Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Samenvatting

Reverse genetica, een aanpak om infectieus virus volledig te redden van een gekloonde cDNA, heeft het veld van positieve-streng RNA-virussen, waarvan de genomen dezelfde polariteit hebben als cellulair mRNA, gerevolutioneerd. Het op cDNA gebaseerde reverse genetica-systeem is een baanbrekende methode die directe manipulatie van de virale genomische RNA mogelijk maakt, waardoor recombinante virussen worden gegenereerd voor moleculaire en genetische studies van zowel virale RNA-elementen als genproducten in virale replicatie en pathogenese. Het biedt ook een waardevolle platform die de ontwikkeling van genetisch gedefinieerde vaccins en virale vectoren voor de levering van vreemde genen mogelijk maakt. Voor veel positieve-streng RNA-virussen zoals Japanse encefalitis virus (JEV) zijn de gekloonde cDNA's echter onstabiel, wat een groot obstakel vormt voor de constructie en propagatie van het functionele cDNA. Hier beschrijft het huidige rapport de strategische overwegingen bij het creëren en amplificeren van een genetisch stabiele volledige infectieuze JEV cDNA als een bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) met behulp van de volgende algemene experimentele procedures: virale RNA-isolatie, cDNA-synthese, cDNA subcloning en modificatie, samenstelling van een volledige cDNA, cDNA linearisatie, in vitro RNA-synthese en virus herstel. Dit protocol biedt een algemene methodologie die van toepassing is op het klonen van volledige cDNA voor een reeks positieve-streng RNA-virussen, met name die met een genoom van >10 kb in lengte, in een BAC-vector, waaruit infectieuze RNA's in vitro kunnen worden getranscribeerd met een bacteriofagen RNA-polymerase.

Inleiding

Voor RNA virologen de komst van recombinant DNA technologie in de late jaren 1970 maakte het mogelijk om virale RNA-genomen om te zetten in cDNA-klonen, die vervolgens kan worden vermeerderd zoals plasmiden in bacteriën voor de genetische manipulatie van RNA-virussen. ¹ het eerste RNA-virus te zijn moleculair gekloond was bacteriofaag Qp, een positieve streng RNA virus dat Escherichia coli infecteert. Een plasmide dat een volledige cDNA kopie van de Qp-genoom RNA leidde tot infectieuze fagen QP wanneer ingebracht in E. coli. ² Kort daarna deze techniek werd toegepast op poliovirus, een positieve streng RNA-virus van mens en dier. Een plasmide dat een cDNA van volledige lengte van het poliovirus genomische RNA infectieus wanneer getransfecteerd in zoogdiercellen en staat de productie van infectieuze virions ³ In deze "-DNA geïntroduceerd" werd de gekloneerde cDNAs moeten intracellulair getranscribeerd virale RNA replicatie te initiëren.;het is echter onduidelijk hoe de transcriptie wordt geïnitieerd en hoe de transcripten worden verwerkt om de juiste virale sequentie. Deze bezorgdheid heeft geleid tot de ontwikkeling van een alternatieve "-RNA gestart" benadering, waarbij een volledige cDNA-kopie van het virale RNA-genoom is gekloneerd onder een promoter herkend door een E. coli of faag RNA-polymerase voor het produceren van synthetische RNA's in vitro met gedefinieerde 5 'en 3' uiteinden, waarbij de volledige virale replicatiecyclus ondergaan wanneer ingebracht in gastheercellen. ^4,5 Het eerste succes van deze benadering werd gerapporteerd brome mosaic virus ^6,7 een positieve streng RNA-virus van planten. Sindsdien is de RNA-gelanceerd aanpak ontwikkeld voor een breed scala aan positieve streng RNA-virussen, waaronder calicivirussen, alfavirussen, flavivirussen, arterivirussen en coronavirussen. ^1,4,5,8

