Hier beschrijven we een vereenvoudigd protocol voor microRNA (miRNA) expressieanalyses in gearchiveerde, formaline-gefixeerde, paraffine-ingeslagen (FFPE) of vers bevroren prostaatkanker (PCa) klinisch weefsel met behulp van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een cruciale uitdaging bij prostaatkanker (PCA) klinische behandeling wordt gesteld door de ontoereikendheid van de momenteel gebruikte biomarkers voor de ziekte van screening, diagnose, prognose en behandeling. De laatste jaren microRNA (miRNAs) zijn gebleken veelbelovende alternatieve biomarkers voor prostaatkanker diagnose en prognose. De ontwikkeling van miRNAs zo effectief biomarkers voor prostaatkanker sterk afhankelijk van de nauwkeurige detectie in klinische weefsels. miRNA analyses in prostaatkanker klinische monsters is vaak een uitdaging vanwege tumor heterogeniteit, steekproeffouten, stromale vervuiling etc. Het doel van dit artikel is om een vereenvoudigde workflow beschrijven miRNA analyses in gearchiveerde FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische monsters met een combinatie van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH). Binnen deze workflow optimaliseren we de bestaande methodieken voor miRNA extractie uit FFPE en bevroren prostaat tissues en expressie geanalyseerd door Taqman-probe gebaseerde miRNA RT-PCR. Verder beschrijven we een geoptimaliseerde werkwijze voor ISH analyse formiRNA detectie in prostaatweefsel met behulp vergrendeld nucleïnezuur (LNA) - probes. De geoptimaliseerde miRNA ISH protocol kan worden toegepast op prostaatkanker weefselobjectglaasjes of prostaatkanker weefsel microarrays (TMA).
Inleiding
Kanker van de prostaat is een algemeen diagnose mannelijke maligniteit dat is een van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfte bij mannen. In de VS zijn naar schatting 220.800 nieuwe gevallen en 27.540 sterfgevallen zal worden gerapporteerd in 2015 1.
Prostaatkanker is een heterogene ziekte met zeer variabele ziekte natuurlijk- tumoren kunnen indolente of zeer agressief zijn. Een cruciale uitdaging bij prostaatkanker klinische behandeling wordt gesteld door de ontoereikendheid van de momenteel gebruikte methoden / biomerkers voor de ziekte van screening, diagnose, prognose en behandeling 2. Huidige s....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) of vers ingevroren prostaatkanker werden verkregen van de SFVAMC. Monsters waren van patiënten met prostaatkanker die een radicale prostatectomie bij SFVAMC onderging. Schriftelijke toestemming is verkregen van alle patiënten en de studie werd goedgekeurd door de UCSF Commissie Human Research. Als alternatief werden prostaatkanker weefsels microarrays verkregen van commerciële bronnen en gebruikt voor miRNA analyses door ISH. Clinicopathologische en follow-up informatie geanalyseerd prostaatkankerpatiënten werd verzameld.
1. weefselmonsters
- Knip prostaatkanker weefselmonsters in ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Expressieprofiel van miR-203 in LCM primaire prostaatkanker klinische monsters met RT-PCR-analyses (figuur 1)
RT-PCR analyse van relatieve miR-203 expressie in LCM primaire prostaatkanker weefsels en de bijbehorende aangrenzende normale gebieden werd uitgevoerd zoals beschreven in Saini et al. 15 RNU48 werd gebruikt als controle. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de relatieve miR-203 expressie bij prostaatkanker tumor weefsel ten opzichte van de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit artikel beschrijven we een vereenvoudigde workflow voor miRNA expressie profilering in gearchiveerd FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische weefsels. Bij prostaatkanker, een aantal studies suggereren een belangrijke rol van microRNAs bij prostaatkanker initiatie, progressie en metastase. Echter, vaak tegenstrijdige resultaten verkregen op een specifieke miRNA 22 sinds de miRNA extractie en analyse methoden verschillen sterk. Gezien de opkomende onderzocht van de mogelijke toepassing van miRNAs a.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen financiële openbaarmakingen.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. Roger Erickson voor zijn steun en hulp bij de voorbereiding van het manuscript.
Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health
(Grant Number RO1CA177984; RO1CA138642), VA programma project over prostaatkanker (BX001604).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix voor LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatief kan het Arcutus Xt-systeem van Life Technologies worden gebruikt. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real-time PCR Systeem | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcriptie kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG gelabelde LNA sonde voor U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substraat | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridisatie oplossing | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridisatie oplossing | Biochain | K2191050-2 | |
| Blokkingsoplossing | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-geconjugeerd anti-digoxigenine antilichaam | Biochain | K2191050-7 | |
| Waterige montage media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-fenol reagens) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxiline | Statlab | SL200 | |
| Eosine | Statlab | SL201 |
Referenties
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
