Methodenartikel

Het meten van TCR-pMHC Binding

13.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53157

⸱

30 oktober 2015

 ,  , 
1Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, 2Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft hoe (enkele molecuul) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-gebaseerde assays uit te voeren om de bindingsdynamiek tussen T-cel antigeen receptor (TCR) en antigeen peptide-geladen MHC-moleculen te meten zoals ze optreden binnen de immunologische synaps van een T-cel in contact met een gefunctionaliseerde planaire ondersteunde lipide bilayer.

Samenvatting

T-cellen zijn opmerkelijk specifiek en effectief bij het herkennen van antigenen in de vorm van peptiden die zijn ingebed in MHC-moleculen (pMHC) op het oppervlak van antigeenpresenterende cellen (APC's). Dit ondanks het feit dat T-cel-antigeenreceptoren (TCR's) meestal een matige affiniteit (µM-bereik) vertonen voor antigeen wanneer binding wordt gemeten in vitro1. Gezien de moleculaire en cellulaire parameters die bijdragen aan de gevoeligheid van T-cellen voor antigenen, is een op microscopie gebaseerde methodologie ontwikkeld als middel om TCR-pMHC-binding in situ te monitoren, zoals deze zich voordoet binnen de synaps van een levende T-cel en een kunstmatige en gefunctionaliseerde glasondersteunde planaire lipide dubbellaag (SLB), die het celmembraan van een antigeenpresenterende cel (APC) nabootst 2. Metingen zijn gebaseerd op Förster-resonantie-energieoverdracht (FRET) tussen een blauw- en roodverschoven fluorescente kleurstof die is bevestigd aan de TCR en de pMHC. Omdat de efficiëntie van FRET omgekeerd evenredig is met de zesde macht van de afstand tussen de kleurstoffen, kan men FRET-signalen gebruiken om synaptische TCR-pMHC-binding te visualiseren. De gevoeligheid van de microscopie-benadering ondersteunt de detectie van FRET-gebeurtenissen van enkele moleculen. Dit maakt het mogelijk om de affiniteit en afschakelingssnelheid van synaptische TCR-pMHC-interacties te bepalen en op zijn beurt de bindingssnelheid te interpoleren. Analoge assays kunnen worden toegepast om andere receptor-ligandinteracties in hun natuurlijke omgeving te meten.

Inleiding

Een fundamenteel begrip van hoe T-cellen herkennen antigenen moeten kijken naar de juiste plaats, dat wil zeggen binnen de immunologische synaps gevormd tussen de T-cel en de APC. Hier worden moleculaire bindingskinetiek niet alleen bepaald door de inherente biochemische eigenschappen van de betrokken maar interactiepartners hangen in hoge mate af van cellulaire parameters, die cellulaire krachten membraan architectuur en laterale interacties tussen membraaneiwitten en synaps-specifieke geometrische beperkingen omvatten 3. Biochemische benaderingen zijn beperkt oplossend vermogen zij noodzakelijk verstoring van ten minste één van de synaptische membranen betrokken. Om deze reden werd een FRET-gebaseerde beeldvorming methodologie ontwikkeld om toezicht te houden binding van de TCR aan antigene pMHCs 2. Hier T-cellen zijn ingericht met een recombinant en plaatsspecifiek gelabeld TcR-reactieve enkele keten antilichaam fragment (SCF V) en geconfronteerd met plan AR-glas ondersteunde lipide bilagen (SLBs), die MHC klasse II-moleculen geladen met een fluorescent gelabeld antigeen peptide, co-stimulerende moleculen en adhesie-eiwitten haven. Synaptic binding tussen kleurstof gelabelde TCR en kleurstof-gelabelde pMHC resultaten in FRET die kunnen worden bewaakt bulk en één enkel molecuul van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie.

In dit artikel wordt uitgelegd in detail hoe SLBs te gebruiken voor het testen van T-cel synapsen, controleren hun integriteit door middel van een functioneel T-cel calcium-flux test gedrag FRET metingen in bulk en met 'single molecule gevoeligheid, en de verkregen gegevens te analyseren. Aanbevelingen worden aangeboden aan het produceren van goed gelijkvormig eiwitten die nodig zijn voor tweelaags functionalisering. Voor meer specifieke informatie over dubbellaagsformatie en instellen van een geschikt TIRF microscoop wordt verwezen naar een extra toegang van het publiek Jupiter publicatie terug gepubliceerd aan rug 4.

tent "> Nature of SLBs

Functionalizable SLBs kunnen gemakkelijk worden gegenereerd van unilamellaire vesicles (SUV's) met de twee lipiden 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-fosfocholine (afgekort POPC, 90-99%) en 1,2-dioleoyl- sn - glycero-3 - {[N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiazijnzuur] succinyl} (afgekort DGS NTA-Ni, 1-10%). SUV's verspreid over schone glasplaatjes een aaneengesloten vlakke dubbellaag 4 vormen. DGS-NTA-Ni dient voor polyhistidine-gemerkte eiwitten anker via polyhistidine-gemedieerde complex-vorming met de synthetische NTA-Ni-bevattende kopgroep (Figuur 1A). Voor een stabiele vereniging één vervangt meestal de inheemse transmembraandomein en cytoplasmatische staart van de hechting eiwit ICAM-1 en de costimulatoire molecuul B7-1 met één tag bevat twaalf histidines (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) (Figuur 1B) . De met peptide beladen klasse II molecule IE k bevat twee membraan ingebedde (α en β) polypeptideketens. De transmembraan / cytoplasmatische domeinen van beide ketens worden vervangen door een label met zes histidines elk (IE k α β 6H 6H of IE k -2x6H). Als alternatief verlenging van de α-keten met twaalf histidinen en verlaten van het extracellulaire domein van de β-keten ongemerkte (die tot IE k α β 12H 0H of IE k -12H) leidt tot bevredigende resultaten (Figuur 1B).

Site-specifieke etikettering van pMHCs

Het is belangrijk om de pMHC stoichiometrisch en plaatsspecifiek labelen om te kunnen meten FRET opbrengsten te zetten in betekenisvolle equilibrium bindingsconstanten. Dit kan worden bereikt door chemische labeling van een synthetisch peptide dat in de peptidebinding cleft van recombinant-histidine tag MHC klasse II moleculen 2,5 geladen. Het peptide omvat alle resten van de T-celepitoop als well als een korte C-terminale linker (GGS), gevolgd door cysteïne (bijvoorbeeld in de mot cytochroom c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GGSC, de linker is vetgedrukt). Deze cysteïne wordt gebruikt om het peptide stoichiometrisch label met gebruik van maleimide-kleurstof derivaten. Op dit punt extra zorg moet worden besteed aan de controle van kwantitatieve dye-koppeling met de cysteïne bevattend peptide. HPLC-zuivering van het peptide-kleurstof adduct wordt aanbevolen en moet worden gevolgd door electrospray ionisatie massaspectroscopie. Elke opgenomen massa's die overeenkomen met het peptide educt (zonder kleurstof) weerspiegelen onvolledige labeling. Indien dit waar is, dient de HPLC-gezuiverde peptide wordt onderworpen aan achtereenvolgende ronden van dye-labeling tot labeling kwantitatieve geacht. Merk op dat MALDI-TOF massaspectroscopie moet worden vermeden omdat deze methode houdt laserstraling voor monster ionisatie. Deze behandeling desintegreert het bijgevoegde gevoelige fluoroforen voordat peptide massa wordt uitgelezen en dus underrepre woordigt graden van dye-vervoeging.