In zowel de DNA- en RNA-gelanceerde reverse genetics systemen, de bouw van een vl-cDNA-kloon is de sleutel tot het genereren van infectieus DNA of RNA van positieve streng RNA virussen, maar het wordt een aanzienlijke technische uitdaging als de grootte van het virale genoom toeneemt. ^17/09 met name een groot RNA-genoom van ~ 10 -32 kb bevat drie belangrijke obstakels voor het klonen van een full-length cDNA functioneel. ¹⁸ Het eerste probleem is de synthese van een cDNA getrouwe kopie, aangezien de betrouwbaarheid van RT-PCR is omgekeerd evenredig met de lengte van het virale RNA. De tweede hindernis is de aanwezigheid van potentieel toxische sequenties, al lang RNA moleculen vaker onverwachte sequenties die in staat is de cDNA-fragment in onstabiele plasmiden in E. bevatten coli. De derde en meest kritische punt is de beschikbaarheid van een geschikte vector, aangezien het moeilijk is een kloneringsvector die een virale cDNA-insert van> 10 kb kunnen onderbrengen vinden. In de afgelopen drie decennia hebben deze barrières overwonnen door een aantal ontwikkelingen in de enzymologie, methodologie, eend vectorology. ^1,4,5,8 Van deze, de meest veelbelovende en innovatieve ontwikkeling is het klonen van grote positieve streng RNA-virussen zoals besmettelijke bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC). De BAC vector is een low-copy klonen plasmide (1-2 kopieën / cel) op basis van de E. coli vruchtbaarheid factor, met een gemiddelde grootte van insert DNA ~ 120-350 ^19-21 kb DNA-fragment wordt in de BAC vector op een gelijkaardige manier ingevoegd kloneren in algemene kloneringsvectoren.; de verkregen BAC klonen stabiel gedurende vele generaties E. coli. ^22,23 Tot op heden heeft het RCB technologie gebruikt van infectieuze cDNA-klonen voor> 10 leden van drie positieve streng RNA virus families, namelijk Flaviviridae, ^24-29 Arteriviridae, ³⁰ en Coronaviridae creëren. ^{9,16,17 , 31,32}

Met behulp van Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, dit werk rapporteert de gedetailleerde procedures die kunnen wordengebruikt om een ​​genetisch stabiele full-length infectieuze BAC voor verschillende positieve streng RNA-virussen te construeren. JEV is een zoönotische flavivirus ³³ die in de natuur tussen vogels, varkens en andere gewervelde gastheer wordt overgebracht door muggen vectoren. ^34,35 Bij mensen JEV infectie kan het ernstige vaak dodelijke neurologische ziekte Japanse encefalitis (JE), ³⁶ die optreedt in Azië en delen van de westelijke Stille Oceaan, ^37,38 met een geschatte jaarlijkse incidentie van ~ 50,000-175,000 klinische gevallen. ^39,40 Het genoom van JEV is een ~ 11-kb, enkelstrengs, positieve-sense RNA-molecuul en bestaat uit een enkel open leesraam (ORF) geflankeerd door twee niet-coderende regio (NCR) van het 5 'en 3' uiteinden. ^41,42 Het ORF codeert voor een polyproteïne dat wordt gesplitst door gastheer en virale proteases tot 10 afzonderlijke eiwitten genereren aangewezen C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5 in de N- naar C-terminus. ^34,43,44 Ook eXtended vorm van NS1 (NS1) wordt door -1 ribosomale frameshifting uitgedrukt in codons 8-9 van NS2A. ^45,46 Van deze 11 eiwitten, de drie structurele eiwitten (C, prM en E) zijn essentieel voor de vorming van infectieuze virions, ^47,48 en de resterende acht structurele eiwitten (NS1 tot NS5 en NS1 ") zijn noodzakelijk voor virale RNA-replicatie, ^49-51 deeltje assemblage, ^52-56 en aangeboren immuniteit fraude. ^57-59 zowel de 5 'en 3 'NCRs bevatten geconserveerde primaire sequenties en vorm RNA secundaire / tertiaire structuren, ^60-62 die belangrijk zijn voor het moduleren van viraal RNA replicatie. ^63,64

Dit protocol beschrijft de gereedschappen, werkwijzen en strategieën voor het genereren van een full-length infectieuze BAC van JEV SA ₁₄ -14-2. ²⁸ Deze functionele BAC kloon bevat een volledig cDNA kopie van het RNA genoom JEV, ⁶⁵ die is omgeven door een promoter de SP6 RNA polymerase upstreamvan de virale 5'-uiteinde en een unieke XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van het virale 3'-end in vitro run-off transcriptie. Deze BAC technologie is toepasbaar op het construeren van een volledig functionele cDNA-kloon moleculaire voor een serie van positieve streng RNA virussen.

