Methodenartikel

Met behulp van confocale Analyse

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53162

⸱

14 december 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

In dit artikel

Samenvatting

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor liganden verdeeld over een gebied van cellen zichtbaar. Het gemak van exogene eiwitten tot expressie brengen, samen met de grote omvang van de cellen in vroege embryo, maak Xenopus laevis een bruikbaar model voor het visualiseren van GFP-gelabeld liganden. Synthetisch mRNA's efficiënt worden omgezet na injectie in vroeg stadium Xenopus embryo en injecties kunnen worden gericht op een cel. In combinatie met een afstamming tracer bijvoorbeeld membraan gebonden RFP, kan de geïnjecteerde cellen (en het nageslacht) die produceren het eiwit tot overexpressie goed te volgen. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de bereiding van fluorescent gelabeld Shh en Wnt liganden van geïnjecteerde mRNA. De methoden omvatten het micro dissectie van ectodermale explantaten (dierlijke caps) en de analyse van de ligand diffusie in meerdere monsters. Via confocale beeldvorming kan informatie over ligand secretie en diffusie over een gebied van cellen verkregen. Statistische analyses van confocale beelden te leveren kwantitatieve gegevens over de vorm van ligand gradiënten. Deze werkwijzen kunnen nuttig voor onderzoekers die willen het effect van factoren die de vorm van morfogeen gradiënten kunnen reguleren testen.

Inleiding

Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, worden de cellen progressief inzetten voor specifieke lijnen van differentiatie te volgen: dit betekent een groep totipotent (of pluripotente cellen) worden geleidelijk beperkt tot de oprichting van populaties van voorlopercellen vastbesloten om tot één type cel geven. Cel-cel signalering staat centraal in de regulering van afstamming specificatie tijdens de embryonale ontwikkeling. Manipulatie van deze signalen zullen moeten richten stamcellen richting bepaald lot tot nieuwe medische behandelingen steunen.

Een relatief klein aantal signaalwegen worden herhaald tijdens de ontwikkeling en trajecten reageren op de TGF superfamilie (nodals en BMPs) 1-2, FGF 3, Wnts 4 en 5 egels. Deze uitgescheiden eiwitten binden receptoren aanwezig op het celmembraan signaaltransductie waardoor genexpressie en / of celgedrag wijzigen activeren. De strakke regulering van cel tekenAlling is essentieel voor cellijn specificatie en normale ontwikkeling. Terwijl de overspraak tussen deze trajecten is belangrijk bij het bepalen lot van de cel kan één ligand zelf opwekken afzonderlijke responsen bij verschillende concentraties. Morfogen gradiënten werden meer dan 100 jaar geleden beschreven als een theorie uit te leggen hoe de verschillende celtypes kan voortvloeien uit een gebied van 6 cellen. Signalering moleculen geproduceerd door een groep cellen kan diffunderen over een bepaald bereik, afnemende concentratie met een grotere afstand tot de bron. Cellen blootgesteld aan het signaal reageert op de lokale concentratie hun positie op het gebied van de cellen met cellen op verschillende plaatsen verschillend reageren op verschillende niveaus van het signaal. Bewijs voor het bestaan ​​van morfogenen komt uit studies van de vroege Drosophila embryo 7 en de vleugel schijf 8, alsmede de vertebraat ledemaat 9 en 10 neurale buis.

Methoden nodig om inMaastricht onderzoek hoe morfogen hellingen worden vastgesteld en aan andere moleculen belangrijk in het reguleren van deze gradiënten identificeren. Elegante experimenten met immunohistochemie endogene eiwitten te visualiseren in vivo in de context van verschillende genetische achtergronden werden gebruikt om morfogeen gradiënten 11-12 onderzoeken. Echter, goede antilichamen en specifieke mutanten zijn niet altijd beschikbaar, dus we beschrijven hier een protocol via overexpressie van fluorescente liganden in Xenopus, een alternatieve, eenvoudige methode te ontleden hoe exogene genproducten over een gebied van cellen verdeling van liganden beïnvloeden verschaffen. Xenopus laevis biedt een uitstekend systeem om dit soort experimenten te ondernemen als hun embryo's te ontwikkelen extern, zodat ze toegankelijk zijn in de vroegste stadia. Hun grote omvang (1-1.5mm diameter) vereenvoudigt micro-injectie en chirurgische manipulatie en door blastula stadia van de cellen zijn gemakkelijk te afbeelding als ze zijn nog steeds relatief groot (ongeveer 2081; m doorsnee). Overexpressie studies in Xenopus zijn eenvoudig te doen: mRNA geïnjecteerd in het vroege embryo kan worden gericht op specifieke cellen en efficiënt vertaald.

