De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie

Samenvatting

Er bestaan verschillende methoden voor het introduceren van ototoxische middelen in de slakken van diermodellen. Hier wordt een chirurgisch protocol gepresenteerd voor het toedienen van ototoxische middelen in de ronde venster nis. De procedure is betrouwbaar, creëert gerichte intra-cochleaire laesies en voorkomt mechanische schade aan de microarchitectuur. Onderzoek naar zelfherstel/regeneratie van de cochlea is mogelijk.

Samenvatting

Onderzoekers hebben een breed scala aan diermodellen en onderzoekstechnieken gebruikt om het auditieve systeem van zoogdieren te bestuderen. Veel van het fundamentele onderzoek dat betrekking heeft op de cochlea en de bijbehorende neurale paden, omvat de blootstelling van model-cochleae aan een verscheidenheid aan ototoxische middelen. Dit stelt onderzoekers in staat om de effecten van gerichte schade aan cochleaire structuren te bestuderen en in sommige gevallen de zelfherstelling of regeneratie van die structuren. Er bestaan verschillende technieken voor het toedienen van ototoxische middelen aan de cochlea. Bij het selecteren van een specifieke techniek moeten onderzoekers een aantal factoren overwegen, waaronder de inductie van onbedoelde systemische toxiciteit, de hoeveelheid cochleaire schade die door de chirurgische procedure zelf wordt veroorzaakt, het type gewenste lesie, overlevingskans van het dier en de reproduceerbaarheid/betrouwbaarheid van de resultaten. Momenteel gevestigde technieken omvatten parenterale injectie, intra-peritoneale injectie, trans-tympanische injectie, injectie in de endolymfatische zak en cochleostomie met perilymfatische perfusie. Elke methode is succesvol gebruikt en is goed beschreven in de literatuur; toch heeft elke methode verschillende tekortkomingen. Hier presenteren we een techniek voor de topische toediening van ototoxische middelen rechtstreeks op de niche van het ronde venster. Deze techniek is niet-invasief voor de binnenoorstructuren, produceert een snelle aanvang van betrouwbaar gerichte laesies, vermijdt systemische toxiciteit en biedt de mogelijkheid van een intra-animale controle (het contralaterale oor). Resultaten die voortvloeien uit deze aanpak hebben bijgedragen aan een dieper begrip van auditieve pathofysiologie, cochleaire celdegeneratie en regeneratieve capaciteit als reactie op een acute verwonding. Toekomstig onderzoek kan deze methode gebruiken om interventionele studies uit te voeren die betrekking hebben op gentherapie en stamceltransplantatie om gehoorverlies te bestrijden.

Inleiding

Onderzoekers hebben een breed scala van diermodellen gebruikt om de normale functie van het gehoorsysteem en de pathofysiologie van gehoorverlies bestuderen. Deze modellen zijn ook zeer nuttig voor het uitvoeren van interventiestudies tegen verschillende pathologische processen en dienen als basis voor translationeel toepassingen bij menselijke proefpersonen. Voor de meeste onderzoek waarbij het slakkenhuis en de bijbehorende auditieve netwerken moet een zekere mate van beschadiging of verstoring worden ingevoerd in het systeem. Vaak wordt de schade opzettelijk gericht op een specifieke laesie te creëren, zodat onderzoekers het effect van deze laesie normale functie, evenals de cochleaire herstelmogelijkheid bestuderen. Bij het selecteren van een bepaald diermodel en / of techniek (en) voor het inbrengen schade dient een aantal factoren worden beschouwd om de best mogelijke resultaten te bereiken. Verschillende diermodellen kunnen verschillend reageren op ingrepen, terwijl de directe en indirecte effecten van een techniek kan zijnvolledig schadelijk voor het gewenste resultaat. In de meeste gevallen zou het ideale binnenoor schade protocol systemische toxiciteit vermijden, snel en betrouwbaar tot schade, maakt een nauwkeurige en consistente laesie en zijn survivable voor verder onderzoek functioneel cellulaire en moleculaire veranderingen toelaten. Idealiter zouden deze werkwijzen ook behoud van de delicate microarchitectuur elektrochemische gradiënten van de cochlea om zoveel mogelijk.

Tot op heden hebben de onderzoekers er in geslaagd de oprichting van een aantal technieken om binnenoor letsel veroorzaken. De meeste inhouden blootstellen van het slakkenhuis een ototoxisch middel, hetzij systemisch of via chirurgische benadering. Technieken omvatten parenterale injectie, intraperitoneale injectie, trans-tympanische injectie, endolymfatische zak injectie en cochleostomie met perilymfatische perfusie. Deze technieken zijn gebruikt om een verscheidenheid van ototoxische middelen zoals furosemide, gentamicine, ouabain, en heptanol introduceren. ^1-5Hoewel succesvol in het creëren van specifieke cochleaire laesies, de bovenstaande technieken ook hebben erkend beperkingen. Systemische injecties kunnen zeer toxisch voor het dier en kan worden geassocieerd met onbedoelde cochleaire beledigingen en inconsistente resultaten. De laatste tekortkoming is ook geassocieerd met trans-trommelvlies injecties. Technieken zoals cochleostomie en perilymfatische perfusie, maar kan induceren snelle en zeer betrouwbare laesies, direct invasief binnenoor structuur en functie. Veel chirurgische benaderingen zijn ook geassocieerd met een hoge technische moeilijkheidsgraad en vereisen waardoor vreemde voorwerpen in het dier, bijvoorbeeld een micropomp ei. ^2-4,6-8 één techniek vrij van gebreken en onderzoekers moet kiezen methoden aandachtig naar hun experimentele behoeften. Hier beschrijven we in detail de ronde venster niche (RWN) applicatie techniek voor topische aflevering van ototoxische agenten in volwassen muizen.

