Mitochondria spelen een centrale rol in de regulatie van metabolisme en homeostase. Subtiele veranderingen in mitochondriaal metabolisme die de fysiologie van organismen beïnvloeden, kunnen moeilijk te detecteren zijn in metabolomics-studies van hele organismen. Hier beschrijven we een isolatiemethode die de detectie van subtiele metabolische verschuivingen in Drosophila melanogaster verbetert.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Aangezien mitochondriën een rol spelen bij het metabolisme van aminozuren, koolhydraatmetabolisme en oxidatie van vetzuren, zijn defecten in de mitochondriale functie vaak schadelijk voor degenen die lijden aan deze complexe ziekten. Het detecteren van mitochondriale metabolische veranderingen is essentieel voor het begrijpen van mitochondriale stoornissen en mitochondriale reacties op farmacologische middelen. Hoewel mitochondriale stofwisseling centraal staat in metabole regulatie, kan de detectie van subtiele veranderingen in mitochondriale stofwisseling worden belemmerd door de oververtegenwoordiging van andere cytosolische metabolieten verkregen door extractie van hele organismen of hele weefsels.
Hier beschrijven we een isolatiemethode die uitgesproken mitochondriale metabolische veranderingen detecteerde in Drosophila die verschillend waren tussen hele vlieg- en mitochondrionrijke preparaten. Om de gevoeligheid van deze methode te illustreren, gebruikten we een set Drosophila met genetisch diverse mitochondriale DNA's (mtDNA) en stelden ze deze bloot aan het medicijn rapamycine. Met behulp van deze methode toonden we aan dat rapamycine mitochondriale stofwisseling wijzigt op een mitochondriale-genotype-afhankelijke manier. Deze veranderingen zijn echter veel duidelijker in metabolomics-studies wanneer metabolieten werden geëxtraheerd uit mitochondriale verrijkte fracties. In tegenstelling daarmee detecteerden extracten van hele weefsels alleen metabolische veranderingen gemedieerd door het medicijn rapamycine onafhankelijk van mtDNA's.
Inleiding
Het doel van deze procedure is om verrijkte mitochondriale fracties die voldoende mitochondriale metabolieten opleveren voor metabolomics studies met behulp van Drosophila melanogaster ontwikkelen. In onze ervaring, metabolomics analyse met behulp van hele cellulaire extractie methoden zijn niet in staat om subtiele mitochondriale metaboliet veranderingen in Drosophila detecteren. Echter, mitochondriale fractionering vóór metabolomics analyse verhoogt de gevoeligheid voor mitochondriale metaboliet verschuivingen identificeren.
Mitochondriën zijn cellulaire organellen verantwoordelijk voor 90% van de energie die de cellen nodig voor normale functie 1. De laatste jaren is erkend dat mitochondriën een veel dynamischer rol in cellulaire en organismale functie van alleen de productie van adenosine trifosfaat (ATP), en worden nu erkend als knooppunten voor de regulering van metabole homeostase 2,3. Mitochondriën zijn het resultaat van een proces waarin endosymbiotic distinct microbiële lijnen samengevoegd ~ 1,5 miljard jaar geleden 4. Zoals mitochondriën uitgegroeid tot ware organellen, werden genen van de endosymbiont opgenomen in de opkomende nucleaire genoom. Bij dieren vandaag ongeveer 1500 mitochondriale eiwitten nucleair gecodeerd terwijl 37 genen blijven de mtDNA, 13 die coderen voor mitochondriale eiwitten die subeenheden van het enzym complexen van oxidatieve fosforylering 5. Coördinatie tussen mitochondria en nucleaire compartimenten nodig om een goede mitochondriale functie te behouden.