De fluorescent gelabeld Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP-constructen werden gegenereerd met behulp pCS2 Wnt8a HA-13, pCS2 Wnt11b HA-14 en eGFP. De HA peptide van belang op te nemen, niet alleen een extra moleculaire merker te verschaffen, maar ook omdat men denkt dat fungeren als afstandhouder scheiden van de Wnt en eGFP eiwitten waardoor beide genproducten functioneren. Het construct gebruikt voor het visualiseren van Shh is eerder gebruikt om expressie van een transgene muis een Shh-eGFP fusieproteïne 15 genereren; Dit werd vriendelijk verschaft door Andy McMahon. Belangrijk is dat de GFP-tag van alle constructen gekloneerd 3 om de signaalsequentie zodat wordt behouden na verwerking. Het is ook essentieel dat de uiteindelijke eiwit bevat sequenties die vereist zijn voor modificaties, zoals de addition lipiden zoals het geval is voor Shh en Wnt ligands.The cDNAs werden gesubkloneerd in de pCS2 + expressievector die is geoptimaliseerd voor het prodution synthetische mRNA; deze een SP6 promoter en polyadenylatiesignaal (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

De hier beschreven werk biedt een eenvoudig protocol voor het vergelijken van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabeld Wnt en Shh gelabeld liganden. Door het injecteren van gedefinieerde hoeveelheden synthetische mRNA, het protocol circumnavigates problemen geassocieerd met variabele expressie van verschillende vectoren met verschillende promotors. Deze werkwijzen zijn onlangs toegepast om de effecten van de heparan sulfaat endosulfatase Sulf1 op Shh-eGFP en Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP secretie en diffusie in Xenopus 16-17 onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethische verklaring: Animal experimenten werden onder een Britse Home office licentie gedaan om MEP en de experimenten uitgevoerd werd in overeenstemming met de KOMEN door de Universiteit van York ethische commissie goedgekeurd (Animal Research: Melding van in vivo experimenten) richtlijnen. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Strategie te genereren fluorescent Tagged Ligands

Hieronder is een voorbeeld protocol voor subklonering Wnt8a-HA en eGFP in pCS2, teneinde produceren in frame fusieconstruct Wnta-HA-eGFP:

  1. Het opzetten en uitvoeren van PCR-reacties voor Wnt8a-HA en eGFP. Met de primer informatie in Tabel 1 en Voorbeeld PCR reactie en voorbeeld PCR-omstandigheden weergegeven in Tabel 2. Opmerking: Template DNA zal variëren afhankelijk van het construct geproduceerd, in dit voorbeeld, wordt Wnt8a-HA gebruikt als matrijs DNA.
  2. Opruimen PCR-reacties met behulp van een gelextractiekit, presteren uiteindelijke elutie in 30μl van moleculair-biologische kwaliteit water.
  3. Controle 2 pi PCR product op een 1% agarosegel in TAE bereid.
  4. Digest Wnt8a-HA en eGFP PCR-producten en pCS2 met de juiste restrictie-enzymen (zie tabel 1), het opzetten van reacties zoals beschreven in tabel 2 (voorbeeld PCR product digest).
  5. Incubeer reacties voor 3 uur bij 37 ° C en vervolgens Wnt8a-HA en GFP-PCR producten op te slaan op ijs.
  6. 1 pl kalf intestinale alkalische fosfatase (CAIP) Naar pCS2 verteren en incubeer gedurende 6 min bij 37 ° C.
  7. Heat inactiveren CAIP door incubatie gedurende 15 min bij 65 ° C.
  8. Run pCS2 en PCR verteert op een 1% ultrazuivere agarosegel in TAE bereid.
  9. Gel extract en opruimen pCS2 en PCR-producten met behulp van een gelextractiekit, presteren uiteindelijke elutie in 30 pl van moleculair-biologische kwaliteit water.
  10. Opgericht ligatie zoals beschreven in tabel 2 (voorbeeld T4 ligatie) en incubeer bij 12 ° C gedurende 16 uur.

2. mRNA synthese: genereren van de Template

  1. Produceren sjablonen met restrictie-enzym vertering van de volgende plasmiden (alle in de expressie vector pCS2): membraan-Cerulean (memCerulean), membraan-RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Opgericht restrictiedigesten zoals beschreven in tabel 2 (voorbeeld template digest).
    2. Meng voorzichtig en incubeer de reacties 2 uur bij 37 ° C.
  2. Run 2,5 ul van verteerd plasmide op een 1% agarosegel (TAE) om te controleren of de reactie is teruggebracht tot voltooiing.
  3. Het schoonmaken van de verteert met een gelextractiekit, presteren uiteindelijke elutie in 50 ul van moleculair-biologische kwaliteit water.