Indirect Nog plaatsspecifieke labeling van celgebonden TCRs met gebruik van monovalente enkele-keten Fv-fragmenten

Het is nog steeds een uitdaging om kleurstoffen oppervlak geassocieerde eiwitten van levende cellen cel in een plaatsspecifieke wijze bevestigen. Om deze hindernis voor oppervlak blootgestelde TCR overwinnen, is een monovalent enkele keten versie (SCF V) van de genen van de TcR -reactive monoklonale antilichaam H57-197 2 geconstrueerd. De kristalstructuur van dit antilichaam in complex met de TCR stelt om rationeel ontwerpen van een uitvoering, waarbij een serine residu in de nabijheid van de C-terminus van het MHC geassocieerde peptide (waarbij het overeenkomstige FRET partner kleurstof gehecht is) wordt vervangen door een cysteïnerest. Deze mutant cysteïne dient dan als een acceptor kleurstof conjugatie (figuur 2).

Methodologieën om FRET opnemen

nt "> Bulk FRET waarden best overeenstemt met de verhouding tussen gekozen inter-dye afstanden verifiëren en FRET efficiëntie gemeten in de TCR-pMHC bindsysteem 2. Bovendien bulk FRET metingen onthullen kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in synaptische TCR-pMHC affiniteiten ( zie hieronder en protocol paragraaf 3.2). Verschillende benaderingen voor het kwantificeren van FRET efficiëntie hebben in de literatuur 6 geïntroduceerd. In dit artikel FRET wordt geregistreerd via

(a) donor herstel na acceptor bleken, en via

(b) lichtgevoelig FRET acceptor emissie.

De eerste methode (a) vereist het gebruik van een FRET acceptor die gemakkelijk kan worden photobleached en een donor, die vrij photostable. Bovendien is het belangrijk dat de photobleached acceptor niet langer in staat afschrikken van het donor fluorescentie. Als dezelfde detectie-kanaal (donor) wordt gebruikt voor het kwantificeren, geen correctiefactoren eend geen chromatische aberraties moeten worden beschouwd, die deze methode eenvoudig en betrouwbaar maakt. Echter, kunnen kwantitatieve metingen niet worden herhaald op dezelfde plek monster en veranderingen in FRET kan niet worden opgenomen in de tijd. Effecten veroorzaakt door moleculaire diffusie of cellulaire beweeglijkheid snel bleken stap moet worden nagestreefd, waarbij de tijd passeren tussen de eerste FRET donor (vóór acceptor bleken) en de tweede FRET-donor beeldacquisitie (na FRET acceptor bleken) minimaliseert voorkomen. Het is aanbevolen om een ​​krachtige laser lichtbron van de FRET acceptor excitatiegolflengte dienst om verlichting en bleken te minimaliseren.

In tegenstelling, in de benadering van FRET metingen gesensibiliseerde emissie (b) de FRET-donor geëxciteerd en de emissie van de acceptor FRET waargenomen in de FRET acceptor kanaal. Veranderingen in FRET acceptor signaal kan worden opgenomen in de tijd, maar de emissie van de FRET-donor in het rood-verschoven acceptor kanaal (termed bleedthrough) en FRET acceptor cross-excitatie via donor excitatie moet nauwkeurig worden bepaald en afgetrokken van de opgenomen FRET acceptor kanaal. Voor deze de overeenkomstige FRET donor en acceptor FRET beelden moeten ruimtelijk worden uitgelijnd.

Detectie van enkel molecuul (sm) FRET evenementen

Met het gebruik van lasers als excitatiebron, een gevoelige camera en ruis verzwakt TIRF microscopie van de fluorescentie van enkele fluoroforen gemakkelijk te traceren tijd. Soortgelijk geldt voor de detectie van intermoleculaire smFRET gebeurtenissen. Echter, kunnen complicaties worden veroorzaakt door FRET donor bleedthrough en cross-excitatie van de FRET acceptor, en derhalve grote zorg moet worden genomen bij het instellen van de fluorofoor dichtheden in de smFRET experiment.

In het protocol hieronder (protocol hoofdstuk 4) werd de TCR gekozen als FRET-donor in hoge overvloed en pMHC als FRET acceptor in lage overvloed. Naar FR verzwakkenET donor bleedthrough voldoende, versieren 10-30% van de TCR met fluorescerende SCF V en 90-70% van de TCR's met niet-fluorescerende SCF V. Hier werd de FRET acceptor kanaal gekozen als single molecule channel omdat het confocale met de single molecule FRET kanaal. Dit helpt om smFRET gebeurtenissen af ​​te stemmen met 'single molecule FRET acceptoren, die de basis vormt van smFRET validatie.

Extraheren synaptische off-tarieven door middel smFRET metingen

Fotobleken van zowel FRET donor en acceptor FRET moeten worden verantwoord bij het uitpakken van de halfwaardetijd van interacties van single molecule FRET sporen. Het aantal waarneembare FRET-signalen aan het begin van hun verschijning als donor-acceptorpaar N (0) wordt de tijd verminderd zowel ontbinding van het receptor-ligand-complex en fotobleken. Het aantal overlevende complexen op een bepaald tijdstip N (t) kan mathematisch als volgt worden uitgedrukt:

figure-introduction-1

De term fotobleken exp (-t / τ bleekmiddel) het tijdstip t wordt beschreven door het product van het aantal waarnemingen n en de verlichtingstijd t slecht vanwege de niet-continue, discrete observatiemodus (dwz bleken uitsluitend tijdens de belichting ). Binnen de kinetische term exp- (t / τ uit) het tijdstip t is het product van het aantal waarnemingen n en de tijd t vertraging voor een FRET observatie (dwz kinetische ontbinding gebeurt continu). Vergelijking 1 kan worden uitgedrukt als:

figure-introduction-2

De term τ bleekwater / τ ziek describes het aantal waarnemingen tot bleking optreedt en wordt gedefinieerd als de verwachtingswaarde bleken> van de exponentiële functie. Vergelijking 2 kan als volgt worden vereenvoudigd:

figure-introduction-3

De verwachtingswaarde lag)> van het aantal frames N (t) met waar- FRET-gebeurtenissen na tijdstip t wordt rechtstreeks uit het experiment. Het hangt van de instelbare tijd tussen waarnemingen (t lag) in het experiment gekozen en de onbekende waarden τ uit (de inverse van de off-rate Koff) en bleken>, de verwachtingswaarde van het aantal waarnemingen voor het bleken optreedt .

Aldus berekening van de verwachtingswaarde lag)> ten minste twee waarden van t vertraging kan de experimentele bepaling van bleken> en r af.

Extraheren synaptische 2D-K D waarden door middel van FRET-gebaseerde metingen

Meten bezetting TCR a, dat wil zeggen de verhouding tussen gebonden TCR en de totale TCR is centraal bepalen synaptische 2D-KD-waarden. Volgens vergelijking 4 term is recht evenredig met de gemeten FRET verkregen zolang TCR dient als FRET donoren en acceptoren pMHCs als FRET.

figure-introduction-4

met een bezetting = TCR, C = omrekeningsfactor

C is een constante die afhangt van het FRET-systeem en de gebruikte fluoroforen. Dit kan experimenteel worden bepaald zoals hieronder aangegeven. a kan worden omgezet in een 2D-K D volgens vergelijking 5 wanneer debegindichtheid van TCR liganden voorafgaand aan toevoeging van T-cellen aan de bilaag bekend. Dit is vanwege de hoge mobiliteit van SLB-verbonden eiwitten en omdat SLBs bieden een vrijwel onuitputtelijke reservoir van liganden 2.

figure-introduction-5

met [pMHC oorspronkelijke] = aanvankelijke dichtheid van pMHC vóór de toevoeging van T-cellen

Vergelijkingen 4 en 5 kan nu gemakkelijk de synaptische 2D-KD tussen TCR en pMHC. Dit is het meest betrouwbaar gedaan met FRET metingen gebaseerd op donor herstel na acceptor bleken (zie protocol paragraaf 3.1).

