Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

9.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53163

⸱

15 september 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

De structuur en chemische eigenschappen van de plantencelmuur worden geëvalueerd om ideale grondstoffen voor biobrandstoffen en biomaterialen te identificeren. Standaardmethoden hebben beperkingen wanneer ze worden toegepast op grote datasets. Deze hoogdoorvoerpre-behandelings-, enzym-saccharificatie- en pyrolyse-moleculaire bundel massaspectrometrie-methoden vergelijken een groot aantal biomassamonsters met verminderde experimentele tijd en kosten.

Samenvatting

De omzetting van lignocellulose biomassa naar brandstoffen, chemicaliën en andere producten is onderzocht als een mogelijke weg om het gebruik van niet-hernieuwbare energiebronnen te verminderen. Om te identificeren welke planten uit een diverse pool de gewenste chemische eigenschappen hebben voor downstream toepassingen, moeten attributen zoals het cellulose- en ligninegehalte of de monomeersuikerafgifte na enzymatische saccharificatie worden vergeleken. De experimentele en data-analyseprotocollen van de standaardanalysemethoden kunnen tijdrovend zijn, waardoor het aantal te meten monsters wordt beperkt. High-throughput (HTP) methoden verhelpen de tekortkomingen van de standaardmethoden en maken een snelle screening van beschikbare monsters mogelijk om degenen met de gewenste eigenschappen te isoleren. Deze studie illustreert de HTP suikerafgifte en pyrolyse-moleculaire bundel massaspectrometrie pipelines die worden gebruikt in het National Renewable Energy Lab. Deze pipelines hebben de efficiënte beoordeling van duizenden planten mogelijk gemaakt terwijl experimentele tijd en kosten worden verminderd door reductie in arbeid en verbruiksartikelen.

Inleiding

Als de wereldwijde levering van niet-hernieuwbare brandstoffen en bijbehorende producten afneemt, hebben wetenschappers uitgedaagd om soortgelijke brandstoffen en chemicaliën maken op basis van plantaardige bronnen 1. Een belangrijk aspect van dit werk is bepalen welke soorten planten geschikt voor de productie van biobrandstoffen en biomaterialen 2,3 zijn. Meestal worden deze voedingen geëvalueerd lignine, cellulose en hemicellulose inhoud; evenals hun gevoeligheid voor deconstructie (weerbarstigheid) door middel van thermische, mechanische en / of chemische voorbehandeling met of zonder daaropvolgende enzym versuikering. Meer gedetailleerde analyses worden gebruikt om de specifieke samenstelling van de lignine en hemicellulose fracties en een optimale enzymactiviteit noodzakelijk te bepalen. Transgene modificaties van planten die niet intrinsiek bezitten ideale eigenschappen voor biochemische en thermochemische conversie naar gewenste grondstoffen hebben de onderzoekers voorzien van een zeer uitgebreide bron van de pottiële grondstoffen 4. De standaard analytische methoden voor het kwantificeren van de chemische eigenschappen van de plant, terwijl zeer bruikbaar voor kleine sample sets, ongeschikt voor het snel screenen van honderden of duizenden monsters 5-7. De HTP hierin beschreven werkwijzen zijn ontwikkeld om grote aantallen varianten biomassa snel en efficiënt te evalueren van veranderingen in celwand weerspannigheid aan thermochemische en / of enzymatische afbraak.

Het is cruciaal om te begrijpen dat de HTP screeningstesten die hierin zijn beschreven zijn niet bedoeld om de conversie of de opbrengst te maximaliseren. Het doel is om relatieve verschillen in de intrinsieke weerbarstigheid verwante biomassa monsters te bepalen. Hierdoor vele analysestappen verschillen van de "typische" biomassa conversie assays, waarbij het doel is om maximale omzetting snelheid of mate te verkrijgen. Zo worden lagere voorbehandeling severities en kortere enzymhydrolyse keer gebruikt maximaliseren afwijkenschillen tussen de monsters. Meestal gaan hoge enzymladingen gebruikt om verschillen als gevolg van experimentele variatie in enzymactiviteit, die de resultaten aanmerkelijk kunnen scheef verminderen.