3. mRNA synthese: In Vitro Transcription

  1. Synthetiseren functionele mRNA met behulp van het SP6 mRNA transcriptie kit. Monteer de reacties in 1,5 ml DNAse / RNAse gratis microcentrifugebuisjes.
  2. Het opzetten van mRNA transcriptie reacties zoals beschreven in tabel 2 (voorbeeld van mRNA-synthese).
  3. Meng dereacties voorzichtig met een pipet en incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur.
  4. Controleer 1 ul van het reactiemengsel op een 2% agarosegel (TAE).
  5. Voeg 1 ul van DNAse voor de reactie meng voorzichtig met P20 en incubeer de reactie nog eens 15 min bij 37 ° C.
  6. Voeg 340 ul van moleculaire kwaliteit water, 40 ui ammoniumacetaat en 400 ui fenol-chloroform om de reactie. Vortex de reacties gedurende 30 sec.
  7. Draai het mRNA voor 5 min, 14.000 xg, 4 ° C.
  8. Pipetteer de bovenste (waterige) laag van elke reactie naar een nieuwe 1,5 ml bewegen schroefdop microcentrifugebuis.
  9. Voeg een gelijk volume van chloroform aan elk van de gedecanteerde reacties. Vortex de monsters gedurende 30 sec.
  10. Draai het mRNA voor 5 min, 14.000 xg, 4 ° C
  11. Pipet de bovenste waterlaag van elke reactie is om een ​​nieuwe 1,5 ml schroefdop microcentrifugebuis bewegen.
  12. Voeg een gelijk volume isopropanol aan elk van de reacties en precipiteren de mRNA bij -80 ° C gedurende 30 min.
  13. Draai elk van de reacties gedurende 15 minuten bij 14.000 xg, 4 ° C tot de mRNA pellet
  14. Verwijder de bovenstaande vloeistof zorg niet aan de gepelleteerde mRNA te verstoren
  15. Voeg 200 pl 70% ethanol aan elk van de reacties, meng de reacties en draaien gedurende 10 min bij 14.000 xg, 4 ° C.
  16. Verwijder de ethanol zorg niet te verstoren het mRNA, droog de pellet bij kamertemperatuur met behulp van een vacuümexsiccator of speed-vac.
  17. Re-schorten het mRNA in 10-20 pl van moleculair-biologische kwaliteit water. Spin kort en houden de monsters op ijs. Opmerking: Het verwarmen van het monster tot 80 ° C gedurende 1 min kan helpen oplossen.
  18. Run 1 pl mRNA op een 2% agarosegel (TAE) en analyseert 1,2 ul op een spectrofotometer om een nauwkeurige uitlezing van de concentratie te krijgen.
    Kritische stap: Een concentratie van 400 ng / gl synthetische mRNA is noodzakelijk voor de volgende experimenten uit te voeren.
    Kritische stap: Als de 260/280 verhoudingbuiten het bereik van 2,00-2,20, of de totale hoeveelheid mRNA dan 12 ug, uitvoeren van een lithiumchloride precipitatie.
  19. WINKEL mRNA in 1 ul aliquots bij -80 ° C. Gebruik porties en dan weg te gooien; niet opnieuw invriezen mRNA.

4. Het genereren van Xenopus laevis embryo's

  1. Prime Xenopus laevis vrouwtjes door subcutane injectie met 50 eenheden humaan choriongonadotrofine hormoon (HCG, Chorulon) een week voor het experiment.
  2. Braken Xenopus laevis vrouwtjes de nacht vóór het experiment door het injecteren van 250 eenheden van HCG en incubatie in het donker, O / N bij 19 ° C.
  3. Ontleden testes van geëuthanaseerd mannelijke kikker en op te slaan in 1xNAM bij 4 ° C. Opmerking: Mannelijke kikker wordt geëuthanaseerd door terminale narcose in overeenstemming met bijlage 1 van de Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Massage vrouwelijke Xenopus laevis om ovulatie te induceren, het verzamelen van de laid eieren in een 55 mm diameter door petrischaal.
  5. Produceren een zaadcel schorsing door het breken van ¼ van een Xenopus laevis testis in 1 ml gedemineraliseerd water.
  6. Brush Xenopus oöcyten met de gemalen spermasuspensie behulp van een Pasteur pipet en pipet bol Kritische stap. Voer bemesting reacties op ongeveer 04:30 op de dag van het experiment.
  7. Culture embryo's bij 21 ° C in NAM / 10 (zie tabel 3 voor oplossingen) in 55 mm petrischalen bekleed met 1% agarose verdund in water (water).
  8. De gelei embryo na 45 min middels cysteïne / HCL (Tabel 3). Opmerking: Bij 21 ° C wordt het embryo 2 cellig stadium bereikt na 90 min en aanhangen elke 20 min daarna.