Protocol

Opmerking: Figuur 1 geeft een strategie voor de bouw van een full-length besmettelijke JEV cDNA als een BAC ²⁸ Tabel 1 geeft een overzicht van de oligonucleotiden die in dit protocol ^28..

1. Extract Virale RNA van JEV Deeltjes in celkweeksupernatanten

1. Begin met de celkweek medium dat JEV SA ₁₄ -14-2, een levend JE vaccinvirus dat Biosafety Level 2 insluiting vereist.
   Opmerking: De virale titer ongeveer 1-3 x 10 ^{6-plaque-vormende} eenheden / ml.
2. Neem de bioveiligheid opleiding die nodig is voor alle standaard microbiologische praktijken, veiligheidsuitrusting en laboratoriumfaciliteiten voorafgaand aan het werken met JEV SA ₁₄ -14-2.
3. Zuiver viraal RNA uit een monster van het virus-bevattende celkweek medium voor monofasische oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat ⁶⁶ (Figuur 1A).
   1. Advertentied 600 ul van de monofasische reagens om 200 ul van het kweeksupernatant in 1,7 ml microbuisjes. Homogeniseer het mengsel met de hand schudden van de buis krachtig gedurende 30 seconden en incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Voeg 160 ul chloroform om het gehomogeniseerde monster. Meng met de hand schudden van de buis krachtig gedurende 15 seconden en laat het voor 2-3 min bij RT.
   3. Centrifugeer de totale lysaat bij 13.400 xg gedurende 15 min bij 4 ° C, waardoor een scheiding van twee vloeibare fasen, namelijk een onderste organische fase en een bovenste waterige fase. Breng de bovenste waterige fase (minder dan 200 pl) met het RNA een nieuwe microbuisjes.
   4. Neerslaan van de RNA door toevoeging van 1 pi 5 pg / pl glycogeen en 400 pi 100% isopropanol en incubatie gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
   5. Centrifugeer het mengsel bij 13.400 x g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de RNA pellet met 1 ml 75% ethanol per puls-vortexen 4:57tijden en centrifugeren bij 13.400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
   6. Air-droog de ​​RNA pellet gedurende 10 min en oplossen in 40 ul van dH ₂ O. Bewaar de geëxtraheerde RNA bij -80 ° C tot gebruik.

2. Synthetiseren een set van vier overlappende cDNA Fragments (F1 tot F4) die de gehele virale genoom RNA door reverse transcriptie (RT) -PCR

