelbelovend geneesmiddelafleveringsvoertuig. In dit onderzoek werden SLN's geladen met een fluorescerende kleurstof en gebruikt als een model om deeltjes-celinteracties te onderzoeken. De fase-inversietemperatuur (PIT) methode werd gebruikt voor de synthese van ultrakleine populaties biocompatibele nanodeeltjes. Een 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenylfenyltetrazoliumboromide (MTT) assay werd gebruikt om geschikte doseringsniveaus vast te stellen vóór de nanodeeltje-celinteractiestudies. Verder werden primaire humane dermale fibroblasten en muisdendritische cellen in de loop van de tijd blootgesteld aan kleurstof-geladen SLN en de interacties met betrekking tot toxiciteit en deeltjesopname werden gekenmerkt met behulp van fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie. Dit onderzoek toonde aan dat ultrakleine SLN's, als een nanodeeltje-afleveringssysteem, geschikt zijn voor intracellulaire targeting van verschillende celtypen.

Inleiding

Nanodeeltjes gebaseerde bestelauto's hebben aangetoond grote belofte voor intracellulaire targeting toepassingen, een mechanisme om specifiek te veranderen cellulaire signalering en genexpressie. Deze voertuigen kunnen worden beladen met geneesmiddelen, eiwitten en nucleïnezuren ontworpen om cellulaire reacties effect en een gewenst effect in doelweefsels bereiken. Veel soorten nanocarriers zijn onderzocht voor therapeutische en diagnostische nut waaronder lipiden, polymeren, silicium en magnetische materialen. Deze systemen zijn aantrekkelijk vanwege hun potentieel voor lokale afgifte van geneesmiddelen, verhoogde de therapeutische concentratie in doelweefsels, en vermindering van systemische toxiciteit.

Vaste lipidenanodeeltjes (SLN) zijn een goed bestudeerde voorbeeld van een nanodeeltje afgiftesysteem dat is ontstaan ​​als een veelbelovend geneesmiddel afgiftevehikel afgelopen jaren. SLN kunnen gemakkelijk worden geformuleerd voor meerdere toepassingen zoals biologische sensing ^1, cosmetica ² en therapeutic levering ^3-7. Hun nut voort uit het feit dat zij volledig bestaan ​​uit resorbeerbare, toxische lipiden, resulterend in verhoogde biocompatibiliteit. Tijdens synthese kunnen lipofiele geneesmiddelen in LIN.AFSCHR voertuigen worden ingebouwd, waardoor de oplosbaarheid en geschiktheid geneesmiddelen verhogen voor parenterale toediening. SLN voertuigen helpen ook om ingekapseld therapieën te stabiliseren, het verminderen van hun afbraak en klaring, en het maximaliseren van therapeutische werking. Deze voertuigen zijn bijzonder geschikt voor langwerkende, gereguleerde afgifte preparaten vanwege hun stabiliteit bij lichaamstemperatuur ^3,4,8,9. Belangrijk inkapseling van geneesmiddelen in lipidenanodeeltjes verandert de intrinsieke farmacokinetische profielen van de geneesmiddelmoleculen. Dit levert een potentieel voordeel doordat de gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen met een nauwe therapeutische index. De afgiftesnelheid van SLN opgenomen geneeswijze kan worden afgestemd op basis van de lipide afbraaksnelheid of het geneesmiddel diffusiesnelheid in delipide matrix.

SLN zijn vaak ontworpen om te accumuleren op bepaalde doelweefsels. Bijvoorbeeld, de grootte (typisch groter dan 10 nm) versterkt retentie in de bloedsomloop, waar lekkende vasculatuur tumorweefsel vergemakkelijkt depositie. Bovendien heeft de wijze van toediening deeltje bleek te veranderen biologische verdeling met de potentie om specifieke fysiologische structuren te richten zoals lymfeknopen ^10,11. Bij afzetting in doelweefsels, de gepaste cellulaire interacties en eventuele internalisatie van nanodeeltjes uitdaging omdat het vermogen van celmembranen om selectief de stroom van ionen en moleculen in en uit de cel ^12. Om cellulaire opname te vergemakkelijken, is het mogelijk nanocarriers specifieke liganden zoals peptiden, kleine moleculen en monoklonale antilichamen ^13,14 wijzigen. Verscheidene mechanismen waaronder zowel passieve penetratie en actieve transport van nanodeeltjesover het celmembraan zijn eerder beschreven ^3,12,15. In het algemeen is aangetoond dat cellen nanodeeltjes interacties worden beïnvloed door de fysisch-chemische eigenschappen van de nanodeeltjes zoals grootte, vorm, oppervlaktelading en oppervlaktechemie, naast celspecifieke parameters zoals celtype of celcyclusfase ^12.