5. microinjecting Xenopus embryo

  1. Met behulp van 1 X 90mm glas haarvaten en een Narishige PC-10 dual-stage glas micropipet trekker, trek micropipetten voor injecties. Instellingen aanpassen empirisch een fijne punt te bereiken (minder dan één micron Diameter).
  2. Bevestig een micropipet (naald) naar een gas microinjector (bijvoorbeeld de Harvard Appartaus PLI-100 PICO-INJECTOR) herhaaldelijk precieze hoeveelheden vloeistof te leveren door een geregelde druk voor een digitaal ingestelde tijd. Stel de pneumatische druk tot een volume leveren van 1,25 tot 10 nanoliter als bepaald met een reticule of kalibratie slide.
  3. Jas een 55 mm petrischaal met 5 ml van 1% agarose (water). Snijd een 35-35 mm vierkante agarose uit de schotel, zal dit een stabiele ondergrond om embryo's microinject bieden.
  4. Transfer embryo's in NAM / 3 + Ficoll (Tabel 3) en naar injectie schotel.
  5. Injecteer embryo in het dier halfrond zodra zij het vereiste stadium van het experiment bereiken.
    1. Om de distributie van GFP-gelabeld liganden aan het celoppervlak analyseren injecteer de embryo bilateraal aan beide cellig stadium, 10nl per cel. Voorbeeld mRNA verdunningen hieronder getoond Wnt8a-HA-eGFP. Kritische stap: Zorg ervoor dat alle mRNA concentraties start bij 400 ng / ul.
      Opmerking: De hoeveelheid mRNA te injecteren moet empirisch worden bepaald door het testen concentraties en het vinden van de minimale hoeveelheid die nodig is om de fluorescerende ligand visualiseren. Western blotting met gebruikmaking van een anti-HA-antilichaam een ​​essentiële stap om te bepalen dat de mRNA vertaald vergelijkbare niveaus om de vergelijking van twee verschillende fluorescent gelabeld liganden mogelijk maken; Wij hebben dit voor Wnt8a-HA-eGFP en Wnt11b-HA-eGFP gedaan Fellgett et al., 2015.
      Opmerking: Bij de beoordeling van het effect van een geïnjecteerde mRNA (bijvoorbeeld één dat codeert voor een kandidaat regulator), een typische controle een niet-actieve RNA, zoals LacZ injecteren, in sibling embryo om te controleren op de gevolgen van de extra transcripten in het embryo.
      1. Verdunnen memRFP mRNA 1 op 4 (1 pl + 3 ui dH 2 O) met moleculair-biologische kwaliteit water om de concentratie te verlagen tot 100 ng / ul.
      2. Verdunnen Wnt8a-HA-eGFP mRNA 1 op 4 (1 pl + 3 ui dH2 O) met moleculaire kwaliteit water om de concentratie te verlagen tot 100 ng / ul.
      3. Meng memRFP mRNA in een 1: 1 verhouding met Wnt8a-HA-eGFP mRNA.
      4. Meng mRNA van 5.5.1.3 in een 1: 1 verhouding met hetzij de controle mRNA LacZ of modulator zoals Sulf1.
      5. Injecteren embryo bilateraal op de 2-cel stadium met 10nl van mRNA per cel (in totaal 20NL). Opmerking: Dit resulteert in 250 pg van m em RFP, 250 pg van Wnt8a-HA e GFP, 500 pg van Wnt11b-HA e GFP en 2 ng LacZ of Sulf1 mRNA wordt geïnjecteerd in elke cel.
    2. Analyseren van de verspreiding van GFP-gelabeld liganden injecteren mRNA coderend voor het ligand-GFP samen met een afstamming merker zoals memRFP op 16-32 cellig stadium, 1,25 nl per cel.
    3. Om de effecten van mogelijke modulator van ligand diffusie analyseren, co-injecteren mRNA coderend voor de modulator tezamen met het ligand en lineage tracer. Als alternatief injecteren naburige cellen: een met mRNA dat codeert voor het GFP-gelabelde ligand en een lineage tracer (memRFP) en de andere met mRNAs coderend voor de modulator en een andere lijn tracer (memCerulean).
  6. Transfer embryo's naar een 12,5 ° C incubator en cultuur tot de volgende dag, Nieuwkoop en Faber (NF) fase 8.