1. Voer een 20 ui RT reactie met een 10 pl aliquot van de gezuiverde virale RNA als een matrijs en een gemodificeerde vorm van Moloney murine leukemievirus reverse transcriptase. ⁶⁷
   1. Opzetten van een 13 pi mengsel dat 10 ul van het gezuiverde RNA, 1 ui 10 mM dNTP mix, 1 ui 4 pmol / ul primer en 1 pl dH ₂ O. Gebruik het fragment-specifieke primer voor elke RT-reactie: 1RT voor F1, 2RT voor F2, 3RT voor F3 en 4RT voor F4.
   2. Incubeer het mengsel bij 65 ° C gedurende 5 min, plaats op ijs gedurende 1 minuut, en vervolgens snel draai aan de conte verzamelennts op de bodem van de buis.
   3. Voeg 4 pi 5 x RT-buffer, 1 ui 0,1 M DTT, 1 gl 40 U / gl RNase-remmer en 1 pl 200 U / ul reverse transcriptase. Meng door op en neer pipetteren 3 om 5 keer.
   4. Laat de reactie verlopen bij 50 ° C gedurende 1 uur, vervolgens hitte-inactivatie van het monster bij 70 ° C gedurende 15 min. Bewaar de gesynthetiseerde eerste streng cDNA bij -20 ° C tot gebruik.
2. Voer een 100 ui PCR-reactie met een 5 pl aliquot van het warmte geïnactiveerd RT-reactie als een matrijs en een high-fidelity thermostabiele DNA polymerase ⁶⁸ (Figuur 1B).
   1. Stel een 100 ul PCR reactiemengsel op ijs, bevattende 5 ui van de RT-reactie, 20 ui 5 x PCR-buffer, 4 ui 10 mM dNTP mix, 5 pl 10 pM forward primer, 5 ul 10 uM reverse primer, 1 ui 2 U / ul DNA-polymerase en 60 pl dH ₂ O. Gebruik de fragment-specifieke primer paar voor elke PCR keuze reactietijdn: 1F + 1R voor F1 (2573 bp), 2F + 2R voor F2 (4171 bp), 3F + 3R voor F3 (3922 bp), en 4F + 4R voor F4 (1798 bp).
   2. Meng voorzichtig door vingers flipping de buis 3 tot 5 maal en centrifuge kort om de inhoud te verzamelen op de bodem.
   3. Begin thermische cycli met een initiële denaturatie stap van 30 sec bij 98 ° C gevolgd door 25-30 cycli met de volgende PCR profiel: 10 sec bij 98 ° C, 30 sec bij 60 ° C en 1-2 min (30 s / kb) bij 72 ° C. Bewaar de PCR producten bij 4 ° C tot analyse.
3. Voer een 2-5 pi aliquot van elke PCR reactie op een 0,8% agarosegel bevattende 0,5 ug / ml ethidiumbromide (EtBr) (Figuur 2).
   LET OP: EtBr is een krachtige mutagene stof en vereist lab jassen, veiligheidsbril en handschoenen te dragen en de uiterste voorzichtigheid tijdens het gebruik, de opslag en verwijdering in acht te nemen.

3. Subkloneer elk van de vier cDNA Fragments (F1 tot F4) in een BAC Vector om pBAC / F1 tot pBAC / F4 b Maaky Molecular Cloning Techniques