Fieerst beschreven door Husmann et al in 1998 tijdens de studie effect gentamicine op sensorische haarcellen degeneratie bij een vogel model, werd deze techniek gevonden dat in staat is aanmerkelijk betrouwbaarder laesies dan systemisch gentamicine toepassing, terwijl het vermijden geassocieerde toxiciteit. ⁹ Sindsdien is een aantal andere onderzoekers, waaronder ons laboratorium, hebben deze techniek een groot succes gebruikt. In 2004, Heydt et al. aangepast aan een muismodel beschreven en een verbeterd vermogen om verwondingsgrootte te controleren door het vullen van de RWN met absorbeerbare gelatine spons gedrenkt in variërende concentraties gentamicine. ¹⁰ PALMGREN et al., in 2010, onderzocht de ototoxische effecten van beta-bungarotoxine, een krachtige element in het gif van de Taiwanese gestreepte kist, door toepassing van een waterige vorm ervan de RWN van volwassen ratten. ¹¹ Daarnaast zijn een aantal eerdere studies in ons laboratorium de ronde venster benadering van de ototoxische effecten van furosemide studie gebruiktee, ouabain en heptanol. ^5,6,12-15 De resultaten van deze studies hebben het belang van cochleaire vloeistof en ionen homeostase op normaal gehoor aangetoond, ontdekte cel proliferatieve capaciteit in de spiraal ganglion en cochleaire zijwand en bevorderd ons begrip van leeftijdsgebonden gehoorverlies.

De volgende aanpak omvat operatief toegang tot het middenoor via een postauricular incisie en gedeeltelijke unroofing van de benige trommelvlies bulla. Dit maakt goede belichting van de RWN en membraan waaraan een geselecteerde ototoxisch rechtstreeks kan worden toegepast. Het vloeibare middel dan zwembaden in de komvormige holte van de RWN (of langzaam afvoeren van een verzadigde absorbeerbare gelatine spons vervoerder verpakt in de RWN) en verspreidt door het ronde venster membraan in de perilymfatische ruimte van het cochleair vestibule. Geen directe cochleostomie wordt in deze benadering. De voordelen van deze techniek zijn onder behoud van binnenoor microarchitectuur, vermijdingvan systemische toxiciteit, rekening van een intra-dierlijke controle ear, snel begin van werking, selectieve degeneratie in bepaalde cochleaire celtypen (bijv. type I spiraal ganglion neuronen met ouabain belichting en cochleaire type II fibrocytes geïnduceerd door de behandeling van heptanol), en reproduceerbare / betrouwbare resultaten. Deze techniek kan worden toegepast met enkele aanpassingen tussen andere soorten knaagdieren, zoals ratten, cavia's en gerbils. Nadelen zijn een steile technische leercurve en de relatieve beperking van ototoxic belediging die is beperkt tot een enkel punt in de tijd.

Protocol

Alle aspecten van het onderzoek op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de geschikte Institutional Animal Care en gebruik Comite. Alle gewervelde dieren experimentele hier beschreven procedures werden goedgekeurd op grond van de richtlijnen van de Medische Universiteit van South Carolina (MUSC) Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1. Model Selection

1. Behouden het diermodel in een laag geluidsniveau terrarium met routine conciërges per institutionele protocollen tot aan gebruik. In dierlijke onderzoeksfaciliteiten (ARF's), te behouden stabiliteit trillingen, lawaai demping, dagelijkse verlichting, prep ruimte, afwerkingen, afdichting en waterdicht maken, en ventilatie dat NIH normen voldoen.
   Opmerking: National Institutes of Health (NIH) richtlijnen voor ARF's en het onderhoud van een laag geluidsniveau terrarium kan worden beoordeeld op: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
2. Voor alle experimenten met de rechter oor als experimentele oor. Het linker oor dient als een intra-dierlijke controle en niet chirurgisch veranderd.
3. Inspecteer het model van pre-operatief op tekenen van midden of buitenste oorontsteking. Mogelijke tekenen kunnen weglekken van vloeistof of pus uit het oor, ontstoken weefsel oorschelp en / of lethargie van het dier. Dit is ongebruikelijk, maar als opgemerkt, voorkomen verdere chirurgie en geschikte wijze te behandelen dier.

2. preoperatieve Procedures

1. Verdoven het dier 30 minuten voorafgaand aan de operatie en elke PO procedures via intraperitoneale (IP) injectie van ketamine (100 mg / kg IP) en xylazine (20 mg / kg IP). Supplement narcose noodzakelijk, zoals beoordeeld door een positieve toe-pinch reflex, met een lagere dosis ketamine (25 mg / kg IP) en xylazine (5 mg / kg IP). Bepaal de dosering in overeenstemming met institutioneel toegestaan ​​protocollen voor muizen met de leeftijd de nodige aanpassingen in de dosis.
2. Controleer voor volledige sedation van het model. Controleer of er een fase 3 vlak van anesthesie voor het geheel van de beschreven protocol gekenmerkt door een regelmatige ademhaling, een gebrek aan oprichtreflex reflex (bij muizen), en het ontbreken van pedaal en oogleden (teen-snuifje) reflexen. Handhaving van de dieren op dit niveau van de anesthesie. Dit is essentieel voor de minimalisering van pijn en intraoperatieve beweging, bloeden, en lekkage van interstitiële vloeistoffen tijdens de operatie.
3. Onderhouden lichaamstemperatuur van het dier bij 37,5 ° C met een gesloten-lus verwarming pad.
4. Dien analgesie via subcutane injectie van buprenorfine. Lever buprenorfine (0,1 mg / kg SQ eens 30 min vóór de operatie) als analgesie elke chirurgische ongemak. Base dosering en geschikte alternatieven voor het geselecteerde model op institutioneel goedgekeurd protocol. Antibiotica gebruik is niet nodig als een goede aseptische techniek is geoefend. De dieren krijgen postoperatieve analgesie als er tekenen van pijn en verdriet.
5. Voeren physiologic testen preoperatief. Het uitvoeren auditieve hersenstam respons (ABR) testen en / of vervalst product opto-akoestische emissietestprocedure (DPOAE) zowel preoperatief en net voor opofferen van het dier dient als een objectieve meting van het effect van de gekozen ototoxische middel aan gehoor van de muis.