Echter, het meten C de verhouding tussen de intensiteit I FRET FRET (gecorrigeerd voor achtergrond, FRET donor bleedthrough en FRET acceptor cross-excitatie) en TCR bezetting een te bepalen. Voor dit,moet weten de verhouding R tussen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van enkele TCR-geassocieerde FRET donorfluoroforen (bijvoorbeeld Cy3 of AF555) sm Ik FRET donor en de gemiddelde intensiteit van de enkel molecuul FRET gebeurtenissen sm ik FRET. R is afhankelijk van het FRET-systeem betrokken emissie filters en camera voor fluorescentiedetectie.

De TCR een bezetting kan vervolgens direct worden bepaald volgens vergelijking 6.

figure-introduction-6

met R = sm Ik FRET-donor / sm Ik FRET

R werd bepaald als 1,45 voor H57 scFv- Cy3 / Cy5 pMHC-systeem leidt tot:

a = bulk I FRET / bulk I TCR-Cy3 • 1,45

De relatie tussen de TCR een bezettingsgraad en FRET opbrengst kan worden bepaald door FRET donor herstelleny na acceptor bleken. Voor deze beide parameters uitgezet tegen elkaar om een aantal TCR microclusters zie figuur 4A .De helling van de lineaire fit geeft de conversiefactor C (met vergelijking 4).

Zoals aangetoond in Figuur 4A, C bedragen voor (a) het SCF H57 V - Cy3 / Cy5 pMHC-FRET-systeem en (b) de toegepaste configuratie microscoopsysteem aan 1,995. De TCR bezetting een gemakkelijk als volgt worden afgeleid:

TCR bezetting a = FRET opleveren • 1,995

Protocol

1. eiwitproductie

1,1. Bilaag-resident eiwitten: B7-1, ICAM-1, pMHC (bv IE k / peptide)

  1. -12H B7-1, ICAM-1-12H
    1. Express B7-1-12H en ICAM-1-12H constructies in hoge hoeveelheden uitgescheiden natieve eiwitten met behulp van een baculovirus expressie systeem.
    2. Zuiver eiwitten uit kweeksupernatanten via Ni-NTA affiniteitchromatografie gevolgd door MonoQ anionenuitwisselingschromatografie en S200 grootte-uitsluitingschromatografie.
    3. Label een aliquot van het gezuiverde eiwit met amine-reactieve kleurstoffen zoals NHS-succinimidyl ester preparaten van Alexa Fluor 488 (of FITC), Alexa Fluor 555 (of Cy3), Alexa Fluor 647 (of Cy5).
    4. Na S200 grootte-uitsluitingschromatografie bepalen labeling mate van monomere eiwitten volgens de specificaties van de kleurstof-fabrikant door het vergelijken van het eiwit absorptie bij 280 nm en de kleurstof absorptie bij 488 nm (Alexa Fluor 488, FITC), 555 of 552 nm(Alexa Fluor 555 of Cy3) en 647 nm (Alexa Fluor 647 of Cy5).
      Opmerking: Deze verhouding zal later nodig om het eiwit dichtheid van de SLB bepalen van het grootste fluorescentiesignaal van de kleurstof gemerkte eiwitten.
    5. Bewaar de gelabelde en fluorofoor-gemerkte eiwitten bij -20 ° C in PBS plus 50% glycerol.
  2. pMHC (hier: IE k -2x6H of IE k -12H)
    1. Hervouwen MHC klasse II uit inclusielichamen tot expressie gebracht in E. coli in de aanwezigheid van een veel goedkopere UV-splitsbare peptide vervanger, die later kwantitatief kan worden uitgewisseld met een fluorofoor geconjugeerd peptide naar keuze 5, 7.
    2. Zuiver opnieuw gevouwen pMHC-complexen volgens standaardtechnieken (Ni-NTA-affiniteitschromatografie, MonoQ anionenuitwisselingschromatografie, S200 gelfiltratie).
    3. Wisselen de UV te splitsen peptide met fluorescerende peptide 5, 7.
    4. Zuiveren monomeer fluorescerende pMHC complexen fot slot door S200 gelfiltratie. Een representatief chromatogram wordt getoond in figuur 3.
    5. Controleer kwantitatieve peptide belasting door spectrofotometrie.
    6. WINKEL eiwitten bij -20 ° C in PBS / 50% glycerol.

1,2. Generatie van enkele keten antilichaamfragmenten (SCF V s), de invoering van cysteïnen voor locatie-specifieke labeling

  1. Hervouwen SCF Vs van inclusielichamen tot expressie gebracht in E.coli. Hier is een protocol Tsumoto en collega 8 ontwikkeld gevolgd waarbij inclusielichamen eerst uitgevouwen in 6 M guanidinium chloride, volledig gereduceerde en daarna opnieuw gevouwen in de loop van een week door geleidelijke verlagen van de concentratie van het eiwit ontvouwen guanidinium chloride.
  2. Concentreer je goed gevouwen SCF V met behulp van moleculaire filter units met een moleculaire cutoff van 10 KDa.
  3. Zuiver het concentraat met S200 gelfiltratie.
  4. Label monomeer SCF V in aanwezigheid van 0,05 mM tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) met Alexa Fluor 647 onmiddellijk na zuivering. Voer de labelingsreactie beste bij een molaire verhouding eiwit: kleurstof van niet meer dan 1: 2 bij KT gedurende maximaal 2 uur.
    Opmerking: TCEP is een fosfaat- gebaseerd reductiemiddel en reageert niet met maleimiden bij deze concentraties 9. Het kan derhalve aanwezig gedurende de labelreactie de ongepaarde sulfhydrylgroep verlaagd totdat het reageert met de kleurstof-maleimide derivaat.
  5. Zuiveren gelabelde monomeer SCF V uiteindelijk via S75 gelfiltratie. Een representatief chromatogram wordt getoond in figuur 3.
  6. Bepaal het kleurstof: eiwitverhouding spectrofotometrisch.
  7. WINKEL eiwitten bij -20 ° C in PBS / 50% glycerol.

2. Calcium Flux Metingen

  1. Neem een ​​frisse flacon met 50 ug fura-2-AM en oplossen in 50 ul watervrij DMSO.
  2. Spin down 10 6 T-cellen in een 5 ml polypropyleen ronde bodem buis gedurende 2 minuten bij 250-400 g.
  3. Resuspendeer T-cellen in 200 gl beeldmedium met Hank's gebalanceerde zoutoplossing plus calcium / magnesium en 1% ovalbumine bij kamertemperatuur, voeg 1 pl van de fura-2-AM voorraadoplossing (1: 200 verdunning), meng de celsuspensie en incubeer bij KT 30 min.
  4. Was de T-cellen eenmaal in beeldvorming buffer. Hiervoor vult de buis met de cellen met beeldvormende buffer bij kamertemperatuur en de pellet cellen zoals beschreven in stap 2. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 200 ui buffer imaging (dwz bij een uiteindelijke celdichtheid van 5 x 10 6 cellen ml-1). Cellen kunnen direct worden gebruikt op calcium metingen of opgeslagen op ijs gedurende maximaal 3 uur.
  5. Plaats cellen op een gefunctionaliseerd SLB in beeldvorming buffer (37 ° C). Zodra de T-cellen beginnen met de SLB, het verwerven van de volgende reeks van beelden om de 15 tot 30 sec 30 min:
    excitation bij 340 +/- 5 nm, emissie detectie bij 510 +/- 40 nm
    excitatie bij 380 +/- 5 nm, emissie detectie bij 510 +/- 40 nm
    DIC (optioneel)
    Opmerking: Respectieve belichtingstijd afhankelijk van de intensiteit van het excitatie lichtbron. Bevredigende resultaten worden verkregen wanneer de pixel intensiteiten van 340 nm (380 nm) kanaal bedraagt ​​ongeveer 1 4 (1 helft) van de maximaal mogelijke intensiteitswaarde. Houd in gedachten dat Fura-2 waarden geëxciteerd bij 340 nm zal toenemen en die opgewonden bij 380 nm zal dalen op de T-cel activatie.
  6. 20-25 min in de run, voeg 50-100 ul van voorverwarmde anti-pMHC blokkerende antilichaam bij een uiteindelijke concentratie van 20-50 ug ml -1. Het antilichaam verzadigt al pMHCs en als gevolg daarvan T-cellen ophouden te antigen herkennen en te stoppen fluxering calcium. Verder opnemen van beelden nog eens 5 -. 10 min op de basislijn van de intracellulaire calciumconcentratie, dat overeenkomt met de niet-geactiveerde toestand van de T-cellen te verkrijgen < / li>
  7. Bepaal de gemiddelde achtergrond fluorescentie signaal bij 340 nm en 380 nm excitatie in een gebied van belang van ten minste 1000 pixels, die niet cel bevat. Achtergrond-aftrekken alle gemeten fura-2 beelden geëxciteerd bij 340 nm en 380 nm en 340 nm berekenen / 380 nm intensiteit verhoudingen van afzonderlijke cellen of een groep cellen. Normaliseren intensiteitsverhoudingen door deling alle verhoudingen door de verhouding van de vijf laatste tijdsbestek (bijvoorbeeld met volledige antilichaam-blokkade van de pMHC).
  8. Plot genormaliseerd fura-2 ratio's tegen de tijd. Opmerking: wanneer cellen en dubbellagen zijn in goede staat, Fura-2 340 nm / 380 nm intensiteit ratio's vast te stellen meestal waarden tussen 2 en 5, 15-45 sec na cellen contact met de bilaag hebben gemaakt. Verhoudingen dan vallen op een waarde tussen 1,6 en 2 waar ze constant blijven gedurende ten minste 20 minuten of langer. Waarden moeten dalen tot 1 na toevoeging van anti-pMHC antilichamen. Een typisch voorbeeld wordt getoond in figuur 5.
"> 3. Bulk FRET Metingen

