Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

Simon W. Fellgett; Simon A. Ramsbottom; Richard J. Maguire; Stephen Cross; Peter O'Toole; Mary E. Pownall

doi:10.3791/53162

Methodenartikel

Met behulp van confocale Analyse

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53162

⸱

14 december 2015

Simon W. Fellgett¹ , Simon A. Ramsbottom² , Richard J. Maguire³ , Stephen Cross⁴ , Peter O'Toole⁵ , Mary E. Pownall⁵

¹Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, ²Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, ³Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, ⁴School of Biochemistry, University of Bristol, ⁵Biology Department, University of York

In dit artikel

Samenvatting

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor liganden verdeeld over een gebied van cellen zichtbaar. Het gemak van exogene eiwitten tot expressie brengen, samen met de grote omvang van de cellen in vroege embryo, maak Xenopus laevis een bruikbaar model voor het visualiseren van GFP-gelabeld liganden. Synthetisch mRNA's efficiënt worden omgezet na injectie in vroeg stadium Xenopus embryo en injecties kunnen worden gericht op een cel. In combinatie met een afstamming tracer bijvoorbeeld membraan gebonden RFP, kan de geïnjecteerde cellen (en het nageslacht) die produceren het eiwit tot overexpressie goed te volgen. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de bereiding van fluorescent gelabeld Shh en Wnt liganden van geïnjecteerde mRNA. De methoden omvatten het micro dissectie van ectodermale explantaten (dierlijke caps) en de analyse van de ligand diffusie in meerdere monsters. Via confocale beeldvorming kan informatie over ligand secretie en diffusie over een gebied van cellen verkregen. Statistische analyses van confocale beelden te leveren kwantitatieve gegevens over de vorm van ligand gradiënten. Deze werkwijzen kunnen nuttig voor onderzoekers die willen het effect van factoren die de vorm van morfogeen gradiënten kunnen reguleren testen.

Inleiding

Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, worden de cellen progressief inzetten voor specifieke lijnen van differentiatie te volgen: dit betekent een groep totipotent (of pluripotente cellen) worden geleidelijk beperkt tot de oprichting van populaties van voorlopercellen vastbesloten om tot één type cel geven. Cel-cel signalering staat centraal in de regulering van afstamming specificatie tijdens de embryonale ontwikkeling. Manipulatie van deze signalen zullen moeten richten stamcellen richting bepaald lot tot nieuwe medische behandelingen steunen.

Een relatief klein aantal signaalwegen worden herhaald tijdens de ontwikkeling en trajecte....