3. Chirurgische Voorbereiding en Positionering

1. Steriliseren alle instrumenten preoperatief per institutionele normen. Bereiden chirurgische instrumenten en veld in een consistente, steriel, en georganiseerde manier om onnodige inspanning en beweging tijdens de procedure te voorkomen. Typische instrumenten nodig omvat scherpe ontleden schaar, verschillende paren metalen tang met juwelier tips, een otologische pick, een otologische curette, en een bipolaire elektrocauterisatie eenheid (figuur 1).
2. Bereiden en steriliseren papier wieken uit labwipes vooraf door het snijden van een kleine driehoekige stukje van de wipe (~ 0,7 x 1,25 cm x 1.75 in) en draaien stevig tussen duim en wijsvinger van één hand (~ 1,25 in). Oprichting van een strak verdraaid, uiterst dunne lont is van cruciaal belang voor het succes van de procedure. Bereid een totaal van 15-20 wieken voor de operatie (figuur 2).
3. Gebruik een tandartsboor aan het bot van het trommelvlies bulla snel door op gecontroleerde wijze. Toepassing van een riemaandrijving dental handboormachine met 1 of 2 mm taps toelopende tip voorkeur. Een operatieve microscoop moet het protocol voltooid. (zie Stap 4.7)
4. Pre-putten 0,2 ml van een waterige oplossing die het geselecteerde ototoxische middel in een 1 ml tuberculine spuit met een 28 G, 1/2 "naald. Typisch 1 druppel (~ 10 pi) van het middel voldoende om volledig te vullen de muis RWN. Een metalen, stompe punt naald vergemakkelijkt de levering van de agent, terwijl het voorkomen van schade aan onderliggende structuren door een scherpe schuine tip. Verdrijven enige lucht in de spuit als belletjes per ongeluk kan vullen de RWN en / of een goedetoepassing van het middel aan het ronde venster zelf.
5. Verwijder bont van de post-auriculaire huid met behulp van elektrische verzorging tondeuse. Verwijder bont in een zone die zich uitstrekt van de Auriculo-Cephalic vouw rostraal aan de schoudergordel caudaal. Breiden haar verwijdering uit de dorsale, sagittale middellijn aan de onderkaak hoek zijwaarts. Goede vacht verwijderen is van cruciaal belang voor het behoud van een schone en heldere chirurgische veld. Borstel zachtjes knipsels van de beoogde chirurgische plaats.
6. Steriliseren huid van voorbereide oppervlakte per institutionele protocollen. Breng betadine (povidon / jodium) afgewisseld met ethanol topisch op een cirkelvormige wijze gedurende 2 min. Andere middelen kunnen worden vervangen per institutionele richtlijnen.
7. Leg het dier op een vlakke ondergrond tot constant lichaamshouding tijdens de procedure te handhaven. Gebruik een klein verwarmingselement onder het lichaam geplaatst op het platform lichaamstemperatuur gedurende de procedure om de lichaamstemperatuur van het dier bij 36-38 ° C te handhaven. Niet overheat het dier omdat dit kan leiden tot milde tot ernstige beschadiging van de huid en / of vroege euthanasie.
   1. Zet de kop van het dier via een beet blok / head houder apparaten. Maken gebruik van een 0,5 cm bij 2 cm bijtblok vervaardigd uit messing met 2-4 gaten mm diameter geboord door het op 5 mm intervallen langs de lange as. Bek van het dier geopend dit toestel en plaats de bovenste centrale snijtanden in een van de gaten afhankelijk van de grootte van het dier. Draai voorzichtig een kleine klem over het dorsale gedeelte van de snuit van het dier om het te houden op zijn plaats (figuur 3).
   2. Controleer of de bijtblok / kophouder stijf verbonden is met het midden van een U-vormige scharnierende arm (Figuur 3). Bevestig een 1 cm brede stang de linkerarm van de "U" en gebruik rod als linker hoofdsteun (rechts ligt altijd werkzaam zijde).
   3. Eenmaal stevig in het hoofd houder, draai de muis om een ​​linker laterale decubitus positie. Plaats het lichaam carefully op het vlakke contactvlak te garanderen dat het gehele procedure stabiel en nodeloze torsiebelasting op de halswervels.
8. Positioneren een operationele microscoop staat 4x, 10x en 20x vergroting over de chirurgische veld. Controleer of de microscoop zijn positie in een hands-free wijze kan handhaven is ideaal voor tweehandige operatieprotocol hieronder besproken.
9. Plaats een bipolaire-enabled cauterisatie unit met fijne getipt juwelier kant stuk in een positie die is direct beschikbaar voor de hulp bij brandwonden van kleine schepen en dissectie van weefsel. Dit kan ook noodzakelijk zou zwaarder bloeden worden ondervonden.