Snelle technieken waarmee de samenstelling van plantaardige celwanden en de monomere suikers bevrijde volgende enzymatische versuikering omvatten robotics, aangepast, thermochemisch compatible 96-well platen en aanpassingen van standaard laboratoriummethoden 8-11 en instrumentele protocollen, zoals vibratiespectroscopie (infrarood (IR), nabij-infrarood (NIR), of Raman) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) 12-17. Deze methoden zijn de sleutel tot het isoleren van grondstoffen met een hoog cellulose of lage gehalten lignine, of die naar verwachting de hoogste glucose, xylose, ethanol opleveren, enz. Deze methoden hebben downscaled analyses die kleinere hoeveelheden biomassa en verbruiksgoederen in dienst ingeschakeld, wat leidt tot vermindering van de experimentele kosten 18 . Een ander kenmerk van deze methodiek is dat verschillende experimentele omstandigheden snel kunnen worden en in sommige gevallen tegelijk, geëvalueerd. Zo kan een grote verscheidenheid aan voorbehandeling strategieën of enzym cocktails worden beproefd, waardoor de meest optimale experimentele parameters snel worden geïdentificeerd en toegepast. Populaire voedingsmaterialen, zoals maïsstro 9, populier 8,10, suikerriet bagasse 8 en switchgrass 8 zijn succesvol geëvalueerd met behulp van deze werkwijzen HTP.

Totaal lignine en lignine monomeer samenstelling worden ook vaak gekwantificeerd biomassa trekken. Verlagingen van lignine is aangetoond dat de enzymatische verteerbaarheid van polysacchariden 19,20 te verhogen. De rol die de lignine monomeer verhouding (vaak gerapporteerd als syringyl / guaiacyl (S / G)) speelt in de deconstructie van de plant celwand wordt nog onderzocht. Sommige rapporten hebben aangegeven dat een verlaging van de S / Gverhouding heeft geleid tot een verhoogde glucose opbrengst na hydrolyse 21, terwijl andere studies onthullen het tegenovergestelde trend 19,22. High throughput methoden voor het evalueren van lignine en de monomeren zijn vibrationele spectroscopie (IR, NIR, Raman en 23-26) in combinatie met multivariate analyse, en pyrolyse moleculaire bundel massaspectrometrie (pyMBMS) 27,28.

Bij de ontwikkeling van HTP methoden voor het screenen van biomassa, moet een aantal integrale overwegingen in het achterhoofd worden gehouden. Een belangrijk aspect is de complexiteit van de werkwijze. Wat is het vereiste niveau voor de techniek? Chemometrische analyses, bijvoorbeeld, vereisen bijzondere vaardigheden voor het construeren, evalueren en onderhouden voorspellende modellen. De standaard methoden vertonen ongewenste stappen voorbereidende of data-analyse of dienst giftige reagentia. De ontwikkeling van de modellen is een continu proces waarbij nieuwe gegevens worden opgenomen in het model in de tijd om de robuustheid van het model te verhogen. Andere considking is de kostenbesparing en verminderde experimentele analyse maal de voorgestelde high-throughput methoden. Als de methode tamelijk snel, maar zeer duur, kan het geen haalbare techniek voor vele laboratoria om aannemen. De werkwijzen toegelicht in dit handschrift varianten gestandaardiseerde technieken, bewerkt om de doorvoersnelheid mogelijkheden amplificeren. Deze protocollen kwantitatief de biomassa eigenschappen van belang te meten zonder de noodzaak van de ontwikkeling van voorspellende modellen. Dit is een belangrijk kenmerk van deze technieken, aangezien voorspellingsmethoden, terwijl met een sterke correlatie met de standaard analyses gebruikt om modellen te ontwikkelen, zijn niet zo nauwkeurig als werkelijk meten van de hoeveelheid van belang voor de monsters. Overwegende dat de gebruikte zijn in wezen verkleinde versies van de standaard bench-schaal analysemethoden methoden, nauwkeurigheid en precisie worden verhandeld voor snelheid en doorvoer. Meestal, dit resultaat is te danken aan hogere fouten in klein volume pipetteren en wegen; alsmede een toename van svoldoende heterogeniteit als monster wordt verkleind. Terwijl de grote sample sets kunnen worden gescreend en vergeleken, moet grote zorgvuldigheid worden betracht bij het maken van vergelijkingen tussen afzonderlijke campagnes en bench-schaal resultaten.