Een eerder onderzoek aangetoond dat de synthese van sub-10 nm SLN voor plaatselijk ^{16 en} biomarker detectie toepassingen ¹ met behulp van de methode ¹⁷ fase-inversie temperatuur (PIT). Dit is een zachte synthesemethode ² waarbij de samenstelling blijft constant terwijl de temperatuur geleidelijk wordt gewijzigd. Continu roeren van de verwarmde oplossing bij afkoeling tot KT leidt tot een nano-emulsie. Dit leidt tot de synthese van SLN met kleinere deeltjesgrootte ¹ dan eerder gerapporteerd met behulp van verschillende werkwijzen voor de synthese van lipiden nanoparticles ^17-22. De resulterende maat schaal kleiner dan 20 nm, een voordeel voor intracellulaire targeting toepassingen vanwege grotere oppervlak en de mogelijkheid van verhoogde cellulaire interacties.

Een schema van SLN, die een fluorescerende kleurstof of therapeutisch te leveren, wordt in figuur 1. De SLN bestaan ​​uit een lipide inrichting (bijvoorbeeld lineair alkaan) waardoor de opname van lipofiele stoffen (bijvoorbeeld kleurstoffen of therapeutica) en een oppervlakte exterior (bijvoorbeeld lineaire ionische surfactant), omgeven door water. In deze studie werden SLN beladen met een fluorescerende kleurstof en gebruikt als een model voor deeltjes-cel interacties te onderzoeken. Primaire menselijke dermale fibroblasten en muis dendritische cellen werden blootgesteld aan kleurstof-geladen SLN na verloop van tijd om interacties te karakteriseren met betrekking tot toxiciteit en deeltjes opname. A 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) bepaling werd utilized om de juiste dosering niveaus vast te stellen. Fluorescentie microscopie en flowcytometrie werden twee methoden toegepast om deeltjes opname in vitro onderzocht.

Figuur 1. Schematische voorstelling van SLN tonen de belangrijkste bestanddelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Verwerking van SLN

1. Synthese van SLN
   Opmerking: Gebruik de PIT methode ^1,17,20 naar de sub-20 nm SLN ¹ te bereiden.
   1. Gebruik aseptische techniek, Bioreagents of celkweek klasse reagentia en steriele materialen (dwz, pipetten, spatels, flesjes, enz.).
   2. Gebruik een bio kast voor de synthese van SLN (figuur 2).
   3. Combineer 0,6 mg fluorescente kleurstof (Nile Red (NIR), NiR concentratie ongeveer 0,3 mg / ml) en 0,10 g Heneicosane (Lipid, 5 wt / wt% lipide concentratie) in een flesje (15 ml), co-smelten bij 90 ° C, en roer.
   4. Voeg 0,11 g polyoxyethyleen (10) oleylether (Surfactant, 5,5 wt / wt% surfactant concentratie). Co-smelt het verkregen mengsel bij 90 ° C en roer.
   5. Voeg 1,79 g steriel water aan het mengsel verwarmen tot 90 ° C en roer totdat een transparante nano-emulsie wordt gevormd.
      Opmerking: Onder voortgezet roeren en gecontroleerde afkoeling, SLNs worden gemaakt. Deze omstandigheden leiden tot een omkering van het water-in-olie emulsie een olie-in-water emulsie. Lipofiele moleculen zoals NiR partitie naar de vetdruppels.
   6. Bereid een nanoemulsion parallel zonder toevoeging van de fluorescerende kleurstof, om te dienen als een controlemonster. Combineer 0.10 g Heneicosane en 0,11 g polyoxyethyleen (10) oleylether in een flesje (15 ml) co-smelt bij 90 ° C en roer.
      1. Voeg 1,79 g steriel water aan het mengsel verwarmen tot 90 ° C en roer totdat een transparante nano-emulsie wordt gevormd.
   7. Verder steriliseren elk nanoemulsion met een steriel 0,2 urn filter.
   