4. Chirurgische Approach

1. Onder microscopische vergroting, scherpe schaar of een scalpel een 1-1,5 cm postauricular incisie, ongeveer 6-8 mm caudaal van de auriculocephalic vouw te maken. In de volwassen muis, een incisie in de dorsale middellijnzijdelings tot nabij de hoek van de onderkaak voldoende. Zorgvuldig te vermijden snijden diep naar onderliggende vasculaire structuren te behouden.
2. Voer zorgvuldige stompe dissectie door de onderhuidse vetlaag die variabele dikte kunnen worden. Vet kan veilig worden verwijderd indien nodig om betere blootstelling. Wees voorzichtig bij het ontleden in een ventrale-mediale richting als de externe halsader doorkruist dit gebied en schade aan deze structuur kunnen grote hoeveelheden bloed verlies en overstroming van de chirurgische veld veroorzaken. Controle buitensporige bloeden met absorbeerbare gelatine sponzen en / of katoen pellets. Gebruik bipolaire cauterisatie voor zwaardere bloeden.
3. Zodra de vetlaag goed verdeeld, bloot cervicale musculatuur. Let op belangrijke structuren met inbegrip van de grote spier lichaam van de cleidomastoideus centraal binnen de blootgestelde chirurgische veld, de externe halsader ventraal en oorspeekselklierweefsel rostraal bovenop de hoek van de onderkaak. Een belangrijke mijlpaal is een kleine zenuw branch (van hersenzenuw XI) die rond het achterste / dorsale rand van de cleidomastoideus om rostraal uitbreiding naar de oorschelp (figuur 4).
4. Zachtjes trekken de cleidomastoideus spier lichaam in een posterior / dorsale richting (figuren 4, 5). Zachtjes verdelen de transparante fascia omhult de spier lichaam. Op soortgelijke wijze, zachtjes trekken de parotis en uitwendige halsader in de tegengestelde (anterior / ventraal) (Afbeelding 5).
5. Met goede terugtrekken van de cleidomastoideus spier lichaam, de glimmende koepel van het trommelvlies bulla periosteum in beeld (figuur 6) komt. Aan het caudale aspect van de bulla, het inbrengen van een diepere cervicale spier, de sternomastoideus, in zicht (figuur 6) komt. Het behoud van de gezichtszenuw, die zichtbaar is op de rug- en rostrale aspect van de bulla koepel wordt. Plaats een self-behoud oprolmechanisme (steriele titanium shaft-- ingebed in disposable siliconeplakken) voorafgaand aan het boren.
6. Met twee handen techniek, voorzichtig verdelen de bulla periost met een bipolaire diathermie aan het onderliggende bot bloot te leggen. Met behulp van een tang of een otologische curette, voorzichtig verheffen en duw het periost in een perifere richting om de bulla koepel op grote schaal bloot.
   Opmerking: Step 4,6 kritisch chirurgische gezien de middenruimte oor maximaliseren. Gebruik maken van zorgvuldige en zachte zacht weefsel handling te bloeden en / of lekken van interstitiële vloeistof te voorkomen in de bulla holte na het boren.
7. Bij een correct belichte bulla koepel, boor een 2 mm piloot gat door de bulla bot met een tandheelkundige chirurgische boor tussen de caudale rand van de koepel en de ondoorzichtige lijn (die het trommelvlies) die zich uitstrekt over de rostrale aspect van de bulla (Figuur 7). Zorg te boren alleen door bot onderliggende structuren, zoals de stapediale slagader te behouden. Boor een tweede piloot gat in de buurt om de VN-dakbedekking van de bulla bot te vergemakkelijken ( Figuur 7).
8. Met behulp van een paar van de juwelier tip tang, Haal het beschermkapje van de bulla bot in een dorsale en caudale richting (figuur 8). Verwijder het bot in een fragmentarische wijze onder hoge vergroting. Niet doorboren de stapediale slagader, die direct ligt onder de bulla cap, zoals bloeden uit deze slagader kan de procedure in gevaar brengen. Minimaliseren van de hoeveelheid bot verwijderd om overmatig fluïdum toegang tot het middenoor voorkomen terwijl nog steeds een uitstekende visualisatie en toegang tot de ronde venster niche (figuur 8).

5. Rond Venster Toepassing van Ototoxische Agent

1. Maak subtiele rotatie aanpassingen aan het hoofd van de houder van de RWN vierkant in beeld te brengen. De RWN bevindt zich meestal aan de dorsale en caudale aspect van de middelste ruimte oor en verschijnt als een kop-achtige inspringen van de otic capsule bot. In de meeste gevallen, de stapediale slagader loopt 1-2 mm ventraal / rostraal dit. De RWN kan soms tuc wordenperifeer ked onder een acute gehoekt van de bulla koepel. In dergelijke gevallen, zorgvuldige positionering van het hoofd van het dier staat voorop.
   1. Met behulp van het papier wieken preoperatief voorbereid, verwijder alle zichtbare vloeistof in het middenoor en RWN tot het droog bot wordt gevisualiseerd.
      Opmerking: Dit is de meest cruciale stap in het gehele protocol, zoals het ~ 10 ul (1 druppel) van ototoxische wordt toegepast op het RWN kan gemakkelijk worden verdund door deze vloeistof.
2. Onder maximale vergroting, met een fijne kaliber naald op een 1 ml tuberculine spuit een druppel (~ 10 ul) van ototoxic rechtstreeks van toepassing op de RWN, volledig vullen. Zorg ervoor dat niet verstoren de stapediale slagader en nauw te observeren voor de vervanging van een kleine lichtreflectie aan de basis van een droge niche met een saai en wazige vloeistof meniscus als een indicator dat de niche goed is vullen.
   1. Laat het middel om te rusten in de RWN ongeveer 10 minuten belichtingstijd. Hierna volledig wick uit de agent en te vervangen door een nieuwe toepassing van hetzelfde middel. Bepaal herhalingen van toepassing volgens middel specificaties. De totale belichtingstijd bij deze werkwijze varieert gewoonlijk tussen 30 tot 60 minuten.
   2. Aan het einde van de procedure, helemaal weg lont de agent een laatste keer en verse middel van toepassing op de RWN. Laat de bulla afgetopte en een tang om het zachte weefsel te sluiten over de chirurgische plaats.
3. Afdichting chirurgische plaats op het niveau van de huid met een 4-0, niet absorbeerbare monofilament hechtmateriaal. Plaats het dier in een kooi herstel / station. Monitor klinische toestand van het dier regelmatig na de operatie. Handhaven van het dier in de juiste omgeving voorwaarden, met inbegrip van huisvesting met zachte bedden en suppletie met zacht voedsel, om stress te minimaliseren. Bepaal toekomstige procedures en post-operatieve voorwaarden volgens de institutionele IACUC protocollen.
4. Gebruik institutionele IACUC protocollen instrument steriliserens voor gebruik in het volgende dier. Zorg voor goede koeling tijd tussen gebruiken instrument.