De meest tijdrovende stappen omvatten de fysieke manipulatie van de biomassa. Slijpen monsters kan enkele minuten per monster, met inbegrip van het schoonmaken van de molen tussen de monsters te nemen. Handmatig laden, lossen en schoonmaken hoppers en het vullen en legen van theezakjes en sample zakken is ook zeer arbeidsintensief. Terwijl elke stap een minuut of langer kan duren, kan het doen van duizenden monsters vele uren of zelfs dagen duren. De robot kan een typische reactor geladen plaat biomassa in ongeveer 3 tot 4 uur of 6-8 platen dag -1 -1 robot. Deze situatie is afhankelijk van de nauwkeurigheid parameters, alsmede het type en de hoeveelheid biomassa te testen gebruikt. Vullen reactor platen met water, verdund zuur of enzym wordt snel gedaan met behulp van een liquid handling robot. Pherbehandeling van een stapel platen (1-20 reactor platen) duurt tussen 1 en 3 uur na montage, koelen en demontage inbegrepen. Enzymhydrolyse duurt 3 dagen en de suiker analyse vereist ongeveer 1 uur van prep tijd plus 10 min per reactor plaat om de test te voltooien en lees de resultaten. Een wekelijks schema van set voorbehandeling en analyse dagen herbergt een redelijke werkschema minimaliseren oneven uur weekend inspanningen voor menselijke component van het assay en maakt bewerking ~ 800 tot 1000 samples per week op een permanente basis. De maximale doorvoersnelheid hangt af van verschillende factoren, vooral hoeveel hardware (robots, reactoren platen, enz.) En hoeveel "software" (dwz, personeel) zijn beschikbaar voor de handmatige werk te doen. De praktische bovengrens is 2500 tot 3000 monsters / week; echter, dat de output vereist 7 dagen per week operatie en meerdere stagiaires en technici. In vergelijking zou 3000 monsters met HPLC ongeveer 125 dagen sam vereisenple analyse plus de extra arbeid van de hand met een gewicht van de monsters in de reactoren en filtering monsters voorafgaand aan analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. High-throughput bepaling van glucose en xylose Opbrengsten Na enzymatische versuikering 9,29