6. uitsnijden van Animal Cap Explantaten

  1. Transfer embryo een 55 mm Petri-schalen bekleed met 5 ml van 1% agarose (water). De schaal wordt met NAM / 2 (tabel 3).
  2. Neem ronde dier caps met Tungsten naalden Kritische stap:. Neem large caps in dit stadium omdat deze beter genezen en makkelijker om de afbeelding, houden controle caps om ervoor te zorgen geen convergente extensie optreedt.
  3. Overdracht dier explantaten op 55 mm petrischalen bekleed met 1% agarose (water) en cultuur embryo bij 21 ° C gedurende 4 uur Kritische stap. De 4 uur incubatie vereist om fluorescerende eiwitten te rijpen.
  4. Genereren reliëf dia's door te steken naar beneden twee lagen PVC isolerende ven tape op microscoopglaasjes. Snij een 14 mm bij 10 mm rechthoek uit de tape om een kamer te verlaten voor het monteren van dierlijke caps Kritische stap:. Vlak beide lagen van de band grondig op de dia voor het snijden van de rechthoek.
  5. Pipetteer 2 afzonderlijke druppeltjes van NAM / 2 (Tabel 3) in het reliëf dia ongeveer 30 pl per druppel.
  6. Transfer dier explantaten tot opluchting dia's met behulp van een afgesneden P20 tip en oriënteren zodat de apicale kant naar boven wijst. Opmerking: Elke dia kan 10-15 dier caps houden Kritische stap:. In dit stadium van het dier caps moet gedeeltelijk genezen, betekent dit dat ze minder kwetsbaar en kunnen worden gericht met behulp van een tang.
  7. Zachtjes zakken een glazen deksel slip op de opluchting dia en laat het deksel slip drogen 20 min Kritische stap: De grootte van het dier dop is cruciaal;. zorgen de kap is groot genoeg dat wanneer het glas dekglaasje wordt neergelaten op het reliëf dia perst de apicale laag van dierlijke cap cellen hebben een produce een vlakke ondergrond om de afbeelding. Als het dier caps zijn te klein toen nog het verminderen van de PVC-tape om één laag.
  8. Dicht de dia met behulp van nagellak Kritische stap:. Gebruik niet te veel nagellak tot opluchting dia's te dichten, want als de PVC-tape wordt te vochtig zal opstaan ​​en ondergang van de glijbaan.
  9. Droge reliëf dia's voor 20 minuten in het donker en ze zijn klaar om de afbeelding, meestal dierlijk caps zal gezond voor een keer afgesloten in de dia 4-6 uur blijven.

7. Imaging

Opmerking: Beeldvorming werd uitgevoerd met een omgekeerde confocale microscoop. Lambda mode gekozen voor beeldvorming dit toegestaan ​​meerdere fluoroforen met overlappende handtekeningen worden gebruikt en verwijderde het probleem van mogelijke sample beweging tussen scans.

  1. Vind explantaten met een lage vergroting doelstelling dan overschakelen naar 63x / 1.4 olie doelstelling voor hogere resolutie beeldvorming.
  2. Schakelen vereiste lasers; voor dit voorbeeld de 405laser werd gebruikt voor het exciteren memCerulean, werd 488 laser gebruikt om GFP wekken en 561 laser memRFP wekken via 405 en 488/561 dichroïsche spiegels.
  3. Met lambda-modus (In Zen 2011, selecteer lambda-modus - 32 bakken).
  4. Selecteer de 405nm, 488nm en 561nm lasers.To maken een breder gezichtsveld, zoom uit het beeld (tot 0.6x).
  5. Stel de framemaat aan de gewenste beeldgrootte (1024 x 1024 pixels met een grootte van 220 nm werd gebruikt voor deze data set).
  6. Zet gemiddeld tot typisch 4 tot 8 om de signaal-ruisverhouding te verhogen.
  7. Optimaliseer de pinhole (1 luchtig eenheid volgens de 561nm laser werd gebruikt voor deze data set).
  8. Optimaliseer het laservermogen Kritische stap. Balans van de 405nm, 488nm en 561nm lasers zodanig dat alle fluoroforen kunnen worden gedetecteerd met de detector-array 32, terwijl het minimaliseren van de hoeveelheid spanning en versterking vereist.
  9. Vang het wezen uitgezonden door memCerulean, GFP en memRFP. Voor dit werk licht werd verzameld elke ~10nm van 415-720nm, hoewel grotere tussenpozen collectie zijn ook mogelijk (bijv., Elke ~ 20 nm).