6. Postoperatieve Procedures en Cochlear Tissue Oogsten

1. Zoals beschreven in stap 2,5, uitvoeren fysiologische testen gehoor postoperatief op gewenste plaatsen en voorafgaand aan offeren. Voeren Postoperatieve procedures volgens experimentele doeleinden. Offer het dier op elke gewenste postoperatieve dag.
2. Bij volledige narcose via IP-injectie, zoals vereist per institutionele IACUC protocollen opofferen van het dier. Met behulp van een scherpe schaar, onthoofden dier net caudaal van het achterhoofd. Scherp open de neurocranium met een schaar langs de dorsale en ventrale middellijn en verspreiding op grote schaal. Voorzichtig schep hersenweefsel aan de temporale botten bloot.
   Opmerking: Een aantal van de procedures voor het onderzoek van de post veranderingen blootstelling in het slakkenhuis kan vertakken vanaf dit punt en zal in de discussie sectie worden vermeld. Bepaal de onderzoeksmethode meest relevant de experimentele doelen. Als elektronenmicroscopie is gepland na het slakkenhuis worden doorgesneden, gebruiken hartkatheterisatie een pre-fix het weefsel. Dit valt buiten het bestek van deze discussie en is behandeld in de diepte elders. ¹³
3. Snijd de temporele beenderen uit de schedelbasis met de schaar en onmiddellijk in fixeeroplossing. Dompel botten in 4% paraformaldehyde gedurende 1,5 uur bij KT. Monitor fixatietijd, een langere duur van het resultaat van histologische analyse op latere stappen kunnen beperken. Ontkalken ontleed botten voor een variabele periode via onderdompeling in 1 mM Ethyleendeniaminetetraacetaat (EDTA).

Resultaten

In een recente studie van Stevens et al gebruik te maken van de bovenstaande protocol, werden volwassen CBA / CAJ muizen van beide geslachten blootgesteld via ronde venster diffusie heptanol. ¹⁵ heptanol is een gap junction un-koppeling bekend te produceren gerichte, herstelbare schade aan cellen van de cochleaire laterale wand. Het doel van het onderzoek was om een ​​betrouwbaar model voor gerichte cochleaire schade veroorzaken, waardoor onderzoek postoperatief herstel van beschadigde onderdelen. Pre-operatieve en post-operatieve gehoordrempels diende als een functioneel eindpunt. Microscopie en immunohistochemische kleuring technieken gebruikt om morfologische veranderingen te bestuderen. Significante toename in ABR drempelwaarden werden waargenomen bij heptanol-behandelde muizen (figuur 9). Controle dieren die schijnvertoning chirurgie, met de levering van zout in plaats van heptanol, geen significante verschuivingen drempel te tonen op elk getest frequentie.

Immunokleuren tegen een naar binnen rectificerenkaliumkanaal (Kir) 4,1 diende als een indirecte methode voor het visualiseren van schade / herstel van cochleaire structuren. Dit toonde zeer reproduceerbare verschillen tussen de behandelingsgroepen en controle oren. Overall kleuringsintensiteit werd duidelijk verminderd binnen de stria vascularis (StV) en onder fibrocyten van de spiraal ligament (SLF) 1-3 dagen na blootstelling heptanol, duidt grote hoeveelheden gerichte schade aan deze gebieden. Er was een bepaalde afname Kir 4,1 kleuring intensiteit in het gebied van type II en type IV SLFs (figuur 10) en StV (figuur 11). Bewijs van verstoorde nucleaire integriteit en chromosomale condens / blebs typische cellulaire apoptose werd gezien op nucleaire counterstains deze cochleair gebieden (figuur 10). Gevacuoleerd zones van Kir 4,1 kleuring duidelijk opgelost in 7 dagen en waren afwezig volledig op 14 dagen. Toen Kir 4,1 kleuringsintensiteit werd gekwantificeerd op het gebied van STV behandelde oren toonde een initial trog gevolgd door een belangrijke verschuiving (p <0,05) weer naar lichtsterkteregeling 7 dagen na heptanol blootstelling (Figuur 12).

Figuur 1. Instrument opgericht. Afbeelding van pre-operatieve set-up van de instrumentatie. Alle apparatuur moet gemakkelijk toegankelijk binnen de steriele chirurgische veld. Typische instrumentatie omvat 2 scherpe dissectie schaar, 2-3 rechte en / of pincet gebogen tip juwelier's met oor curettes, gebogen as otologische picks (later vervangen met Rosen haalt - niet getoond) en een elektro-cauterisatie unit met een tang fijne gebogen tip juwelier hoofddeksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. chirurgische benodigdheden. Bijkomende leveringen voor het handhaven van de RWN milieu. Gesteriliseerd labwipe uitsparingen voor papier lont vorming (links), lonten strak gevormde papier gemaakt van gesteriliseerd lab doekjes (midden), en 4 mm katoen pellets (rechts) worden gebruikt om te vegen overtollig vocht en bloed overstromingen in de ronde venster niche. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Animal hoofd houder. Afbeelding van het hoofd houder en beet blok. De gaten in het blok passen en zet de bovenste centrale snijtanden. Een klem wordt voorzichtig aangespannen over de dorsale snuit tot het dier vast te zetten. Gebruik van een kop houder is van cruciaal belang voor een succesvolle chirurgische outcome. Idealiter zou deze kunnen draaien om de rostrale-caudale as van het dier om chirurgische uitzicht op de bulla tijdens de procedure te optimaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Cleidomastoideus m.. Schematische grafiek die de basis anatomie van het knaagdier cervicale musculatuur en de associatie met de externe halsader. De cleidomastoideus spier is het gemakkelijk geïdentificeerd spieren tijdens de chirurgische benadering. Vrijgave van de omhullende fascia gevolgd door posterior / dorsale terugtrekken van de spier lichaam zal leiden chirurgische dissectie naar het trommelvlies bulla (zwarte cirkel). Klik hier om al te bekijkenArger versie van deze figuur.