  1. Monstervoorbereiding (Malen, De-stijven, Extraction, voorbehandeling)
    1. Grind ten minste 300 mg van elk monster biomassa met een Wiley molen, zodat de deeltjes door een 20 mesh (850 urn) scherm. Transfer naar anti-statische zip-top zakken (meestal bar-code) en opnemen monster informatie aan de barcode database.
    2. Voeg ongeveer 250 mg of meer van de grond biomassa uit de anti-statische zak naar een genummerde (met potlood, geen gebruik maken van inkt of marker) theezakje voorzichtig oprollen van de theezakjes, en zorg ervoor dat de uiteinden vouw over de biomassa om te voorkomen verlies tijdens de-stijven en extractie.
    3. Wikkel het theezakje gesloten met tin beklede koperdraad. Noteer het theezakje nummer voor elke barcode monster.
    4. Bereid de-stijven enzymoplossing van commerciële enzymen (gewoonlijk 0,25% (v / v) glucoamylase (~ 1600 AGU / L) en1,5% (v / v) alfa-amylase (KNU ~ 2900-S / L) in 0,1 M natriumacetaat (pH 5,0)). Bereid 16 ml per g bulk biomassa of 500 ml per 120 theezakje monsters. Opmerking: Ladingen kan verwijderen zetmeelgehalte van gemalen biomassa empirisch worden bepaald door het testen van zetmeel na digestie met verschillende enzymes en verhoudingen.
    5. In een plastic container, voeg 16 ml van de stijven enzym oplossing per 1 g bulk gemalen biomassa. Voor een partij de-stijven protocol, voeg 120 theezakjes aan 500 ml van de buffer-enzymoplossing.
    6. Incubeer in een schudder bij 55 ° C gedurende 24 (± 4) uur bij 120 rpm om mogelijke zetmeel te verwijderen.
    7. Na de-de stijven incubatie, spoel en genieten van de biomassa in verschillende liter gedemineraliseerd water gedurende 30 min. Herhaal dit proces nog twee keer met buffer zouten die stoten (vorming van gasbellen in de oplossing die kan leiden tot een plotselinge en hevige stijging van het niveau van de oplossing, waardoor hete vloeistof ethanol cascade veroorzaken verwijderenuit het reactievat) tijdens de winning.
    8. Na de uitputtende spoelen van de-de gesteven biomassa, plaats de theezakjes in de kolom Soxhlet voor de extractie. Nr huls is vereist voor deze stap.
    9. Stel de Soxhlet reflux, met behulp van 95% ethanol en haal de monsters gedurende 24 uur.
    10. Verwijder de theezakjes uit de Soxhlet reactor en verspreid in een enkele laag op een plat lade.
    11. Laat de monsters een nacht drogen bij kamertemperatuur in een zuurkast.
    12. Rol de theezakjes en de terugkeer van de gedroogde biomassa originele streepjescode van anti-statische zakken.
      Opmerking: De anti-statische zakken zijn efficiënt bij het verminderen van statische elektriciteit in de biomassa, verbetering van de rijeigenschappen. Als andere opslagopties worden gebruikt, kunnen aanvullende biomassa nodig zijn vanwege de biomassa vasthouden aan de zijkant van de opslaghouder.
    13. Overdracht ten minste 50 mg van de gedroogde biomassa een barcode hopper (gebruik van meer materiaal is beter voor nauwkeurige dosering). Skunnen barcodes antistatische zakken en de stortbunker nauwkeurige sample volgen waarborgen.
    14. Hoppers lading op vaste wegen robot, met veel aandacht voor de volgorde van de monsters in de rekken. Laad genoeg reactor platen om alle monsters bevatten en selecteer de afgifte-protocol gebaseerd op het aantal gebruikte platen.
    15. Robot weegt 5 mg van de gedroogde monsters (± 0,3 mg) in zuurbestendig roestvrij staal 96-wells platen. Weeg 3 herhalingen van elk monster verdeeld rond de plaat aan een gelokaliseerde variaties te minimaliseren.
    16. Omvat 8 control biomassa monsters van een goed gekarakteriseerde biomassa standaardmateriaal teneinde assayprestaties volgen. Voor meerdere platen, zal het gebruik van meerdere standaard biomassa hoppers deeltjesgrootte drift veroorzaakt door zeven in de hoppers dan herhaald doseren cycli te minimaliseren.
      Opmerking: In elke plaat, moeten er 24 monsters met 3 herhalingen, 4 blanks bestaande uit gedemineraliseerd water en enzymen, en 8 controls via de eerder gekarakteriseerde standaard biomassa. De 3 hoek putten van elk van de 4 hoeken van de plaat zijn gereserveerd voor de suiker normen.
    17. Controleer leeg en suiker standaard putten voor de dolende biomassa deeltjes te verwijderen indien aanwezig.