8. Beeldanalyse

  1. Onderzoeken van het effect van modulatoren op het celoppervlak expressie van GFP-gelabeld liganden
    OPMERKING: De volgende stappen zijn een gedetailleerde handleiding hoe de analyse werd uitgevoerd in ons laboratorium. De eindgebruiker kan willen het proces te stroomlijnen door het schrijven van een ImageJ of FIJI script om een ​​aantal van de handmatige stappen te verwijderen.
    Kritische stap: Het is belangrijk de eindgebruiker monsters de spectra van elke fluoroforen gebruikt in dezelfde omstandigheden die de uiteindelijke experiment wordt uitgevoerd om orm effectieve spectrale ontmenging van de meervoudige fluoroforen in de uiteindelijke experiment perf.
    Twee belangrijke soorten analyses worden uitgevoerd in deze sectie:
    1. Berekening van het totale aantal Wnt-HA-eGFP pixels co-lokaliserende de celmembraan.
      1. Unmix de groene,rood en cerulean kanalen met spectra bemonsterd uit enkelvoudige injecties van deze fluoroforen in ZEN software. Bewaar deze beelden als afzonderlijke documenten LSM gebruikt in alle volgende stappen.
      2. Open LSM-bestanden rechtstreeks in beeldbewerkingssoftware. Opmerking: de volgende instructies zijn voor FIJI Afbeelding J.
      3. Sla de LSM beelden als beeldsequentie documenten, dit zal automatisch de beelden opgesplitst in de afzonderlijke kanalen.
      4. Sla de afbeelding sequentie in dezelfde map als de scripts voor het script analyse software die wordt gebruikt om de gegevens te analyseren (zie aanvullende code-bestanden voor werkelijke script). Opmerking: de volgende instructies zijn voor Matlab.
      5. Open het script analyse software en open de map waarin de scripts worden geschreven.
      6. Voer de bestandsnaam onder Locatie analyse, zal de software de bestandsnaam te nemen en uitvoeren van de analyse.
        Opmerking: De bestandsnamen zal ImageA0000 en ImageA0001 lezen voor elke image. Het script analyse software wordt het beeld gebruiken gemarkeerd 0001 als het masker en analyseren van het percentage van de pixels in beeld 0000 dat co-lokaliseren met dit masker.
      7. Neem het percentage co-lokalisatie nummer (geannoteerd als Celmembraan bevolkt) en kopieer deze naar een spreadsheet. Opmerking: de volgende instructies zijn voor Excel.
      8. Plot van het percentage co-lokalisatie nummer op een staafdiagram of als een absolute of relatieve waarde.
    2. Het analyseren van het aantal, grootte en vorm van Wnt-HA-eGFP puncta.
      1. Open ongemengde LSM-bestanden rechtstreeks in beeldbewerkingssoftware. Let op: de volgende instructies zijn voor FIJI Afbeelding J.
      2. Splitsen elke afbeelding in de afzonderlijke kanalen (Afbeelding> Kleur> split-kanalen).
      3. Drempel zowel de Wnt-HA-eGFP en het membraan marker kanalen (Afbeelding> Aanpassen> Auto-drempel) Kritische stap:. Probeer een aantal drempels om te zien welke zorgt voor een representatief beeld, zonder overbelichtinghet kanaal.
      4. Omzetten het membraan marker kanaal om een ​​masker (Proces> Binary> Maak masker).
      5. Omkeren dit masker (Edit> Omkeren).
      6. Zet de Wnt-HA-eGFP puncta een masker zoals hierboven.
      7. Trek het membraan marker masker van de ligand-GFP masker (Proces> Afbeelding rekenmachine> Wnt masker in top box, membraan masker in onderste vak).
      8. Gebruik deeltje functie van het te analyseren. Vanaf hier selecteert u de gewenste parameters en de gegevens (Analyse> Analyse deeltjes) te analyseren.
      9. Kopieer het aantal deeltjes de gemiddelde deeltjesgrootte en circulariteit gegevens in een spreadsheet en plotten grafieken van de gegevens. Opmerking: Voor deze analyse, deeltjes alleen tussen 0.1-10μm 2 grootte werden geanalyseerd, waren geen beperkingen op deeltje cirkelvormigheid geplaatst. Deze instructie is voor Excel.
  2. Analyse van de reeks ligand diffusie
    1. Het openstellen van alle ongemengde beelden in confocale imaging software en vervolgens exporteren de bestanden in een TIF-formaat, als ruwe data en als een RGB-afbeelding. Opmerking:. Deze instructie is voor Zen lite 2011 Kritische stap: Voeg een schaal bar op ten minste één van de beelden, zodat afstand kan worden berekend tijdens de analyse.
    2. Open de beelden te analyseren in beeldanalyse software. Opmerking: de volgende instructies zijn voor Photoshop 8.2.3) Klik met de rechtermuisknop op de achtergrond van de afbeelding en selecteer 'laag uit de achtergrond', om een nieuwe laag te maken..
    3. Stel het membraan marker kanalen naar 0, zodat alleen de ligand-GFP-kanaal zichtbaar is (Laag> Nieuwe aanpassingslaag> Channel mixer) Kritische stap:. Klem de nieuwe aanpassingslaag om het beeld dat wordt geanalyseerd, de mogelijkheid om de nieuwe laag clip deze afbeelding is beschikbaar als een vakje na het klikken op de optie kanaal mixer.
    4. Open een nieuwe werkruimte. Stel de resolutie in op 300 pixels per inch en de kleur modus om RGB-kleuren (Bestand>Nieuw> Clipboard).