3,1. TCR decoratie met de H57scF V

  1. Spin down 10 6 T-cellen in een 5 ml polypropyleen ronde bodem buis gedurende 2 minuten bij 250-400 g.
  2. Schenk de media, flick de celpellet voorzichtig en voeg 0,3 pl SCF V (concentratie ~ 1 mg / ml) aan de celsuspensie. Voor bulk FRET metingen Employ alleen kleurstof-gelabelde scFv. Voor enkel molecuul FRET metingen maken gebruik van een mix van niet-gemerkte scFv (5-9 delen, bevat geen ongepaarde cysteïne) en kleurstof-gelabelde scFv (1 deel, bevat één ongepaarde-dye gekoppeld cysteïne).
  3. Incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten en was de cellen tweemaal door opeenvolgende centrifugeren met ijskoude beeldvorming buffer.
    Opmerking: Cellen worden op ijs bewaard, zonder significant verlies van gebonden SCF V (t 1/2 SCF V dissociatie bij 0 ° C ~ 4 uur 2). De zuiverheid van primaire T-cellen afkomstig van TCR-transgene (en optioneel ook Rag-1/2 deficiënte muizen) en in vitro gestimuleerd hoger is dan 98%, aangezien T-cellen zijn de enige cellen prolifereren (tot 7 celdelingen) in reactie op het peptide, die is toegevoegd voor stimulatie van de T-celkweek. B-cellen ondergaan apoptose en zijn niet meer in leven na 7-10 dagen van de teelt. Enkele dendritische cellen overleven maar kunnen gemakkelijk worden gediscrimineerd niet alleen vanwege hun verschillende morfologie, maar ook omdat zij de H57 anti-TCR beta scFv fragment binden.

3,2. FRET metingen via donor herstel na acceptor bleken

Opmerking: Houd er rekening mee dat de halfwaardetijd van TCR-H57 SCF V complexen bedraagt ​​4 uur op ijs, 50 minuten bij 22,5 ° C en 6,8 minuten bij 37 ° C (en tot ongeveer 4 uur op ijs) 2. Zolang de SCF H57 V dient als FRET-donor, gemeten FRET opbrengsten zijn niet gevoelig voor H57 SCF V dissociatie echter de signaal-ruisverhouding toeneemtmet verhoogde H57 dissociatie.

  1. Bereid een SLB met AF647 / Cy5-gelabelde pMHCs en ongelabeld ICAM-1 en B7 volgens Axmann et al. 4.
  2. Wisselen de PBS van de beeldvorming kamer met beeldvormende medium dat Hank's Balanced Salt Solution plus calcium / magnesium en 1% ovalbumine. Voor deze pipet 400 ul van beeldvorming buffer in de put, meng zorgvuldig en verwijder 400 ul uit de put. Herhaal deze procedure 3-4 keer. Stel de SLB niet bloot aan de lucht op elk moment.
  3. Plaats de beeldvorming kamer op de microscoop podium en de scherpstelling totdat de fluorescerende (AF647, Cy5) SLB komt in duidelijke mening.
  4. Opgericht TIRF belichting met het vertalen van de gefocusseerde bundel evenwijdig aan de optische as naar de omtrek van focal plane doel is via bewegen van de periscoop het translationele stadium.
  5. Om de excitatie laserstralen in TIRF modus fine-tunen, voegt T-cellen ingericht met AF555 / Cy3 gelabeld SCF V en laat ze af te wikkelen op de SLB. Opmerking: Omstandigheden TIRF verlichting wordt voldaan wanneer de basale cellulaire membraan in beeld naast de SLB en geen andere delen van de cel in zicht bij het scherpstellen omhoog. Indien TIRF niet goed aangepast, delen van de fluorescerende T-cellen plasmamembraan, die niet in contact met de SLB, weergegeven als een ring. Als dit het geval is, passen de laserbundel met de periscoop translationele stadium totdat TIRF verlichting wordt bereikt.
  6. Verwerven van de volgende zes beelden in de aangegeven volgorde en kort na elkaar (Figuur 6):
    (i1, optioneel) wit licht, om een ​​beeld te maken van de cel,
    (i2, optioneel) 647 nm excitatie (laag vermogen) om een ​​beeld van de FRET acceptor nemen (pMHC) voorafgaand aan het bleekmiddel pols,
    (i3) 514 nm excitatie (low power) om een ​​beeld van de FRET donor (TCR) voordat bleekmiddel puls nemen
    (i4) 647 nm excitatie (hoog vermogen) van de foto-bleekwater de FRET acceptor, /> (I5) 514 nm excitatie (laag vermogen) om een ​​beeld van de FRET-donor te nemen (TCR) na het bleekmiddel puls,
    (i6) 647 nm excitatie (low power) tot het volledig FRET acceptor bleken te controleren.
  7. Houd de tijd verstreken tussen de beelden (i3) en (i5) zo kort mogelijk te kunnen de afbeeldingen correleren voor latere analyse. Houd FRET donoren bleken ten minste door gebruik van de excitatie bij de laagst mogelijke vermogensniveau, die nog steeds zorgt voor een goede beeldvorming van de T-cellen.
  8. Kies een interessegebied (ROI), bijvoorbeeld een hele synaps of persoon TCR microcluster Bepaal de gemiddelde intensiteit (i3) (= I (3)) en (i5) (= I (5)). Voor achtergrondinformatie aftrekken, kies een ROI van dezelfde dimensie buiten de verlichting plek in (3) of (5) en zijn bepalend voor de gemiddelde intensiteit (I (achtergrond)). Het bepalen van de FRET opbrengst Voer de volgende bewerking:
    g "/> (vergelijking 7)
    Noot: Opgemerkt wordt dat met betrekking tot de absolute FRET niveau, het nodig kan zijn te corrigeren voor donor bleken tussen afbeeldingen (i5) en (i3).