    18. Voeg 250 gl gedeïoniseerd water aan elk putje en de platen afdichten met silicone lijm-backed polytetrafluorethyleen (PTFE) tape.
    19. Met behulp van een 1/8 "soldeerbout tip, doorboren de PTFE-tape aan elkaar stoom poort (117 in totaal) voor elke plaat. Gebruik een leeg bord gestapeld op afgedichte reactor plaat als een gids en het beperken PTFE-film beweging.
    20. Klem de platen goed af met 0,031 "dik glasvezelversterkt PTFE pakkingen (geperforeerd met gaten voor stoom poorten) tussen de platen en de lege borden op de boven- en onderkant van de stapel. Behandel de monsters via stoom reactor ingesteld op 180 ° C gedurende 17,5 min of andere temperatuur / tijd-combinaties op basis van gewenste ernst.
    21. Koel reactor platen 50 °; C door overstromingen met gedemineraliseerd water.
  2. Enzymatische versuikering
    1. Bereid een enzymatische versuikering oplossing bestaande uit 8% (v / v) enzymoplossing in 1,0 M natriumcitraat, pH 5,0. Bereid 5 ml per reactor plaat. Opmerking: Moet verdund worden moet worden bepaald op basis van activiteiten en eiwitgehalte van de specifieke voorraad enzymoplossing.
    2. Wanneer de platen zijn koel, centrifugeer ze in een swinging bucket rotor bij 1500 xg gedurende 20 min. Verwijder afdichting film. Opmerking: Deze platen zijn zwaar en de centrifuge specificaties moeten worden gecontroleerd op compatibiliteit.
    3. Voeg 40 ul van de 8% enzym voorraadoplossing aan elke well (70 mg enzym per gram biomassa).
    4. Verzegelt met nieuwe PTFE-tape. Plaats verzegelde plaat in magnetische plaat klem.
    5. Meng de monsters door omkeren (ten minste 15 maal) en incubeer bij 50 ° C gedurende 70 uur.
    6. Wanneer de versuikering heeft gesloten, meng door inversie en centrifuge de platen bij 1500 xg gedurende 20 min.
  3. Sugar Assay
    1. Bereid een reeks van 6 glucose en xylose gecombineerd kalibratienormen in 0,014 M citraatbuffer (pH 5,0) van 0 tot 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 en 0,75 mg / ml aanbevolen) en 0-,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 en 0,6 mg / ml aanbevolen) respectievelijk glucose en xylose.
    2. Bereid de glucose oxidase / peroxidase (goPod) en xylose dehydrogenase (XDH) reagens volgens de instructies in de kit.
    3. Met behulp van een pipet, verwijder 200 ul van vloeistof uit de 4 hoeken putten en rand putten grenzend aan de hoek putten (12 in totaal putten) van de reactor plaat.
    4. Met behulp van een pipet, afzien 180 ui gedeïoniseerd water aan elk putje van een 96-well polystyreen met vlakke bodem verdunning plaat. Geen water toe te voegen aan de 12 suiker standaard en hoek putten (verwijder deze tips bij gebruik van een 96-kanaals head).
    5. Met behulp van een pipet, afzien 180 ul goPod reagens aan elk putje van de glucose test platen.
    6. Met behulp van een pipet, afzien 180 ul XDH reagens aan elk putje van de xylose assay plaat.
    7. Met behulp van een pipet 20 ul hydrolysaat fracties van de 96-well reactor plaat om de verwatering plaat. Pipet uit het bovenste gedeelte van de putten biomassa vaste stoffen en restvloeistof in de hoek putjes voorkomen. Meng door trituratie ten minste 10 cycli.
    8. Met behulp van een pipet 110 ul van suiker normen, in tweevoud, op de hoek putjes van de verdunning plaat.
    9. Met behulp van een pipet 20 pi fracties van de verdunning plaat om de glucose en xylose assay platen. Meng door trituratie.
    10. Incubeer glucose en xylose testplaten bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Breken elk oppervlak luchtbellen zorgvuldig voor te lezen. Een warmte kanon even over het oppervlak van de plaat werkt goed.
    11. Met behulp van een ultraviolet / zichtbare 96 putjes plaatlezer, stellen de gemeten golflengte 510 nm en noteer de absorptie tegen een blanco reagens.Deze meting bewaakt de vorming van quinonimine, dat evenredig is aan glucoseconcentratie. De glucoseconcentratie wordt berekend uit de kalibratiecurve gebaseerd op de calibratiestandaarden bereid in 1.3.1.
    12. Met behulp van een ultraviolet / zichtbare 96 putjes plaatlezer, stellen de gemeten golflengte 340 nm en noteer de absorptie. Deze meting bewaakt de reductie van NAD + tot NADH, die evenredig is met xylose concentratie. De xylose concentratie wordt berekend uit de kalibratiecurve gebaseerd op de calibratiestandaarden bereid in 1.3.1.