1. Digest de vector en steek DNAs met twee geschikte restrictie-endonucleasen, zoals:
   1. Voer een sequentiële digestie van pBAC / PRRSV / FL (vector), ³⁰ een derivaat van de pBeloBAC11 plasmide (7507 bp, GenBank toegangsnummer U51113), met PmeI en NotI in een totaal volume van 60 ui (met ~ 500 ng DNA , 10 eenheden enzym, 1x digestiebuffer en 1 x BSA) bij 37 ° C gedurende 12-15 uur, waarbij het 15.426 bp vectorfragment oplevert.
   2. Voer een sequentiële digestie van elk van de vier cDNA-amplicons (insert) met Smal en Notl in een totaal volume van 60 pl (met ~ 1 ug DNA, 20 eenheden enzym, 1 × digestiebuffer en 1 x BSA) en 25 ° C (Sma I) of 37 ° C (Notl) voor 12-15 uur, waarbij de volgende insert fragmenten van de gewenste grootte oplevert: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), en F4 (1784 bp).
2. Zuiveren degewenste vector en insert-DNA-fragmenten door gel-extractie.
   1. Scheid de dubbel gedigereerde producten op een 1% laag smeltpunt agarose gel bevattende 0,5 ug / ml EtBr. Snijd een band van het gewenste DNA-fragment met een minimale hoeveelheid agarose (meestal ~ 200 ul) onder langgolvig ultraviolet licht.
   2. Voeg een gelijk volume van TEM-buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA en 10 mM MgCl ₂₎ naar de uitgesneden agarose in 1,7 ml microbuisjes. Incubeer het monster bij 72 ° C gedurende 10-15 min met vortexen elke 2-3 min totdat de agarose volledig gesmolten is.
   3. Voeg een gelijk volume van voorverwarmde buffer-verzadigde fenol, vortex krachtig gedurende 1 min en centrifugeer bij 13.400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Het mengsel scheidt in een lagere organische fase en een bovenste waterige fase. Breng de bovenste waterige fase die het DNA met een nieuwe microbuisjes.
   4. Voeg een gelijk volume chloroform: isoamylalcohol (24: 1), vortex gedurende 1 minuut, en centrifugeer bij 13,400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microbuisjes.
   5. Voeg 0,5 ul van 10 ug / ul tRNA, 1/10 volume 3 M natriumacetaat en 2,5 volumes 100% ethanol. Houd het mengsel op ijs gedurende 20 min.
   6. Centrifugeer het mengsel bij 13.400 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant en was de DNA pellet met 1 ml 70% ethanol door vortexen pulse-3 om 5 maal en centrifugeren bij 13.400 xg gedurende 10 min.
   7. Lucht-droog de DNA pellet gedurende 10 min en oplossen in 20 ui TE-buffer (10 mM Tris-Cl en 1 mM EDTA [pH 7,6]).
3. Afbinden de gewenste vector en insert-DNA-fragmenten onder toepassing van T4 DNA ligase.
   1. Opzetten van een 20 gl ligatiereactie met 50-100 ng van de vector DNA, een ~ 3-voudige molaire overmaat van het insert DNA, 400 U T4 DNA ligase en 1 x ligatiebuffer. Incubeer de ligatiereactie bij 16 ° C gedurende 12-15 uur.
      NB: Inclusief een negatief control reactie, dat wil zeggen, vector alleen zonder de insert, in parallel.