3,3. FRET metingen via gevoelig emissie

  1. Voer ruimtelijke donor en acceptor kanaal aanpassing aan het gebruik van veelkleurige parels, die fluoresceren in alle emissie kanalen. De ruimtelijke verschuiving tussen de beide kanalen als gevolg van chromatische aberratie kunnen worden bepaald door super-positionering individuele kralen en moet worden toegepast voor het corrigeren van een van de twee kanalen voor alle volgende 2-kleurenbeeld-paren 10.
  2. Bepaal de mate van donor bleedthrough met behulp van een SLB alleen met de FRET-donor fluorofoor. Het is ook mogelijk om FRET-donor-gelabelde T-cellen gebruiken een lipide bilaag met ongelabelde pMHC. Achtergrond wordt eerst bepaald buiten het verlichte gezichtsveld en vervolgens afgetrokken van beide kanalen. Op deze manier de gemiddelde ba -CHTERGROND gecorrigeerde intensiteiten van twee overeenkomstige ROI (ik donor kanaal en ik acceptor kanaal) worden bepaald. Bereken de bleedthrough coëfficiënt (BTC) als volgt:
    figure-protocol-1 (vergelijking 8)
    Opmerking: Deze BTC is een constante voor een bepaalde kleurstof en filterset-combinatie.
  3. Imago van de FRET-donor bleedthrough als volgt berekenen:
    figure-protocol-2 (vergelijking 9)
  4. Bepaal acceptor cross-excitatie door opwekken van een SLB alleen met de FRET acceptor fluorofoor (bijvoorbeeld IE k / MCC-Alexa Fluor 647) eerst met FRET donoren excitatielicht (bijv., 514 nm) en daarna met acceptor excitatielicht (bijvoorbeeld 647 nm). Gebruik-achtergrond afgetrokken beelden binnen de FRET acceptor kanaal naar de cross-excitatie coëfficiënt (CEC) te berekenen als volgt:
    ftp_upload / 53.157 / 53157eq10.jpg "/> (vergelijking 10)
  5. Aangezien de CEC afhankelijk van de laserintensiteit voor donor excitatie, bepaalt het op elke meting dag. Gebruik de resulterende CEC om het beeld uitsluitend gegenereerd door middel van cross-excitatie te berekenen.
    figure-protocol-3 (formule 11)
  6. Bereken de FRET afbeelding gecorrigeerd voor bleedthrough en cross-excitatie als volgt:
    figure-protocol-4 (formule 12)
    Opmerking: Absolute FRET signaal (maar niet de relatieve FRET opbrengst) gevoelig is voor de dissociatie van het H57 SCF V van T-celmembraan gebonden TCR. Om overmatig verlies van de TCR-FRET probe voorkomen, willen metingen bij 37 ° C gedurende de eerste 2 min na de toevoeging van de T-cellen aan de bilaag. Metingen kwantitatieve (≥ 95%) TCR etikettering alleen bij of beneden 22,5 ° C binnen de eerste 3 min natoevoeging van T-cellen om de bilaag.

4. Single Molecule FRET Metingen

  1. Pas de macht van beide lasers te leiden tot een intensiteit van 1-5 kW / um 2 op het monster. Voor meer informatie verwijzen wij u naar Axmann et al. 4.
  2. Label T-cellen zoals hierboven met een mix van ongelabelde SCF V (5-9 delen) en Cy3 /-AF555 gelabeld SCF V (1 deel). Opmerking: deze manier slechts een fractie van TCR is voorzien van het FRET-donor. Dit vermindert het aantal detecteerbare interactie, maar geluid dat door donor bleedthrough ook significant verlaagd (ongeveer 1/2 van de 5 tot 10 1/2), wat essentieel bij sanering van afzonderlijke single molecule FRET events.
    Opmerking: De dissociatie van het H57 scFV probe van de TCR geen invloed op de metingen, zoals het in een veel groter tijdbereik (minuten tot uren) dan de dissociatie van de TCR van SLB-gebonden pMHC (sub-seconde tot secondebereik).
  3. Plaats een SLB met-AF647 gelabeld pMHCs evenals ICAM en B7 op de microscoop podium en de scherpstelling, zodat de bilaag komt in duidelijke mening.
  4. Optioneel: Plaats een spleetvormige opening in de excitatie route (zie Axmann et al. 4) om de meerderheid van het gebied van verlichting maskeren behalve de synaps. Zo ongebleekt IE k / MCC (C) -Alexa Fluor 647 FRET acceptor-moleculen kunnen verplaatsen naar het gebied van verlichting.
  5. Voeg H57 SCF V ingericht T-cellen aan de bilaag (met imaging buffer) en wacht tot synapsen verschijnen in het gezichtsveld.
  6. Neem snel achter elkaar een reeks van 10 tot 20 image sets met behulp van 2-kleuren detectie:
    i1) excitatie 514 nm
    i2) excitatie 647 nm
  7. Expose afbeeldingen 1 tot 5 msec en het verwerven van een reeks beelden.
  8. Om de identiteit van de enkel molecuul beoordelen FRET gebeurtenissen, gelden dezelfde correctie betrekking bleedthrough donor en acceptor cross-excitatie. Bovendien enkel molecuul FRET gebeurtenissen te sluiten bij één acceptor moleculen en moeten verschijnen en verdwijnen in een stap (zie ook figuur 7).
  9. Off-tarief bepalen
    1. Record sporen van enkel molecuul FRET evenementen voor meerdere overname tijdframes.
      Opmerking: In dit voorbeeld (cursief) de off-rate tussen 5c.c7 TCR en IE k / K3 wordt gemeten bij 25 ° C met vier verschillende vertragingstijden (42 ms, 490 ms, 1007 msec, 1989 msec).
    2. Lijst FRET sporen overeenkomstig hun sporen lengte zoals weergegeven in tabel 1.
    3. Zet tabel 1 in een inverse cumulatieve vervalfunctie (tabel 2) zoals getoond (gekleurd getallen zijn afkomstig uit tabel 1).
    4. Aan de verkregen vervalfunctie normaliseren, verdeel het aantal lijnen van tabel 2 door de som van alle sporen in die groep. Plot van de genormaliseerde waarden tegen het aantal termijnen. Wanneer het weglaten van de laatste tijd, dat een nul bevat, kan het verval worden gelezenily uitgerust met een enkele exponentiële functie (figuur 8A).
    5. Zoals getoond in figuur 8B, trek de verwachtingswaarde lag)>, dat wil zeggen de negatieve inverse van de exponent van de vervalfunctie boven tegen de vertragingstijd t lag werkzaam bepaald (in dit voorbeeld: x = t lag = 0,042 s en y = lag)> = 1 / 0,662 = 1,511, x = 0,49 s en y = 1 / 0,902 = 1,101, x = 1,007 en y = 1 / 1,131 = 0,884, x = 1,989 s en y = 1 / 1,591 = 0,629).
    6. Fit τ uit en bleken> op basis van vergelijking 3. Dit kan worden gedaan met behulp van een niet-lineaire fitting functie van een wetenschappelijke data-analyse programma zoals Origin.
      Opmerking: De best fit in dit voorbeeld levert een τ off van 2,12 +/- 0,23 s en bleken> van 1,53 +/- 0,06 sec.
    7. Bereken de half leven van de interactie t 1/2 off met t 1/2 off = τ uit • ln (2) (in dit voorbeeld: 1.47 s).
  10. 2D-K D vastberadenheid
    1. Bepaal de conversiefactor C de FRET Kleurstofpaar toegepast met gebruik van vergelijking 6 en zoals hierboven beschreven (Figuur 4A).
    2. Bepaal de FRET opbrengsten voor individuele TCR microclusters of hele synapsen (Figuren 3B en 5).
    3. Met behulp van vergelijking 4 bekeerling alle individuele FRET opbrengsten in TCR bezettingsgraden (Figuur 4C).
    4. Solliciteer vergelijking 11 om alle TCR bezettingsgraad in 2D-K D s te zetten. Zoals hieronder aangegeven, synaptische binding inhomogeen. Een zinvolle maatregel voor synaptische K D s is de mediaan (in rood aangegeven) van alle gemeten microclusters (figuur 4D).
  11. Berekening van 2D-k op s
    1. Bereken k op de wet van massa-actie met k op = k off / K D en de experimenteel bepaalde k uit en K D waarden.
      Opmerking: De synaptische k uit het experiment weergegeven in       figuur 4 (IE k / MCC interactie met TCR 5c.c7 bij 25 ° C) 0,41 s -1. Vandaar de KD grafiek (figuur 4D) kunnen worden omgezet in ak Plot zoals weergegeven in figuur 4E.