2. High-throughput Bepaling van Total en Lignine Lignine Monomeer content met behulp pyMBMS 28

  1. Monstervoorbereiding
    1. Slijpen en haal de biomassa met behulp van de in de stappen 1.1.1 en 1.1.6-1.1.8 beschreven methoden. Dit geldt ook voor het slijpen en het extraheren van een set van standaarden als experimentele controles gebruiken.
      Opmerking: De pyMBMS MEASURements zijn niet deeltjesgrootte afhankelijk, dus als alleen met behulp van de pyMBMS protocol, moet de voorbereiding van biomassa worden uitgevoerd om het monster te passen in de monsterhouder, <4 mm.
    2. Met een kleine spatel afgifte ongeveer 4 mg (3 tot 5 mg de voorkeur) van de bereide biomassa in een 80 ui roestvrijstalen beker ontworpen voor de autosampler.
    3. Zorg ervoor dat ten minste 10% van de monsters geanalyseerd zijn controlenormen zoals die verkrijgbaar bij de National Institute of Standards and Technology (suikerriet bagasse-8491; populieren-8492; pine-8493, of stro-8494). De standaard kan ook elke soort analoog aan de te analyseren monsters reeds gekarakteriseerd met behulp van standaard werkwijzen.
    4. Willekeurig laden van de monsters in de auto-sampler bekers met een pincet om vertekening te vermijden wegens mogelijke spectrometer drift in de tijd. Noot: een randomisatie van de monsters zou de meting van alle samples eenmaal, gevolgd door een re-randomisatie omvattenvan de orde van de monsters een duplicaat metingen. Randomisatie programma's zijn online beschikbaar.
    5. Met behulp van een standaard perforeren, handmatig glas filter discs van het type A / D glasvezel platen, zonder bindmiddel. Houd de ronde glasvezel filter met een pincet, centreren het over het monster cup, en duwen in het monster met behulp van een 3,5 mm inbussleutel om het materiaal in elke kop tijdens het experiment te beperken.
  2. Instrumental Protocol
    1. Kalibreer de massa spectrometer met een bekende standaard die piekintensiteiten over het gehele bereik van verbindingen die kunnen bestaan ​​voor de experimentele monsters over. Voor typische biomassa monsters gebruiken perfluortributylamine (PFTBA).
    2. Stel het draaggas helium debiet 0,9 l / min onder toepassing van een gasmeter.
    3. Stel de autosampler oven om een ​​pyrolysetemperatuur van 500 ° C en de interface temperatuur 350 ° C via de autosampler software. Opmerking: een 1/8 "RVS verwarmdtransportleiding verpakt in verwarmingsband dat de autosampler verbinding met de massaspectrometer wordt via een warmte-controller bij 250 ° C.
    4. Begin data-acquisitie op de massaspectrometer en wacht ten minste 60 seconden om voldoende gegevens voor de achtergrond spectra collectie te verkrijgen.
    5. Start de automatische autosampler methode met de specificaties van 2.2.2. Opmerking: de auto-sampler daalt elk monster afzonderlijk in de auto-sampler oven. De totale data acquisitie is ongeveer 1,5 min; echter, pyrolyse van een typische 4 mg monster voltooid na 30 sec.
    6. Recordbedrag iongehalte (TIC) van elk monster met behulp massaspectrometer software op scansnelheid 0,5 sec. Neem intensiteiten tussen m / z 30-450.