   2. Voeren vier afzonderlijke ligaties, elke toetreding tot de 15.426-bp Pme I- Niet fragment van pBAC / PRRSV / FL met de 2559-bp (F1), 4157-bp (voor F2), 3908-bp (voor F3), of 1784-bp (voor F4) SmaI-NotI fragment van een van de vier cDNA amplicons te subklonen pBAC / F1 tot pBAC / F4 genereren.
4. Transformeren de geligeerde DNA in E. coli DH10B door de _CaCl2 -Warmte schok-methode.
   1. Neem 100 gl aliquots van de _{CaCl2-behandelde} competent DH10B cellen ⁶⁹ bewaard bij -80 ° C en ontdooien ze op ijs.
      Opmerking: Gebruik 100 ul cellen per transformatie.
   2. Voeg 10 pi aliquot van het DNA ligatiereactie met 100 ul van de ontdooide cellen in 1,7 ml microbuisjes, meng voorzichtig door de buis te tikken en houden op ijs gedurende 30 min.
   3. Heat-shock DNA-cel mengsel gedurende 45 seconden in een 42 ° C water bad, plaats op ijs gedurende 2 minuten en voeg dan 900 ul van LB bouillon voorverwarmd tot kamertemperatuur.
   4. Incubeer de warmte geschokt cellen bij 35 ° C gedurende 1 uur met schudden bij 225-250 rpm.
   5. Verspreid 50 om 200 gl aliquots van de gekweekte cellen op LB-agarplaten die 10 ug / ml chlooramfenicol (CML). Houd de platen bij RT, de goede kant op, totdat ze droog zijn.
   6. Draai de platen om en incubeer bij 35 ° C gedurende 15 uur.
5. Herstel het gekloneerde BAC DNA van de gastheercellen door kolommen gebaseerde zuiveringswerkwijze (figuur 1C).
   1. Pick 8 6 om bacteriekolonies van de LB-agarplaten Cml en beënt ze in 3 ml 2 x YT-bouillon die 10 ug / ml Cml. Incubeer de kweken bij 35 ° C gedurende 10 uur onder krachtig schudden (225-250 rpm).
   2. Isoleer recombinant BAC DNA 1-1,5 ml van de bacteriële culturen met behulp van spin-kolommen, zoals voorgeschreven door de fabrikant. ⁷⁰ Elueer de geëxtraheerde DNA (Typitisch 100-200 ng) in 20 ui TE-buffer.
   3. Voer twee analytische restrictie-enzym digesties van de geïsoleerde BAC's voor ~ 6 uur in een totaal volume van 10 pi, een aan de aanwezigheid van de vector identificeren met een correcte insert met dezelfde enzymen die voor klonering (zie protocol 3,1), en de andere om de integriteit van het gekloneerde BACs testen met een geschikt enzym (bijvoorbeeld, Bgl II, Nco I, of Pst I), het genereren van een unieke restrictiefragmentenpatroon.
   4. Propageren juiste gekloneerde BACs door het enten 500 pl van de positieve bacterieculturen (van Protocol 3.5.1) in 500 ml 2xYT-Cml medium en kweken van de inoculum voor 6 uur bij 35 ° C onder schudden bij 225-250 tpm. Zuiver het BAC DNA (meestal 10-20 ug) uit de kweek 500 ml met behulp filter columns, zoals aanbevolen door de fabrikant. ⁷¹
      Opmerking: De eerste vier BAC-subklonen, die elk een cDNA-fragment van JEV genoom RNA kan blijken te hebben ope of meer ongewenste mutatie (s) in vergelijking met de consensus sequentie van het virale genoom ⁴² (die dient als referentie sequentie). Dergelijke mutatie moet worden gecorrigeerd door PCR-gebaseerde plaatsgerichte mutagenese voor de montage van een full-length JEV cDNA. ²⁷