Resultaten

De opname van intracellulair calcium via de fura-2 calcium kleurstof en de daaropvolgende cellulaire analyse om de stimulerende vermogen en dus functionaliteit van SLBs zijn weergegeven in figuur 4 te verifiëren. Zoals duidelijk wordt, calcium stijgt in T-cellen (uitgedrukt als de genormaliseerd fura-2 340nm / 380nm-verhouding met een uitgangswaarde van zijn 1) onmiddellijk zodra ze vestigen op de stimulerende SLBs. Calciumspiegels terug naar basisniveaus kort na de toevoeging van een antilichaam dat blokken pMHCs van TCR betrokkenheid en die eindigt T-celactivering.

Figuur 6 toont een typisch experiment met FRET donor acceptor herstel na bleken, dat wordt toegepast om FRET opbrengsten meten en die dient om 2D-KD-waarden te berekenen (zie figuur 4). Let op: de toename van FRET donor intensiteit, die TCR vertegenwoordigt het label via AF555, na een snelle en volledige ablatie van de FRET eencceptor soorten (hier: AF647 geassocieerd met pMHCs). Ook duidelijk is de sterke daling van de FRET-kanaal, dat wil zeggen, de FRET-acceptor kanaal onder FRET donor excitatie, na FRET acceptor bleken. De nauwelijks zichtbare resterende signaal overeenkomt met donor bleedthrough FRET. FRET opbrengsten binnen afzonderlijke TCR microclusters of hele synapsen zijn berekend op basis van de vermelde gemeten intensiteitswaarden (figuur 6B).

Figuur 7 toont een traject en de tijdspanne van een enkel molecuul FRET evenement zichtbaar in twee termijnen. Zoals hierboven uiteengezet in de inleiding dergelijk gedrag wordt veroorzaakt door zowel verval van synaptische TCR-pMHC binding en fotobleken. Om onderscheid tussen deze twee bijdragen, de experimentele acquisitietijd frames moeten worden gevarieerd duration: terwijl fotobleken blijft constant worden veranderingen in FRET geval trajectlengte alleen veroorzaakt door de binding kinetiek. Een kwantificering van tracelengths, w hich vormt de basis voor de berekening van de off-rates en bleken figuur 7, zijn in de tabellen 1-3.

Bepaling van de 2D-K D s vereist registratie van bulk FRET opbrengsten van FRET-donor label TCRs. Met het gebruik van de experimenteel afgeleide constante C (figuur 4), kan een FRET rendement gemeten voor TCR microcluster of een hele synaps omgerekend in de TCR bezetting een, dat wil zeggen de verhouding tussen pMHC-actief en totaal TCR (figuur 4C) . Bij bekende pMHC dichtheden aanwezig op de SLB vóór toevoeging van de T-cel kan een waarde worden toegepast synaptische 2D-KD-waarden (Figuur 4D) te bepalen. On-tarieven kunnen worden berekend met de wet van de massa-actie (2D-k op = 2D-k off / 2D-K D) van de bepaald synaptische off-rate en 2D-KD waarden.

1 "src =" / files / ftp_upload / 53.157 / 53157fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische omtrek van het vlakke glas ondersteunde lipide dubbellaag (SLB) systeem. (A) SLBs zijn samengesteld uit POPC (90-99%) en de synthetische lipide DGS Ni-NTA (1-10%) en vormen spontaan als schone glazen oppervlakken zijn geladen met kleine unilamellaire blaasjes (SUV's), bestaande uit de overeenkomstige lipiden. (B) Eenmaal gevormd, kunnen dergelijke SLBs worden gefunctionaliseerd met oplosbare polyhistidine tag extracellulaire delen afgeleid van pMHCs, costimulatoire B7-1 en ICAM-eiwitten 1 adhesie-eiwitten, om te dienen als APCs om T-cellen. Voor meer informatie over het voorbereiden SLBs verwijzen naar Axmann et al. 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-1
Figu Ad 2. Förster Resonance Energy Transfer-gebaseerde test te kwantificeren TCR-pMHC binding in situ. (A) een samengestelde structuur van een TCR complex met H57 enkele keten fragment aangrijpen van een pMHC illustreert de FRET-gebaseerde benadering hierin beschreven. Let op de korte afstand van ongeveer 41A scheiden van de twee bijbehorende fluoroforen ondergaan FRET. Acceptorplaatsen voor fluorofoor-maleïmiden zijn aangegeven in groen en rood. (B) Het principe van het detecteren van TCR-pMHC interacties in situ geïllustreerd. Alleen SCF V -Versierde TCRs en pMHCs (hier IE k), welke specifieke complexen te vormen, geven aanleiding tot een meetbare FRET signaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