   Figuur 2. Schematische voorstelling van de synthese van de SLN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Deeltjesgrootte en Polydispersity
   1. Met dynamische lichtverstrooiing (DLS) de deeltjesgrootte en de polydispersiteit van de SLN ¹ met een glazen cuvet en een instrument om deeltjesgrootte te meten.
   2. Voorafgaand aan de metingen van de monsters, meet de deeltjesgrootte van twee bekende standaarden volgende protocol van de fabrikant voor de standaard voorbereiding en meting.
   3. Vul het glas cuvet met 1,5 ml standaardoplossing en meet de standaard oplossing met behulp van dezelfde meting voorwaarden als de monsters.
      Opmerking: Vorige stap werd herhaald voor elke standaard.
   4. Meet de monsters zoals opgesteld. Voor elk gebruik van de volgende experimentele parameters: een looptijd van 100 sec, brekingsindex van water (1,33), viscositeit van water bij 20 ° C (1.002 mPa sec).
      Opmerking: Deze techniek maakt gebruik van in frequentie verschoven licht om de grootte van de nanodeeltjes te meten.
   5. Rapporteren de gemiddelde deeltjesdiameter en polydispersiteit van partikel grootteverdeling.
3. Smeltpunt en latente warmte van Melting
   1. Gebruik een differentiële scanning calorimeter (DSC) voorzien van een autosampler en vloeibare stikstof koudebron het thermisch gedrag van SLN ¹ te onderzoeken.
   2. Pipetteer de zo bereide SLN in een 40 gl aluminium pan met een massa van ongeveer 25 mg en hermetisch sluit de pan met een universele crimper druk om vochtverlies tijdens de DSC scan minimaliseren.
   3. Meet elke nanoemulsion 5-80 ° C.
   4. Rapporteer het smeltpunt en de latente smeltwarmte van de DSC grafiek, waarbij de vallei staat voor het smeltpunt en de integraal van het gebied onder de curve in de DSC-plot gedeeld door de hoeveelheid materiaal vertegenwoordigt de latente smeltwarmte.

2. SLN Interactie met fibroblasten en dendritische cellen

1. Cultuur van primaire humane fibroblasten
   1. Cultuur primaire menselijke fibroblasts volgens de instructies van de fabrikant in vloeibaar medium voor het kweken van humane dermale fibroblasten (gemiddeld 106), aangevuld met de lage groei serum supplement (LSGS) kit. Handhaaf cellen in een bevochtigde atmosfeer bij 37 ° C, 5% _CO2 en subcultuur bij het ​​bereiken van 80% confluentie.
   2. Zowel MTT en beeldanalyse, zaadcellen in een 96-puts plaat bij een dichtheid van 2 x 10 ⁴ cellen per putje, en laat equilibreren bij 37 ° CO / N vóór SLN blootstelling.
   3. Op tijdstip nul SLN verdund in compleet medium zoals aangeduid (figuur 4) met betrekking tot lipide concentratie, en voeg 10 ul per putje aan elk repliceren goed in de 96-well plaat.
   4. Handhaaf cellen bij 37 ° C, 5% _CO2 gedurende de incubatieperiode.
2. MTT toxiciteit Assay
   1. Na 24 uur incubatie met SLN bepalen cellulaire levensvatbaarheid met de MTT-bepaling, volgens het protocol van de fabrikant.
   2. Was cellen eenmaal en voeg vers medium aan elk putje (100 ul / putje). Dood controleputjes door incubatie in 70% methanol gedurende 10 min voor het vervangen door vers medium.
   3. Voeg MTT reagens (10 gl per putje) aan elk putje van de microtiterplaat en incubeer O / N bij 37 ° C.
   4. Na O / N incubatie oplosbaar intracellulair formazine kristallen met de ontvangen reinigingsoplossing (100 gl per putje) volgens het protocol van de fabrikant.
   5. Na 3 uur incubatie bij kamertemperatuur, verkregen absorptiewaarden gemeten bij een golflengte van 570 nm met behulp van een microplaat reader.
      Opmerking: MTT reagens moet minder dan 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyl tetrazolium bromide.
3. Fluorescentie microscopie
   1. Op specifieke tijdstippen na toediening van fibroblasten met SLN, was de fibroblasten tweemaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gedurende 10 min vast met koude 70% methanol.
   2. Na 10 minVervang de methanol met PBS en beelden vast te leggen met behulp van een omgekeerde microscoop, met behulp van een band pass (BP) 690/50 nm filter set.
4. Cultuur van de muis beenmerg dendritische cellen
   1. Induceren muis beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC) zoals eerder beschreven ^23,24. In het kort plate enkele cel suspensies van C57BL / 10 beenmerg in 100 mm petrischalen bij 2 x 10 ⁶ / plaat met recombinant Muis granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF, 300 U / ml) en recombinant Muis IL-4 (B-cel stimulerende factor, 200 U / ml). Veranderen de media om de 3 dagen.
   2. Op dag 7, voeg NiR geladen SLN de gerechten in een uiteindelijke concentratie van 0,5 en 5,0 ug / ml lipide en onderhouden van de cellen in een 37 ° C, 5% _CO2 incubator voor de gewenste duur van de blootstelling.
   3. Verzamel cellen van de maaltijden door opzuigen alle media in de plaat, verzamelen in een 50 ml buis, gevolgd door grondig wassen van de plaat (losjes ad verjagenherent cellen) met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 4 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Verzamel de verkregen celsuspensie in dezelfde 50 ml buis.
5. Beoordeling van de SLN Incorporation via flowcytometrie
   1. Bepaal de concentratie van de celsuspensie verkregen in punt 2.4.3 en distribueren 3x10 ⁵ cellen in een 12 mm x 75 mm ronde bodem FACS buis.
   2. Was de cellen door toevoeging van 1 ml PBS en daarna centrifugeren van de buis gedurende 5 minuten bij 400 xg, bij een temperatuur van 4 ° C.
   3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 100 pl PBS / 2 mM EDTA / 0,1% runderserumalbumine (BSA) (kleurbuffer) die anti-CD11c-FITC monoklonaal antilichaam (0,25 ug / ml uiteindelijk). Incubeer gedurende 30 min op ijs in het donker.
   4. Was de cellen met 1 ml PBS en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 400 xg, bij een temperatuur van 4 ° C.
   5. Verwijder het supernatant en resuspendeer elkepellet met 400 pl buffer kleuring. De cellen zijn nu klaar voor acquisitie van de monsters met een flowcytometer (eventueel uitgerust met blauwe en rode lasers).
   6. Met behulp van flowcytometrie analyse software, een beoordeling van de integratie van de SLN van DC door gating op de bevolking van CD11c + cellen (FITC positief) en het vergelijken van de intensiteit van de SLN-geassocieerde fluorescentie (gemeten in de PerCP-Cy5.5 of APC kanalen).