Figuur 5. Chirurgische belichtingsgebied. Beeldt de blootstelling na dissectie door de huid en het onderhuidse vet lagen. Structurele monumenten van de nota zijn een tak van hersenzenuw XI bovenop de cleidomastoideus spier (A), de externe halsader (B), en blootgesteld oorspeekselklierweefsel (C). De hersenzenuw XI tak wordt vaak geassocieerd met een klein schip en moeten worden verdeeld voorafgaand aan de procedure. Rechts naar links op de afbeelding komt overeen met rostrale-caudale as van het dier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Het ontmaskeren van de bulla. Blootstelling van het trommelvlies bulla na het terugtrekken van de cleidomastoideus en de omliggende structuren. Opmerkelijke bezienswaardigheden zijn de cleidomastoideus spier lichaam (A) gereflecteerd naar achteren / dorsaal, de gezichtszenuw (B), en de glimmende koepel van het trommelvlies bulla periost (C). Merk ook het inbrengen van de sternomastoideus spier links caudale aspect van het trommelvlies bulla (asterisk). De aanwezigheid van de gezichtszenuw van de rug- en rostrale aspect van de bulla een kritieke mijlpaal voor werkelijke identificatie van de bulla. Rechts naar links op de afbeelding komt overeen met rostrale-caudale as van het dier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. ontmaskeren ronde venster niche ik. Image beeltenis van de tympanic bulla volledig blootgesteld na dissectie van de bovenliggende periost. De pilot gat is het best geplaatst op het halverwege tussen de caudale rand van de bulla koepel en een subtiele ondoorzichtige lijn gevisualiseerd binnen de rostral aspect de bulla (die het trommelvlies). Een tweede, grenzend piloot gat kan makkelijker un-dak van de bulla bot te vergemakkelijken. Voorkoming van diepe boringen moeten worden genomen om te voorkomen dat de onderliggende stapediale slagader verwonden. De donkere, metalen voorwerp aan de onderkant van het beeld is de titanium zacht weefselhaak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8. Het ontmaskeren ronde venster niche II. Afgetopte trommelvlies bulla met de blootstelling van de ronde venster niche (pijl) en stapediale slagader (rode structuur1-2 mm lateraal van de niche) zoals gezien onder 20x vergroting. De nis bepaalt vaak in staat verscholen onder de scherpe hoek tussen het bulla koepel met het otische kapsel de caudale kant van de koepel. Het is noodzakelijk dat volledige visualisatie van de niche worden bereikt vóór toepassing van het ototoxische middel of wicking. Overmatige botverwijdering tijdens ontzegeld, moet ook worden vermeden als interstitiële vocht / bloed de neiging om de holte te overspoelen wanneer grote gaten zijn gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9. Representatieve resultaten -. Heptanol geïnduceerd gehoorverlies en herstel Mean auditieve hersenstam respons (ABR) drempels (dB SPL) uitgezet als een functie van toon pipfrequentie. Metingen worden gegroepeerd op basis van pre-exposure (zwart-Control) en post-operatieve dag (POD) 1, 7 en 14 (rood). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Cijfer werd opnieuw uitgezet van Stevens et al. 2014. ¹⁵ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10. Representatieve resultaten - Gerichte cochleaire schade na blootstelling heptanol deel I. Veranderingen in Kalium Inner Rectifier (Kir) Kanaal 4.1 kleuring binnen de stria vascularis (StV) oren behandeld met heptanol en controle oren. (A) Normale Kir 4,1 kleuring kenmerkend control oren met sterke strial cel affiniteit Kir 4,1 (groen). (B) Behandeling oor op Pod1. Grote vacuolized zones van decrversoepeld Kir 4,1 affiniteit worden gezien binnen STV (Pijlpunten), samen met een totale daling van StV Kir 4,1 kleuringsintensiteit. Kernen tegengekleurd met propidiumjodide (rood) (B). Schaal bar = 15 micrometer. Cijfer werd opnieuw uitgezet van Stevens et al, 2014 ¹⁵ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11. Representatieve resultaten - Gerichte cochleaire schade na blootstelling heptanol deel II Wijzigingen in de spiraal ligament (SL) van heptanol behandelde oor in vergelijking tot oor te controleren.. (A) Normale Kir 4,1 kleuring (groen) binnen de SL typisch control oor met normaal uitziende type II spiraalvormige ligament fibrocytes (II). (B) heptanol treated oor met duidelijke daling Kir 4,1 kleuring intensiteit in het gebied van type II spiraalvormige ligament fibrocytes, nucleaire verstoring en chromosomale condens / blebs overeenstemming met apoptose (pijlen). Kernen tegengekleurd met propidiumjodide (rood). Schaal bar = 15 micrometer. Cijfer werd opnieuw uitgezet van Stevens et al, 2014 ¹⁵ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12. Representatieve resultaten -. Herstel van cochleaire kleurintensiteit na blootstelling heptanol Gemiddelde relatieve luminantie van Kir 4,1 kleuring uitgezet als een functie van dagen na blootstelling. Relatieve luminantie wordt berekend Kir 4,1 reflecterende intensiteit onder confocale microscopie in heptanol treated oren genomen als percentage van dezelfde controle oren. Note POD14-28 gegevens worden samengevoegd als een enkel punt op de curve. Solid cirkels vertegenwoordigen gemiddelde waarden terwijl fout balken geven standaardafwijking van het gemiddelde. Een significant herstel van de relatieve luminantie werd aangetoond tussen POD 7 en latere data (Student's t-test p <0.05, sterretje). Cijfer werd opnieuw uitgezet van Stevens et al., 2014. ¹⁵ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het protocol en representatieve resultaten hierboven beschreven werden verkregen in een KBA / CAJ muismodel inclusief beide geslachten. Dit inteeltstam is goed opgezet als een "goed gehoor" standaard en 'normale veroudering' model in het horen van het onderzoek. ^16-23 Omschrijving van het gebruik van dit protocol in andere zoogdieren modellen valt buiten het bestek van deze tekst. De lezer dient er echter op dat de RWN applicatietechniek biedt verscheidene voordelen voor het bestuderen van zoogdieren binnenoor. Hiervan zijn de meest opvallende is dat het voorkomt direct verstoring van de delicate anatomische structuur en biochemische gradiënten die binnen de wanden van de otic capsule. Procedures zoals cochleostomie en implantatie van infuuspompen hebben de neiging om direct schenden binnenoor structuren leiden tot permanente verschuivingen drempel; een feit dat rekening moet worden gehouden bij het analyseren van de resultaten. Verstoring van cochleaire zijwand structuren door invasieve methods kan ook het gebruik van ototoxische middelen zoals furosemide of heptanol, waarvan de specifieke zone effect beperkt is op die locatie. ^15,24 Alternatieve niet-invasieve benaderingen zoals trans-tympanische injectie en parenterale injectie werden geplaagd door onbetrouwbare resultaten en beperken / of systemische toxiciteit voor het diermodel. Deze applicatiemethode is gebleken dat beide tekortkomingen te vermijden, om een ​​niveau van consistentie benaderen die van de meer invasieve werkwijzen hierboven besproken.