"/>
Figuur 3. Chromatogrammen van de uiteindelijke gelfiltratiestap die tot monomere SCF Vs en met peptide beladen IE k -2x6H moleculen. X-as vertegenwoordigt retentievolume in ml, Y-as geven absorptie bij 280 nm in willekeurige eenheden (AU) . (A) H57 SCF V plaatsspecifiek gelabeld met Alexa Fluor 555 maleïmide werd onderworpen aan chromatografie S75 ongereageerde kleurstof scheiden van het proteïne (stap 1.2.5). Fracties die overeenkomt met retentie interval van 14 tot 15 ml (stippellijnen) vertegenwoordigen gelabelde monomeer H57 SCF V. (B) IE k -2x6H moleculen complex vormt met de UV-kliefbare ANP-ruimte houder peptide had UV bestraald geweest, geïncubeerd met plaatsspecifiek Alex 647-maleïmide gemerkt peptide en uiteindelijk onderworpen aan S200 chromatografie om het proteïne te scheiden van vrij peptide (stap 1.1.2.4). Het interval tussen de streeplijnen bevat juiste wijze gevouwen en monomere pMHCs. (A, B) 0,7 ml monster werd op de kolom gebracht bij het begin van de rum (0 ml punt). De verzamelde fracties werden geconcentreerd. Het eiwit-to-dye-verhouding werd bepaald door photospectrometry voorafgaand aan dialyse tegen PBS / 50% glycerol (voor opslag bij -20 °). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4. Bepaling 2D-K Ds en 2D-k on s. (A) De correlatie tussen de FRET opbrengst zoals bepaald door donor acceptor herstel na bleken en TCR bezetting experimenteel gemeten. TCR bezetting kan worden bepaald voor individuele TCR microclusters zoals uitgelegd in paragraaf 4.2. Een lineaire aanpassing van de gegevens wordt weergegeven door een lijn, waarvan de helling is gelijk aan de verhouding C tussen TCRbezetting en de FRET opbrengst. C een constante is specifiek voor het FRET-systeem en de fluoroforen (Cy3 en Cy5 here) toegepast. In dit voorbeeld leverde 1,988. (B) FRET opbrengstgegevens werden voor individuele TCR microclusters (N = 187, temperatuur = 24 ° C) tot herstel van donor acceptor bleken. Getallen onder histogram balken geven de bovengrens binnen het interval. (C) Conversie van de in (B) gegevens door vermenigvuldiging gemeten FRET opbrengsten met de constante C bepaald (A). Getallen onder balken geven de bovengrens binnen het interval. (D) Histogram (semi-logaritmische, base = 4) die de verdeling van de 2D-K D s gemeten voor individuele TCR microclusters. De mediane 2D-K D is aangegeven in blauw. Getallen onder balken geven de bovengrens in het interval. (E) De in (D) histogram omgezet into 2D-k op -histogram (semi-logaritmische, base = 4) in dienst van de synaptische k off voor de 24 ° C (0,41 s -1). De vastgestelde mediane 2D-k op waarde wordt aangegeven in het blauw. De gegevens werden oorspronkelijk gepubliceerd in Huppa et al. 2 en worden hier gevisualiseerd in een nieuw formaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 5. Functionele validering van SLBs toegepast voor T-cel stimulatie en imaging. (A) TCR-transgene T-cel ontploffing geladen met Fura-2 werden geconfronteerd met stimulerende SLB herbergen antigene pMHCs, ICAM-1 en B-7. Cellular fura-2 emissie geëxciteerd bij 340 nm en 380 nm en DIC afbeeldingen opgenomen. Zoals aangegeven waarden verhouding van de emissie intensiteiten geëxciteerd bij 340 en 380 nm worden getoond in het rechter paneel. Toevoeging van pMHC blokkerende antilichamen 14 min in de experimentele run resulteerde in een afname van de intracellulaire calciumconcentratie die vergelijkbaar zijn met die van rustende T-cellen. (B) Een typische tijdsprofiel van de gemiddelde fura-2's in T-cellen in contact brengen stimulerende SLBs kenmerkt door een aanvankelijke stijging van intracellulair calcium die 2 tot 4 keer hoger in vergelijking met die van niet-geactiveerde T-cellen of T-cellen verstoken van antigeen na antilichaam-bemiddelde blokkade. Groene cirkels geven tijdstippen getoond in (A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 6. Bulk FRET opbrengsten zoals gemeten door middel van FRET donor herstel na FRET acceptor bleken. (A) Getoond wordt een voorbeeld van een typische synaptische FRET-meting. Zoals is aangegeven op de linker- en op de top van een reeks beelden werd opgedaan met het gebruik van een emissie straalsplitser die aanleiding geven tot een FRET-donor en een FRET acceptor kanaal (voor meer gedetailleerde informatie over bundelsplitsers verwijzen naar Axmann et al 4). De in het linker beeld DIC lijn geeft de grens van het T-cel synaps. Let verlies in intensiteit binnen de FRET acceptor kanaal en de toename van de intensiteit van de FRET-donor kanaal na FRET acceptor bleken (stap 4). (B) FRET-efficiëntie kan worden gekwantificeerd als vermeld voor afzonderlijke synaptische regio of gehele synapsen. Voor inspectie, worden de beelden voor en na FRET acceptor bleken getoond met het gebruik van twee opzoektabellen (LUT, groen en natuurkunde). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 7. Single molecule FRET gebeurtenissen verschijnen en verdwijnen insingle stappen en zijn perfect afgestemd op een enkele FRET acceptorfluorofoor. De tijdspanne van de enkel molecuul FRET gebeurtenis wordt getoond. Beelden werden verkregen met behulp van een back-verlichte EMCCD camera. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 8. Het bepalen van τ off = 1 / k off van gemeten smFRET trajecten. (A) De genormaliseerde cumulatieve sommen waarneembare FRET-signalen (afgeleid van H57 SCF V -AF555 ingericht 5c.c7 TCR transgene T-cel ontploffing herkennen IE k / K3-AF647 bij 24 ° C) gedurende vier verschillende tijdvertragingen (42 ms, 490 ms, 1007 msec, 1989 msec) werden uitgezet als een functie van het totale aantal waarnemingen. Mono-exponentiële fit functies aanleiding geven tot overeenkomstige de negatieve inverse van de verwachting waarden lag)>. (B) Verwachting waarden werden uitgezet tegen vertragingen t lag en gemonteerd met behulp van vergelijking lag)> = τ uit / {(T off / bleken>) + t lag} om τ opbrengst uit en bleken>. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Meten van eiwit-eiwit interacties in situ zeer gewenst vooral dan wanneer het lage affiniteit interacties zoals TCR-pMHC-bindende 11. Dit is omdat de aan-snelheid en de stabiliteit van dergelijke interacties significant beïnvloed door de bijzondere omstandigheden waarin binding plaatsvindt. Minimaal-invasieve-FRET gebaseerde beeldvorming benaderingen zijn dus in principe perfect geschikt voor dergelijke taken, maar omvatten een aantal hindernissen die eerst moeten worden overwonnen. Geluid van cellulaire autofluorescentie beperkt de gevoeligheid van de metingen en derhalve tot een minimum worden beperkt. TIRF microscopie dient deze behoefte goed 12 maar vereist de functionalisering van glazen objectglaasjes, bij voorkeur in de vorm van een vlakke glazen ondersteunde lipide dubbellaag ingericht eiwitten keuze 13-15. Een ander voordeel van een gedeeltelijk reconstitutive aanpak is dat recombinant tweelaags-resident FRET partners veel m kan zijnerts gemakkelijk geëtiketteerd kwantitatief, plaatsspecifieke en rationele wijze met kleiner en lichter fluoroforen dan mogelijk zou zijn met celoppervlak eiwitten. TCR's worden gelabeld met recombinant SCF Vs, die geen invloed T-cel herkenning, zoals hiervoor 2 getest. Bovendien is de eiwitsamenstelling van de SLB, bijvoorbeeld de dichtheid van pMHCs en de keuze van accessoire factoren kan worden aangepast aan de eigen behoeften. We hebben eerder uitgevoerde experimenten met verschillende dichtheden van stimulerende pMHCs, maar significante verschillen in 2D-k off en 2D-K D 2 niet hebben ontdekt.

Zo ver hier de erkenning van MHC klasse II moleculen is behandeld slechts, vooral vanwege de aard van hun peptidebinding spleet, die aan beide uiteinden open is en biedt dus grotere peptiden met een linker voor fluorofoor bevestiging. In sommige gevallen kan een dergelijke aanpak ook werken voor de etikettering MHC class I moleculen 16 maar grote voorzichtigheid moeten worden genomen om het gebruik ervan in experimenten te controleren. De gevoeligheid van T-cellen aan antigenen die kunnen worden gemeten via T-celproliferatiebepalingen, evenals het pMHC-TCR bindingskinetiek zoals in vitro gemeten door oppervlakte plasmon resonantie niet worden beïnvloed door de toevoeging van de linker en fluorofoor het peptide. Alternatief MHC klasse I moleculen zelf kan worden in een plaatsspecifieke wijze met de introductie van een ongepaard cysteïne binnen de sequentie van de zware keten (ongepubliceerde observaties) gemerkt.

Bij het gebruik van geschikte moleculaire probes elk synaptisch eiwit-eiwit interacties kunnen in principe worden onderzocht op een wijze die hierin is beschreven. Dergelijke sondes, bijvoorbeeld, moet SCF V s of Ontworpen Ankyrine Herhaal Eiwitten (DARPins) 17, monovalent en moeten hun doelgroep stabiel zonder dat de interactie van belang te binden. Natuurlijk structurele information is zeer wenselijk voor rationeel ontwerp probe maar niet absoluut noodzakelijk. Bij de oprichting van een nieuw paar FRET partners, is het raadzaam om op te nemen en te analyseren FRET in bulk als eerste. Sites van label bevestiging kan aanzienlijk worden gevarieerd om de FRET signaal te maximaliseren en ook om te verifiëren dat gemeten FRET rendementen verschillen op basis van de inter-dye afstand. Zodra het systeem is geoptimaliseerd, enkel molecuul FRET-signalen kunnen worden opgenomen door de etikettering van de hoge overvloed FRET partner te beperken tot 10-30% en bleken de lage overvloed FRET partner tot enkele moleculen oplosbaar zijn op het gebied van verlichting.