    5. Kopieer alle van de beelden die worden geanalyseerd in de interne werkruimte (Klik op de afbeelding en het is geknipt kanaals mixer door het houden van controle houd dan controle en Alt en sleep de afbeelding in de werkruimte).
    6. Oriënteren alle beelden zodat de maximale lengte van diffusie voor elke afbeelding kan worden gemeten langs de horizontale as, de cellen die Wnt-HA-eGFP georiënteerd naar links.
    7. Sla de werkruimte als TIF en open dit in het beeld analyse software. Opmerking: de volgende instructies zijn voor FIJI Afbeelding J.
    8. Open de ROI manager venster (Analyse> Extra> ROI manager).
    9. Teken een rechthoek op de eerste afbeelding, kan de exacte grootte van de rechthoek worden opgegeven (Select rechthoek gereedschap en trek elke rechthoek> Bewerken> Selectie> opgeven). Opmerking: een afmeting van 650 x 100 pixels lengte x breedte werd gebruikt in deze studie.
    10. Plaats de rechthoek op de rand van het domein uiten WnT-HA-eGFP. Plaats de rechthoek over het gebied met de maximale afstand van Wnt-HA-eGFP diffusie. Kritische stap: Zelfs zonder het membraan marker de regio's uiten Wnt-HA e GFP moet zichtbaar zijn als gevolg van de achtergrond fluorescentie; zo niet dan raadplegen RAW-afbeeldingen.
    11. Verschuiven de doos 10 M aan de rechterkant. Bepaal het aantal micrometer door het meten van de lengte van de schaal bar in een van de afbeeldingen (Trek een lijn opsporen van de schaal bar> Analyse> ingesteld schaal). Opmerking: Dit geeft een waarde voor 10 uM in pixels.
    12. Voeg het vak aan de ROI manager door op de knop Toevoegen in de ROI manager venster.
    13. Verhuizing rechthoek om het volgende beeld te meten door de rechthoek te verplaatsen terug op de rechthoek gereedschap te klikken. Herhaal stappen 8.2.10-11.
    14. Zodra alle van de panelen zijn gemeten, selecteert multiplot van de ROI manager menu (ROI> Meer> Multiplot> List).
      Let op: de gegevens vertegenwoordigt Wnt pixel intensity (Y) met toenemende afstand langs de horizontale as (X, gemeten in pixels). De waarde voor Y is de gemiddelde signaalintensiteit van ligand-GFP in het punt X en het gemiddelde wordt berekend van alle pixels in de Y-as voor elke X-waarde. Dientengevolge de hogere geven, hoe meer pixels worden geanalyseerd om het gemiddelde te produceren. Een kleine box (in de Y-as) wordt luidruchtiger; een grote doos zal hebben zeer lage gemiddelde pixel intensiteit.
    15. Kopieer de data uit het vak multiplot in een spreadsheet en re-label dienovereenkomstig. Opmerking: de volgende instructies zijn voor Excel.
    16. Gooi de eerste 10-20μm gegevens van elke analyse aangezien dit achtergrondfluorescentie van ligand-GFP tot expressie brengen en verstoort de grafieken.
    17. Openstellen van wetenschappelijke analyse en grafische software en een nieuwe notebook. Opmerking: de volgende instructies zijn voor Sigmaplot 13.
    18. Label het vereiste aantal kolommen voor de data door te dubbelklikken op de horizontale nummers on het werkblad en etikettering hen op afstand in pm, Wnt8a-HA-eGFP en Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Kopieer de gegevens van de spreadsheet in de desbetreffende kolommen van de wetenschappelijke analyse en grafische software.
    20. Maak een scatter grafiek (grafiek maken> Scatter> Multiple scatter> Selecteer X vele Y> Selecteer de kolom afstand voor X> Kies Wnt8a-HA-eGFP en Wnt11b-HA-eGFP voor de Y-waarden> Finish).
    21. Regressie-analyse uit te voeren op Wnt8a-HA-eGFP curve door met de linkermuisknop te klikken op een Wnt8a-HA-eGFP punt op de scatter grafiek. Alle punten moeten benadrukken. Klik op Analyse> Regression wizard.
    22. Selecteer de curve vergelijking categorie (exponentieel verval) en de vergelijking naam (Single, 3 parameter) en druk op volgende.
    23. Selecteer de X- en Y-waarden waaraan de curve moet worden gemonteerd (als de gegevens die eerder werd benadrukt, moet dit automatisch worden gedaan) en druk op volgende.
    24. Doorgaan met de wizard totdat de optie Numeriek Outputpagina, zorgen 'te creëren rapport' wordt dan aangevinkt op de volgende. Opmerking: De parameters voor de gepaste curve zal in het verslag van 1 worden getoond *.
    25. Op de pagina Grafiek opties zorgen 'add vergelijking om de grafiek titel' wordt dan aangevinkt op afwerking. Opmerking: De wizard zal hebben gecreëerd Report * 1 en Grafiek 1 * tabs aan de bovenkant van de nota boek. Daarnaast zal de curve toegevoegd zijn om de grafiek geproduceerd in (8.2.20).