Andere voordelen van deze techniek omvatten is de brede toepasbaarheid op een aantal diermodellen en haalbaarheid te nemen in een bestaande labinfrastructuur. Bij dit laatste wordt geen speciale reagentia of chemicaliën afgezien vereist van de gekozen ototoxische middelen, anesthetica en analgetica. Ototoxische middelen worden typisch gebruikt bij een vaste concentratie en gemengd in een voldoende grote hoeveelheid van oplossing (5 ml) voor lange tijd duren overwegening elke toepassing gebruikt ongeveer 10 gl (bij muizen). Dus na de eerste bevoorrading en instrumenten, onderzoekers betrekkelijk vrij van tijdrovende oplossingspreparaat of frequente vervanging van materialen. Deze techniek heeft ook verlagingen operatieduur, die aanzienlijk kunnen zijn in vergelijking met procedures waarbij implantatie van perilymphatic infusiepompen of cochleostomies. Bij het bereiken van een niveau van technische bekwaamheid, onze gemiddelde doorlooptijd van de initiële incisie te sluiten was typisch 20 minuten tot 1,5 uur, afhankelijk van de duur van de blootstelling gewenst voor het ototoxische middel. Drie of vier operaties kan gemakkelijk in een enkele dag worden ingevuld, waardoor verhoogde efficiëntie en verhoogde kans op het verkrijgen van goede resultaten. Zoals hierboven beschreven, kan deze techniek ook gemakkelijk worden toegepast op een verscheidenheid van diermodellen zoals muizen, ratten, cavia's en woestijnratten.

Beperkingen van deze methode zijn gericht op dematig steile leercurve nodig om het te beheersen en verminderde verwachte resultaten tot technische vaardigheid is bereikt. Zoals in meer detail zal worden besproken, zullen kleine fouten tijdens de chirurgische ingreep of onvoldoende visualisatie van het operatieveld bijna altijd tot een slechte uitkomst. Subtiele bevindingen dat een beginner kan falen te herkennen, zoals een sub-millimeter dikke luchtbel blokkeren van de toegang van de agent om de ronde venster membraan of interstitiële vloeistof verdunnen van de agent, neem de tijd om te waarderen en de psychomotorische vaardigheden die nodig zijn om ze te corrigeren ontwikkelen. Echter, met herhaalde uitvoering van de procedure deze hindernissen overwonnen gemakkelijk en vormen een minder enorme technische uitdaging voor onderzoekers dan sommige van de bovengenoemde invasieve methoden. Tenslotte wordt deze techniek gekoppeld aan de relatieve beperking dat cochleaire schade alleen kunnen worden geïnduceerd op één tijdstip tijdens de chirurgische blootstelling. Dit kan worden overwonnen om een ​​zekere mateDoor het vullen van de RWN met absorbeerbare gelatine spons met het agens zoals beschreven door Heydt et al. ¹⁰ De absorbeerbare gelatinespons zal resorberen tijd, maar kan zorgen voor een langere blootstellingsperiode dan bereikt door toepassing van een waterige oplossing alleen is.

Om een ​​onderzoeker om de volledige voordelen van deze techniek te realiseren en valkuilen voorkomen, is het essentieel om de twee essentiële onderdelen van deze techniek herkennen: 1) de aanhoudende visualisatie van het middenoor ruimte RWN handhaven; en 2) het vermogen om de chirurgische gebied vrij van interstitiële vloeistof en / of bloed te houden. Bij het bereiken van de eerste van deze, kan het belang van een goede kop-houder niet genoeg worden benadrukt. Veilige fixatie van het hoofd van het dier zorgt voor een stabiele weergave onder de microscoop; waarvan het belang wordt snel duidelijk als subtiele instrumentatie drastisch verandert de positionering van structuren onder vergroting. Een goede hEAD houder die kan roteren rond het dier rostrale-caudale as vergemakkelijkt ook de belangrijke dynamische veranderingen in de lijn van de site van de onderzoeker. Vaak kan enkele millimeters rotatie om deze as het verschil tussen visualisering van de RWN en visualisatie van alleen de otic capsule bot betekenen. Het vermogen om te veranderen voortdurend uitzicht is ook het grootste belang om ervoor te zorgen interstitiële vloeistof goed is verwijderd uit de diepten van de niche en ook dat de ototoxic stof volledig is verwijderd tussen applicaties zoals besproken in deel 5. In onze ervaring, bloed, condensatie, of interstitiële vloeistof dat komt in de middenruimte oren heeft de mogelijkheid te verstoren gehele experiment. Dit is niet verwonderlijk, omdat de kleine hoeveelheid ototoxische middel aangebracht op de ronde venster (~ 10 pi) kan gemakkelijk worden verdund door in contact met zelfs kleine hoeveelheden vreemde vloeistof. Om deze reden is nauwgezette chirurgische dissectie en fragmentaire niet-bedekkende van het trommelvlies bulla en zorgvuldige corrosie Mion van het stapediale slagader neer op een succesvolle experimentele resultaten.