Volgens de hieronder beschreven werkwijzen konden we mitochondriale metabole veranderingen in Drosophila als gevolg van manipulatie van de coördinatie van mitochondriale en nucleaire genoom te detecteren. Gebruikten we een stam van Drosophila waarin mtDNA van haar zus soorten D. simulans werd op een enkele D. geplaatst melanogaster nucleaire achtergrond 6. Deze 'verstoord' mitonucleargenotype vergeleken met de "natieve" of co-geëvolueerde mitonuclear genotype van D. melanogaster dragen dezelfde nucleaire genoom met zijn inheemse D. melanogaster mtDNA. De D. en D. melanogaster simulans mtDNAs verschillen ~ 100 aminozuren en> 500 synoniem substituties die mitonuclear communicatie 7,8 beïnvloeden. We gegenereerd hele fly extracten en mitochondriale verrijkte extracten metaboliet verschuivingen studeren in reactie op farmacologische stress. Hier laten we zien dat bij het gebruik van mitochondriale verrijkte fracties op te sporen we duidelijke verschuivingen in het mitochondriaal metabolieten tussen de inheemse, co-geëvolueerd genotype dragen van de D. melanogaster mtDNAs en de verstoorde genotype dragen D. simulans mtDNA. In tegenstelling, de metaboliet verschillen tussen beide genotypes subtiele met normale werkwijzen die hele fly extract gebruiken. Daarom is deze werkwijze verschaft een weg te begrijpen hoe mtDNAs bemiddelen mitochondriale veranderingenreactie op verschillende drugs.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Reagentia en oplossingen
- Voorbereiding van de vlieg voedsel en media
- Heat fly ingrediënten 11% suiker, 2% geautolyseerde gist, 5,2% maïsmeel, agar 0,79% w / v in water in een kookplaat ingesteld op 90 ° C. Regelmatig Roer tot een homogeen licht dichte mengsel is verkregen. Bereid een eindvolume van 550 ml vlieg voedsel voor een totaal van 100 flacons met 5 ml voedsel vliegen elk.
- Verwijderen uit de verwarmingsbron, roeren tot het eten afgekoeld tot 80 ° C en voeg 0,2% tegosept-methyl-4-hydroxybenzoaat opgelost in 95% ethanol.
- Verdeel het voedsel in twee gelijke volumes. Voeg 1,1 ml van 50 mM rapamycine opgelost in ethanol tot een volume en 1,1 ml ethanol aan het andere volume. Roer de rapamycine en ethanol oplossingen in het voedsel. Zorg ervoor dat de temperatuur daalt tot 50 ° C voor het toevoegen van drugs.
- Isolation Buffer
- Bereid 500 ml isolatie buffer [225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM 3- (N </ em> -morpholino) propaansulfonzuur (MOPS) en 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 2,5 mg / ml runderserumalbumine (BSA)] in water.
- Stel de pH op 7,2 met behulp van natriumhydroxide. De aanvankelijke pH zal zuur zijn.
- Gebruik steriele filter opslagflessen met een 0,22 urn poriegrootte oplossing te steriliseren en het op 4 ° C.
- Wash Buffer
- Bereid 500 ml wasbuffer [225 mM mannitol, 75 mM sucrose, 10 mM KCI, 10 mM Tris HCI en 5 mM KH 2 PO 4] in het water.
- Stel de pH op 7,2 met behulp van natriumhydroxide. De aanvankelijke pH zal zuur zijn.
- Gebruik steriele filter opslagflessen met een 0,22 urn poriegrootte oplossing te steriliseren en het op 4 ° C.
2. grootbrengen van de Drosophila stammen
- Om larvale dichtheid controleren tijdens de ontwikkeling, plaats 25 paar van de ouders in een cultuur fles en hen in staat stellen om eieren te leggen voor 48 uur.
- Verwijder ouders na 48 uur tot ei dichtheid te regelen.
- Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 met de opkomende F1 nakomelingen, zodat twee generaties van deze controle dichtheid wordt bereikt.
- Om volwassenen te verzamelen, verdoven de vliegen met behulp van kooldioxide (CO 2) en een apart geslacht.
- Gebruik een eentrapsregelaar geleverde pure CO 2 uit een hoge druk tank op een continue stroom van 5 psi. Om statische elektriciteit te voorkomen, gebruik plastic slang aan op de CO 2 te katalyseren in een 500 ml kolf met het filteren van water.
- Gebruik een rubber stop met een opening aan de kolf af te dichten. Gebruik plastic slang aan de zijdelingse opening van de kolf verbinden met een CO 2 pad.
- Plaats de vliegen in het pad niet meer dan 10-15 min. Toelaten om te herstellen van anesthesie gedurende 24 uur voordat u ze in experimentele omstandigheden.