    26. Herhaal stap 8.2.21-8.2.25 een curve voor Wnt11b-HA-eGFP passen Kritische stap. Probeer vallend meerdere categorieën vergelijking en vergelijking namen aan de data. Opmerking: De curve met de beste pasvorm moet de hoogste R2 waarde met de laagste residuele kwadratensom produceren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Confocale analyse van dierlijke cap explanten uiten fluorescent gelabelde eiwitten biedt een effectief systeem voor het visualiseren van ligand distributie onder verschillende experimentele omstandigheden. In één voorbeeld, de verdeling van GFP-gelabeld Shh wordt getoond (Figuur 1). Aan het 2-cel stadium Xenopus embryo's worden geïnjecteerd in beide cellen met hetzij een controle-mRNA of mRNA coderend voor Sulf1, een enzym dat heparansulfaat wijzigt en beïnvloedt de Shh morfogeen gradiënt <...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een essentieel onderdeel van dit protocol is het genereren van biologisch actieve liganden die normaal worden verwerkt, afgescheiden, en in staat om een ​​reactie in de ontvangende cel te lokken, ondanks het feit dat een fluorescerende groep gehecht. Het is cruciaal om te tonen dat de fluorescent gelabelde genproduct biologisch actief met een geschikt assay. Voor Shh-GFP, het vermogen om de expressie van PTC1 activeren bevestigd 16. Wnt8a heeft een opmerkelijk krachtige vermogen om een nevenas induce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door een BBSRC verlenen aan MEP (BB / H010297 / 1), een BBSRC quotum studententijd aan SAR en een MRC studententijd naar SWF.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseMelfordMB 1200
Ammonium acetateAmbionFrom Megascript SP6 Kit AM 1330
BicarbonateVWR InternationalRC-091
Calcium nitrateSigmaC13961
Cap analog (m7G(5'))Applied BiosystemsAM 8050
ChloroformSigmaC 2432
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaO3690
EthanolVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fiji image J softwareGratis download http://fiji.sc/Fiji
GentamycinMelfordG 0124
Glacial acetic acidFisher ScientificA/0400/PB17
Glass cover slips, No.1.5 Scientific Laboratory Supplies22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Glass needle pullerNarishigeNarishige PC -10
Glass pull needlesDrummond Scientific3-000-203-G/X
Human chronic gonadotropin (HCG)Intervet
IsopropanolFisher ScientificP/7500/PB17
Lithium chloride (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 en Zen software (2008-2010)Carl Zeiss
Matlab softwareMathworkshttp://uk.mathworks.com/
Molecular grade water Fisher ScientificBP 2819-10
Nail varnish BootsBar code 3600530 373048
SpectrophotometerLab.tech InternationalND-1000 / ND8000
Petri dish (55 mm)VWR International391-0865
Phenol-chloroformSigmaP3803
Photoshop softwareAdobehttp://www.photoshop.com/products
High fidelity DNA polymerase and buffers BiolabsM0530S  Buffer - M0531S
Potassium chloride (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
PVC insulation tapeOnecallSH5006MPK
Gel extraction kit QiagenS28704
Restriction enzymes buffersRocheSuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
RNAse-free DNAsePromegaME10A
Steel back single edge bladesPersonna66-0403-0000
Sodium chloride (NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 transcription kitAmbionAM1330
Glass slidesThermo FisherSHE 2505
Tris baseInvitrogen15504-020
Tungsten needleszelf gemaakt
Zen lite softwareCarl ZeissGratis download  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

Referenties

  1. Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
  2. Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
  3. Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
  4. Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
  5. Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
  6. Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
  7. Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
  8. Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
  9. Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
  10. Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
  11. Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
  12. Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
  13. Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
  14. Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
  15. Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
  16. Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
  17. Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
  18. Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).
  19. Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
  20. Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
  21. Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
  22. Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
  23. Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
  24. McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
  25. Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
  26. Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
  27. Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  28. Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
  29. Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
  30. Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
  31. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Confocale microscopieliganddiffusiefluorescentiemarkeringWnt ligandenShh ligandenmicrodissectieanimal capsbeeldanalyse

Gerelateerde artikelen