      Opmerking: Typische biomassa verbindingen gebruik zachte ionisatie op 17 eV. Het instrument kan grotere intervallen vanaf m / z 1 opnemen op 1000; zal echter scansnelheid worden beperkt door de computer CPU-kracht.
    7. Verwijder de achtergrond van de spectra met behulp van de malijkse verbeteren functie in de software. Opmerking: gedeelte van de basislijn aan het begin van de gegevensverzameling A 60 scan wordt gebruikt om een ​​gemiddelde achtergrondwaarde te berekenen. Dit gemiddelde achtergrondspectra wordt uit het experimentele monster spectra automatisch in de massaspectrometer software.
    8. Importeren enkele kolom tekstbestand door de massaspectrometer software die de spectrale gegevens voor elk monster in een databaseprogramma breiden en alle monsters in een gegevensbank. Voeg eventueel van toepassing metagegevens naar de spreadsheet. Importeer de opgemaakte gegevens (spreadsheet / CSV-bestand) in een statistisch softwarepakket en betekenen normaliseren van de spectra om rekening te houden met variatie in de gepyrolyseerde monster massa.
    9. Gebruik een statistisch softwarepakket a principal component analysis (PCA) uitvoeren met het spectrale gegevens groepering van de gerepliceerde standaardmonsters gebruikt bij de metingen analyseren en te evalueren welke pieken integraal indeling van chemische zijnverbindingen in de belasting 28 te plotten.
      Opmerking: PCA groepen de monsters op basis van de gelijkenis van hun spectra en maakt een controle van de normen experimentele fout meten vanwege instrument drift tijdens de run.
    10. Om de lignine syringyl (S) / guaiacyl (G) verhouding berekenen som van de gebieden van de S pieken (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 en 210) en delen door de som van G pieken bij 124, 137, 138, 150, 164 en 178.
    11. Om de totale lignine-gehalte te berekenen, tel de lignine pieken met m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 en 210.
    12. Berekenen van een correctiefactor voor het schalen van de pyMBMS meting om een ​​standaard methode voor het schatten van de totale lignine, zoals Klason lignine. Verdeel de Klason lignine waarde van de individuele norm door het totale ligninegehalte gemeten die standaard monster met behulp pyMBMS.
    13. Pas deze correctiefactor al like-soorten in de dataset. Herhaal dit voor elk type biomassa geanalyseerd. Noot: De correctiefactor kan aanzienlijk variëren, afhankelijk van de S / G van de biomassa geanalyseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gecombineerde effect van de thermochemische voorbehandeling en daaropvolgende enzym versuikering wordt gemeten als een functie van de massa van glucose en xylose vrijgegeven op het einde van de test. De resultaten worden in termen van mg glucose en xylose vrijkomt per gram biomassa. Dit staat in schril contrast met gerapporteerde gegevens van bench-scale testen die gewoonlijk wordt gerapporteerd als percentage theoretische opbrengst gebaseerd op analyse van de samenstelling van het uitgangsmateriaal. Omdat het nog n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De belangrijkste monstervoorbereiding stappen voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare gegevens bij het uitvoeren van high-throughput screening experimenten zijn als volgt:

Sugar afgifte test:

In het algemeen worden monsters in partijen variëren van enkele tientallen tot enkele duizenden tegelijk. Elke belangrijke stap wordt gewoonlijk uitgevoerd voor alle monsters vóór vooruit om variaties tussen monsters bereiding te minimaliseren. De-stijven was ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen stagiair Evelyn Von Neida bedanken die onschatbare inzichten heeft geboden over de voorbereiding van biomassamonsters voor beide hoogwaardige doorvoerlijnen die in dit manuscript worden besproken. Ondersteuning voor de ontwikkeling van dit werk en manuscript werd verstrekt door het BioEnergy Science Center. Het BioEnergy Science Center is een U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center ondersteund door het Office of Biological and Environmental Research in het DOE Office of Science. Het National Renewable Energy Laboratory (NREL) is een nationaal laboratorium van het US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, geëxploiteerd voor DOE door de Alliance for Sustainable Energy, LLC. Dit werk werd ondersteund door het U.S. Department of Energy onder Contract No. DE-AC36-08-GO28308 met het National Renewable Energy Laboratory.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Biomek FX Automated WorkstationBeckman CoulterBiomek FXAutomated Liquid Handler
Wiley millThomas Scientific3375E15 (Model 4), of 3383L20 (Mini-mill)
anti-static tassenMinigrip*MGST4P025032.5x3", meerdere leveranciers beschikbaar
tin-coated koperdraadMcMaster-Carr8871K840.016" diameter, buig-en-blijf draad
theezakjesHerbcopress n' brew theezakjes3.5x5 inches
gluco-amylaseNovozymesSpirizyme Fuel 
alpha-amylaseNovozymesLiquozyme SC DS
natriumacetaat trihydraatelke chemische leverancierreagentiakwaliteit
azijnzuurelke chemische leverancierreagentiakwaliteit
190 proof (95%) ethanolelke chemische leverancierreagentiakwaliteit
hoppersFreeslate
96-well C-276 Hastelloy platenAspen Machining (Lafayette, Colorado)N/A (op maat gemaakt)
1/8” soldeerboutpuntSears
silicoon-zelfklevende teflontape3M51803" breed (36-meter rollen)
enzymoplossingNovozymesCellic CTec2
citroenzuurmonohydraatelke chemische leverancier
trinatriumcitraatdihydraatelke chemische leverancier
wegwerp, polystyreen 96-well platenGreiner Bio-One655101of equivalent; meerdere leveranciers beschikbaar
glucoseoxidase/peroxidase MegazymeK-GlucMegazyme D-glucose assay kit
xylose dehydrogenaseMegazymeK-XyloseMegazyme D-xylose assay kit
glucose standaardoplossingMegazymeK-GlucMegazyme D-glucose assay kit
xylose standaardoplossingMegazymeK-XyloseMegazyme D-xylose assay kit
roestvrijstalen steekproefbekersFrontier LaboratoriesPY1-EC80F
glasvezelbladenPall662278x10" bladen; cirkels geponst met standaard perforator
Suikerriet Bagasse Hele Biomassa BrandstofNIST8491
Eastern Cottonwood (poplar) Hele Biomassa BrandstofNIST8492
Monterey Pine Hele Biomassa BrandstofNIST8493
Tarwestroo Hele Biomassa BrandstofNIST8494

Referenties

  1. U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
  3. Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
  6. Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
  7. Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
  8. DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
  9. Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
  10. Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
  11. Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
  12. Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
  13. Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
  14. Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
  15. Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
  16. Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
  17. Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
  18. Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
  19. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
  20. Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
  21. Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
  22. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
  23. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93(2014).
  24. Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
  25. Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
  26. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
  27. Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
  28. Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
  29. Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
  30. Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Biomassa recalcitrantiestoomvoorbehandelingglucose xylosekwantificeringpyrolyse moleculaire bundelmassaspectrometriecelwandaanalyserobotgestuurde monsterverwerking
High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.