Tenslotte zij opgemerkt dat SLBs benadering sommige maar niet alle aspecten van fysiologische plasmamembraan. Eigenschappen zoals membraan kromming en flexibiliteit domein compartimentering, herschikkingen van het cytoskelet en celmotiliteit en grote variëteit oppervlak tot expressie membraaneiwitten zijn die niet door SLBs maar zou t beïnvloedenhij verwerken in onderzoek. Veel inspanning zal moeten worden geïnvesteerd om beeldvormende technieken die het mogelijk maken de controle op eiwit-eiwit-interacties met 'single molecule resolutie in fysiologische synapsen, die niet toegankelijk zijn voor TIRF beeldvorming zijn vast te stellen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

MA werd ondersteund door een Schrödinger gemeenschap van de Oostenrijkse Science Fonds (FWF, J3086-B11) en dankzij het Max-Planck-Maatschappij voor financiële en administratieve ondersteuning. GS en JH werden ondersteund door de Wenen Science and Technology Fund (WWTF, LS13-030).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
LB-mediaFisher Scientific10000713bacteriële expressie
Sf900 IILife Technologies10227402insect cel media voor baculo virus productie
Insect-XPRESS met L-glutamine (Lonza)Fisher Scientific10564038insect cel media voor baculo virus expressie
Sf9 cellenLife Technologies11496-015cellen voor virus productie en expansie
High Five CellenLife TechnologiesB855-02cellen voor potein expressie
LB-mediaFisher Scientific10000713bacteriële expressie
Centramate SystemPalleiwitconcentratie uit grote volumes
Centramate cassette 10kDa cutoffPallOS010T12eiwitconcentratie uit grote volumes
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeUFC900308eiwitconcentratie
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeUFC800308eiwitconcentratie
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mLEMD Millipore5123eiwitconcentratie
Äkta pure 25LGE Healthcare29-0182-24eiwitzuivering
Superdex 200 10/300 GLGE Healthcare17-5175-01eiwitzuivering
Superdex 75 10/300 GLGE Healthcare17-5174-01eiwitzuivering
Mono Q 5/50GLGE Healthcare17-5166-01eiwitzuivering
Ni Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare17-5318-01eiwitzuivering
Tricorn 10/20 kolomGE Healthcare28-4064-13eiwitzuivering
Gilson HPLC systeemGilsonzuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden
Pursuit XRs C18, 5 µm deeltjesgrootte, 21.2*250mm kolom grootteAgilentA6000250X212zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden
Pursuit XRs C18, 5 µm deeltjesgrootte, 21.2*50 mm kolom grootteAgilentA6000050G212zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden
Tricorn 10/20 kolom GE Healthcare28-4064-13eiwitzuivering
Gilson HPLC systeemGilsonzuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden
Pursuit XRs C18, 5 µm deeltjesgrootte, 21.2*250mm kolom grootteAgilentA6000250X212zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden
Pursuit XRs C18, 5 µm deeltjesgrootte, 21.2*50 mm kolom grootteAgilentA6000050G212zuivering van fluorochroom-gekoppelde peptiden
Cy3 maleimideGE HealthcarePA23031plaatsspecifiek eiwitlabeling via mutant ongepaarde cysteïnen
Cy5 maleimideGE HealthcarePA25031plaatsspecifiek eiwitlabeling via mutant ongepaarde cysteïnen
Alexa Fluor 555 C2 MaleimideLife TechnologiesA-20346plaatsspecifiek eiwitlabeling via mutant ongepaarde cysteïnen
Alexa Fluor 647 C2 MaleimideLife TechnologiesA-20347plaatsspecifiek eiwitlabeling via mutant ongepaarde cysteïnen
Fura-2, AM, celdoorlatendLife TechnologiesF-1221calciumgevoelige kleurstof voor cellabeling
dimethyl sulfaatSigma Aldrich151874voor het oplossen van fura-2 am
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesiumFisher Scientific10225362beeldvorming buffer
PBSLife Technologies14190-136
Bovine Serum Albumine gelyofiliseerd poederSigma AldrichA2153supplement voor beeldvorming buffer
14-4-4S antilichaamaffimetrix eBioscience14-5980-81blokkerend antilichaam voor H2-I-Ek (herkend door de 5c.c7, 2B4 en AND TCR)
5 ml polypropyleen ronde bodembuisBecton DickinsonFALCON 352063
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unitEMD MilliporeUFC30GV0S
Spuitfilter 0.2µmMilliporeGVWP04700
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blauw/groen/oranje/donker roodLife technologiesT-7279
Microscoop voor fura-2-gebaseerde calciummetingen LEICADMI4000B
Microscoop voor (enkele molecuul) FRET metingenLEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUSvoor details verwijs naar parallelle JoVE bijdrage door Axmann et al.
planair ondersteunde lipide bilayersvoor details verwijs naar parallelle JoVE bijdrage door Axmann et al.
RPMI 1640, met L-GlutamineLife Technologies11554416T-cel media
niet-essentieel aminozuur 100XHycloneSH30238.01T-cel media supplement
penicilline/streptomycine/L-glutamine 100xLife Technologies12000226T-cel media supplement
2-mercaptoethanolSigma AldrichM6250T-cel media supplement
muis interleukin-2 recombinant eiwitBPS Bioscience90185-BT-cel media supplement
Research Grade Foetale RundserumHycloneSV30160.03T-cel media supplement
Origin (analyse programma)OrigenLabhttp://www.originlab.com/niet-lineaire fitting van twee parameters (tauoff, [ntlag])

Referenties

  1. Garcia, K. C., Adams, J. J., Feng, D., Ely, L. K. The molecular basis of TCR germline bias for MHC is surprisingly simple. Nat Immunol.. 10, 143-147 (2009).
  2. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature.. 463, 963-967 (2010).
  3. Huppa, J. B., Davis, M. M. The interdisciplinary science of T-cell recognition. Advances in immunology.. 119, 1-50 (2013).
  4. Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Single Molecule Microscopy on Planar Supported Bilayers. Journal of Vizualized Experiments J. Vis. Exp.. 101, e53158(2015).
  5. Xie, J., et al. Photocrosslinkable pMHC monomers stain T cells specifically and cause ligand-bound TCRs to be preferentially transported to the cSMAC. Nat Immunol. 13, 674-680 (2012).
  6. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat Biotechnol. 21, 1387-1395 (2003).
  7. Toebes, M., et al. Design and use of conditional MHC class I ligands. Nat Med. 12, 246-251 (2006).
  8. Tsumoto, K., et al. Highly efficient recovery of functional single-chain Fv fragments from inclusion bodies overexpressed in Escherichia coli by controlled introduction of oxidizing reagent--application to a human single-chain Fv fragment. J Immunol Methods. 219, 119-129 (1998).
  9. Ruegg, U. T., Rudinger, J. Reductive cleavage of cystine disulfides with tributylphosphine. Methods Enzymol. 47, 111-116 (1977).
  10. Ruprecht, V., Brameshuber, M., Schütz, G. J. Two-color single molecule tracking combined with photobleaching for the detection of rare molecular interactions in fluid biomembranes. Soft Matter. 6, 568-581 (2010).
  11. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Davis, M. M., Zhu, C. Identification of self through two-dimensional chemistry and synapses. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 133-157 (2001).
  12. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
  13. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  14. Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 20296-20301 (2007).
  15. Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
  16. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nat Immunol. 5, 524-530 (2004).
  17. Binz, H. K., Stumpp, M. T., Forrer, P., Amstutz, P., Pluckthun, A. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins. J Mol Biol. 332, 489-503 (2003).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FRET microscopiesingle molecule FRETondersteunde lipide dubbellaagT celreceptorpeptide MHC complexbindingskinetiektotale interne reflectiefluorescentiemicroscopiesynaptische dissociatieconstante

Gerelateerde artikelen