- Om voldoende metabolieten voor mitochondriële verrijkte fracties te genereren, gebruiken 300 vliegen per monster. Hier, gebruiken vrouwen, maar Gender kunnen verschillen in andere experimenten. Transfer 150 vliegt naar een zelfgemaakte 1 L demografie kooi. Geven toegang tot 5 ml vlieg voedsel in een flacon.
- Breng de resterende 150 vliegt naar een andere 1 L kooi. Niet kooien overpopulate met meer dan 150 vliegen.
- Gebruik zes identieke monsters per experimentele conditie. Sinds hele dier extracten leveren meer metabolieten te genereren 1 monster van hele dier isoleert, overbrengen 50 vrouwelijke vliegt naar een kooi. Zoals voor de mitochondriale isolaten Gebruik zes identieke monsters per experimentele conditie.
- Plaats kooien bij 25 ° C met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.
- Zorg voor vers voedsel elke 2 of 3 dagen in een flacon met 5 ml van voedsel aan voedselkwaliteit te behouden.
- Onderhouden vliegen op voedsel voor 10 dagen. Deze stap is nodig voor de behandeling rapamycine 7. Andere behandelingen of voorwaarden verschillen.
3. Isolatie van mitochondriaal Fracties
- Dump vliegt van de ene kooi (150 vliegen) in eenglazen teflon Dounce homogenisator wordt gevuld met 1 ml gekoelde isolatiebuffer.
- Homogeniseren door het bewegen van de stamper omhoog en omlaag gedurende 15 slagen. Houd de mortel op het ijs om mitochondriën intact te houden.
- Overdracht homogenaat een 1,5 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Neem de bovenstaande vloeistof en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te verrijken voor mitochondriën.
- Zoals de bovenstaande bevat de cytosolische fractie, gooi het supernatant of te gebruiken voor andere experimenten. Resuspendeer de pellet in 300 ui wasbuffer.
- Herhaal de stappen 3,1-3,5 voor de tweede kooi. Combineer de geresuspendeerde pellets van beide kooien in een cryogene microcentrifugebuis.
- Centrifugeer bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en flash-bevriezen de pellet in vloeibare stikstof.
- Bewaar de mitochondriale verrijkte fracties bij -80 ° C of lagere temperatuur.
- Als alternatief voor de hele dierlijke preparation, plaatst de volwassenen in een cryogene microcentrifugebuis. Flash-bevriezen de injectieflacon in vloeibare stikstof en opslag bij -80 ° volwassenen C of lagere temperatuur.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De protocol hierboven uitgelegd, voerden we metabolomic analyse van mitochondriale verrijkte fracties en hele dier extracten om het effect van het geneesmiddel rapamycine op uiteenlopende mtDNAs 7 testen. We geleverde 200 M van rapamycine door het oplossen van het geneesmiddel in de vlieg voedsel. Vliegen werden blootgesteld aan rapamycine gedurende 10 dagen. Metabolieten uit hele vlieg extracten en van mitochondriale extracten werden verkregen met behulp van gaschromatog...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische stappen in dit protocol zijn: 1) het grootbrengen genoeg vliegen in een overvloed aan ruimte. Het is zeer belangrijk om niet de demografie kooien met meer dan 150 vliegen per overpopulate; 2) het veranderen van het voedsel van de kooien vaak om voedsel concurrentie en voedingswaarde stress te vermijden; en 3) het handhaven van alle monsters bij 4 ° C om de integriteit te verzekeren tijdens de isolatie van de mitochondriale fractie. Het wordt ook aanbevolen om de isolatie buffer, het wassen buffer, en ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Adelphi University faculteitsontwikkelingssubsidie en subsidie R15GM113156 van NIGMS toegekend aan EVC, subsidie R01GM067862 van NIGMS en subsidie R01AG027849 van NIA toegekend aan DMR.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Rundserumalbumine (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2-pads om vliegen te verdoven | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L kooi | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L kooideksel | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| een glazen-teflon dounce homogenisator | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Natriumhydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycine | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porine | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alfa tubuline | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2-pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filterfles | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
Referenties
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484(2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254(2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020(2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