Als de bovenstaande kritische stappen worden waargenomen en verwachte resultaten zijn nog steeds niet bereikt, moet het oplossen van problemen beginnen. In onze ervaring, is het vaak nuttig om het proces variaties van twee procedurele elementen uit te voeren. De eerste is de frequentie waarmee het ototoxische middel wordt bijgevuld in de ronde venster te wijzigen. Afhankelijk van het middel dat wordt gebruikt, de totale belichtingstijd ligt tussen 30 minuten en 1 uur, met volledige wicking en daaropvolgende vervanging van het middel per 10 min. Als bloot voor kortere looptijden, waardoor de totale blootstelling kan toestaan ​​dat de agent meer tijd om te verspreiden over het ronde venster membraan. Extra belichting en suppletie kan ook helpen om ongewenste verdunning van het ototoxische middel vermijden door bloed, condensatie, of interstitiële zoals hierboven besproken. Voorzichtigheid moet worden gehandhaafd bij het gebruik van deze benadering is echter, omdat het de neiging om de kans op onbedoeld vergrotenly verwonden de stapediale slagader en / of invoering interstitiële vloeistof aan de RWN.

Deze techniek is belangrijk in wat het biedt te onderzoeken van cochleaire fysiologie en pathofysiologie. Deze minimaal invasieve techniek maakt gedetailleerde studie van gevoelige biochemische processen en is gelijk is in het bevorderen het onderzoek ter beoordeling van cochleaire regeneratief potentieel. ^12,24 Deze chirurgische benadering en belichting wordt ook weergegeven in een verscheidenheid van andere technieken uitloper en succesvolle resultaten met deze methode zijn gemeld in studies van cochleaire implantatie stamcellen. ¹⁴ Veel blijft onbekend over het slakkenhuis, maar deze techniek, samen met de bredere instrumentarium beschikbaar voor onderzoekers, zal helpen bij het ​​verkleinen van deze kennis kloof.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1-Heptanol 98%	Sigma-Aldrich	H2805	PubChem Substance ID 24895536
Ketaset Injectable	Patterson Veterinary	07-803-6637	Concentraat 100mg/ml
(Ketamine HCl)	10 ml	Schedule CIII gecontrolleerde stof
Anased Injectable	Lloyd Laboratories	NADA# 139-236	Concentraat 20mg/ml
Buprenex Injectable	Patterson Veterinary	07-850-2280	Concentraat 0,3 mg/ml
(Buprenorfine HCl)	5 ampullen per doos	Schedule CIII gecontrolleerde stof
Betadine Skin Prep Solution	Medline	MDS093941	1 Kwart schroefdop fles
0,9% steriele zoutoplossing	Variabel		Voor het mengen van oplossingen en injecties
Operatiemicroscoop	Carl Zeiss	32192
Gecontroleerde akoestische omgeving geluidscabine	Industrial Acoustics Company
Chirurgische hoofdhouder	Op maat gemaakt –	Zie figuur 3
Medische Universiteit van South Carolina
Zacht weefsel retractor (draadspeciaal, titanium) 1,75 inch	World Precision Instruments	555801L	Maximale spreiding 20 mm
Ingebedden in wegwerpbaar plastiline om dynamisch aan de hoofdhouder te bevestigen
90N tandriem aangedreven handboor	Emesco	Vintage Item
Scalpelhandgreep maat 6	Bard-Parker	MEDC-011990
#15c roestvrijstalen chirurgische scalpelmes	Bard-Parker	SKU: 097-7215	50 mesjes/doos
Via ACE Chirurgische Benodigdheden Code
Juwelierstang met rechte punt	Bernell	MIL17304
Iris schaar gebogen	Medline	DYND04026
Iris schaar recht	Medline	DYND04025
Stevens Tenotomie schaar recht	Medline	MDG3222111
Rosen Oor naald rechte schacht, licht gebogen punt	MytaMed	Artikelnr. 6.56.00	Figuur 1 toont opgeschoven punten met hoek. Dit werd later vervangen door de Rosen punten
Rosen Oor naald rechte schacht, sterk gebogen punt	MytaMed	Artikelnr. 6.56.01
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech Science	CODE 34155	Wit, maat 4,4x8,4 inch. Gesneden tot driehoeken en gerold tot fijne puntjes.
House Oor Curette, 6” schacht, lichte hoek	Medline	MDG0396486
Gelfoam (oplosbare gelatine spons) Maat 100	Medline	IIS34201	Vervangingen kunnen worden gemaakt
Katoenen pellets #3 4 mm	Richmond	Fabriekscode 100108
Elektrochirurgisch apparaat 100 E M/M	Elmed	Lijstnummer 52-5770	Bipolar en Monopolar mogelijk
1cc U-100 Insuline spuit 28G, 0,5” lengte naald	BD	Productnummer: 329410	Optioneel voor het toedienen van ototoxisch middel
23G, stompe punt, 1” lengte naald	Kendall	Productcode 8881202397	Voor gecontroleerde toediening van ototoxisch middel met minder risico op schade aan de slagader van de hamer
Chirurgisch masker	U-line	S-10478
Examenkwaliteit Nitril chirurgische handschoenen	U-line	S-12549
Precisie haartjes	Wahl		Meerdere modellen kunnen worden vervangen
5-0 Nylon zwart monofilament naad op PC-1  13 mm 3/8 cirkelnaald	Ethilon	1855G	Vervangingen kunnen worden gemaakt.
Onmiddellijk afsluitende sterilisatie zak	Fisher	01-812054
Droge sterilisator	ROBOZ	Germinator TM 500