Resultaten

De PIT methode werd gebruikt om de SLN synthetiseren en de fase-inversie temperatuur werd bepaald onder gebruikmaking van een waterbad. De monsters werden verhit langzaam en voorzichtig geroerd totdat de oplossing helder was. De faseomkering temperatuur voor de SLN gemaakt met heneicosane lipide 45 ° C. Tabel 1 vat de deeltjesgrootte, polydispersiteit, smeltpunt en latente smeltwarmte de SLN. De SLN gesynthetiseerd met de verwerkingsvoorwaarden bovenbeschreven gevolg control SLN en NiR geladen SLN met e...

Discussie

In deze studie, de synthese van SLN en hun toepasbaarheid voor intracellulaire targeting aanvragen onderzocht. Deze biocompatibele nanodeeltjes hebben aangetoond belofte als levering voertuigen voor verschillende toepassingen, waaronder drug delivery, gene silencing, en vaccin technologieën ^25-30. Ultraklein SLN werden gesynthetiseerd met behulp van een gemakkelijk proces en hun interacties met primaire huidcellen en primaire immune cellen werden onderzocht. SLN werden ontworpen om inkapseling van een fluores...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, geschikt voor fluorescentie, ≥98,0%
Heneicosaan	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethyleen (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celkweek
Spuitfilter 0,2 µm Supor-membraan met lage eiwitbinding	Life Sciences	PN4612	Niet-pyrogeen
Nanotrac Ultra	Microtrac	serienummer U1985IS	Instrument
Differentiële scancalorimeter	Mettlet-Toledo		Instrument
Primaire menselijke fibroblasten	Life Technologies	C-004-5C	Neonataal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	Een sterieel, vloeibaar medium voor de kweek van humane dermale fibroblasten.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	Alle componenten van compleet LSGS
MTT-celproliferatie-assaykit	Trevigen	4890-025-K	Gevoelige kit voor het meten van celproliferatie op basis van de reductie van het tetrazoliumzout, 3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-difenyl-tetrazoliumbromide (MTT)
Safire2 microplaatlezer	Tecan	----	Instrument
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Sigma	P5493	Voor moleculaire biologie
Recombinant muis GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, door SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden en gevisualiseerd door zilverkleuring.
Recombinant muis IL-4	Peprotech	214-14	>97%, door SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden en gevisualiseerd door zilverkleuring.