4. Maak een Full-length JEV cDNA met 5 'SP6 promotor en de 3' Run-off site

1. Maak drie genetische modificaties (zie hieronder protocollen 4.1.1-4.1.3) in de gekloneerde cDNAs in vitro run-off transcriptie van genoom-RNA's length zodat de authentieke 5 'en 3' einden van het virale genoom.
   1. Algemeen gebruik van een SP6-promoter direct stroomopwaarts van het einde van het virale genoom van de 5 'van overlap extensie PCR (figuur 1D, pBAC / F1 ^SP6).
      1. Amplify twee overlappende DNA-fragmenten via de eerste standaard PCR van pBAC / F1 met de twee primerparen SP6F + SP6R (grootte product, 173 bp) en F1F + F1R (product size, 676 bp), elk in een 50 pi reactie die 1 pl matrijs-DNA (~ 200 pg / pl), 10 pi 5 x PCR-buffer, 2 ui 10 mM dNTP, 2,5 pi elk 10 uM voorwaartse en omgekeerde primers, 0,5 gl 2 U / ul DNA-polymerase, ⁶⁸ en 31,5 pl dH ₂ O. Voer de PCR met de volgende cycling profiel: 98 ° C gedurende 30 sec, en 25 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 20 sec.
      2. Gel zuiveren de twee PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten na het uitvoeren van elk van de twee PCR-producten op een 1,5% laag smeltpunt agarose gel, zoals beschreven in protocol 3,2.
      3. Fuseren de twee-gel gezuiverde DNA-fragmenten via het tweede fusie PCR met de buitenste primers SP6F + F1R (productgrootte, 821 bp) in een 100 ui reactie met 1 gl elk van de twee gezuiverde DNA-fragmenten (~ 100 pg / pl), 20 ui 5 x PCR-buffer, 4 ui 10 mM dNTP, 5 pl 10 pM elk van voorwaartse en omgekeerde primers, 1 gl2 U / ul DNA-polymerase, ⁶⁸ en 63 pl dH ₂ O. Gebruik de volgende thermische cyclus profiel: 98 ° C gedurende 30 sec, en 25 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 sec.
      4. Gel zuiveren het gefuseerde PCR amplicon van een 1% laag smeltpunt agarose gel, zoals beschreven in protocol 3,2.
      5. Voer de vijf stappen procedure kloneren protocollen 3,1-3,5 beschreven om het 760-bp Pac I BsiWI fragment van de gel gezuiverd gefuseerd PCR amplicon ligeren met de 9532-bp Pac I BsiWI fragment van pBAC / F1 genereren pBAC / F1 ^SP6.
   2. Verwijder de bestaande interne XbaI bij nucleotide 9131 door invoeging van een stille puntmutatie (A ⁹¹³⁴ → T) via overlap extensie PCR (figuur 1D, pBAC / F3 ^KO).
      1. Amplify twee overlappende DNA-fragmenten door de eerste standaard PCR van pBAC / F3 met beide primer paren X1F + X1R(product grootte, 746 bp) en x2F + X2R (grootte product, 316 bp) in een 50 ul reactie onder de in protocol 4.1.1.1 beschreven experimentele omstandigheden.
      2. Gel zuiveren de twee PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten na elektroforetische scheiding op 1,5% laag smeltpunt agarose gels, zoals in protocol 3,2.
      3. Fuseren de twee gel-gezuiverde DNA-fragmenten via de tweede fusie PCR met behulp van de buitenste primers X1F + X2R (product grootte, 1033 bp) in een 100 ul reactie onder de in protocol 4.1.1.3 beschreven experimentele omstandigheden.
      4. Gel zuiveren het gefuseerde PCR amplicon van een 1% laag smeltpunt agarose gel, zoals beschreven in protocol 3,2.
      5. Voer de vijf stappen procedure kloneren protocollen 3,1-3,5 beschreven om het 949-bp Avr II NotI fragment van de gel gezuiverd gefuseerd PCR amplicon ligeren met 16.245 bp geen I- BsiWI en 2141-bp Bsi W I - AvrII fragmenten van pBAC / F3 om pBAC / F3 ^KO te produceren.
   3. Ingenieur een nieuwe kunstmatige XbaI afvloeiing plaats net stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van het virale genoom door PCR-gebaseerde plaatsgerichte mutagenese (figuur 1D, pBAC / F4 ^RO).
      1. Genereer een DNA-fragment door PCR van pBAC / F4 met primers ROF + ROR (productgrootte, 324 bp) in een 100 pi reactie die 1 pl matrijs-DNA (~ 200 pg / pl), 20 pi 5 x PCR-buffer, 4 pl 10 mM dNTPs, 5 ui elk van 10 pM forward en reverse primers, 1 gl 2 U / ul DNA-polymerase, ⁶⁸ en 64 pl dH ₂ O. Voer de PCR met de volgende cycling profiel: 98 ° C gedurende 30 sec, en 25 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 15 sec.
      2. Gel-zuiveren het PCR-geamplificeerde DNA-fragment uit een 1% laag smeltpunt agarose gel, zoals beschreven in protocol 3,2.
      3. Voer de vijf stappen klonen procedure protocollen 3,1-3,5 beschreven ligeren de 283-bp Sfi I Not fragment van de gel gezuiverd PCR amplicon met 16.933 bp Sfi I-Not I fragment van pBAC / F4 tot pBAC / F4 ^RO creëren.
2. Monteer een set van de vier gewijzigde, overlappende cDNA's in een enkele full-length SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2) door deel te nemen aan drie natuurlijke restrictie sites (BsrGI, Bam HI, en Ava I ) op een sequentiële wijze met vijf stappen klonering procedures beschreven in Protocols 3,1-3,5 (Figuur 1E): F1 ^{SP6 SP6} → F1 F2 (door vervanging van de Bsr G I- NotI fragment van pBAC / F1 ^SP6 met die van pBAC / F2) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO (door vervanging van de BamH I- NotI fragment van pBAC / ^SP6 F1 F2 met die van pBAC / F3 ^KO) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO F4 ^RO (door vervanging van de Ava I-NotI fragment van pBAC / F1 ^SP6 F2F3 ^KO met die van pBAC / F4 ^RO).

5. Maak een hoge zuiverheid Maxi-prep van de Full-length SA ₁₄ -14-2 BAC

1. Kweek een enkele kolonie van E. coli DH10B uitvoering pBAC / SA ₁₄ -14-2 in 3 ml 2 x YT-bouillon die 10 ug / ml Cml gedurende 10 uur bij 35 ° C met schudden bij 225-250 rpm, en vervolgens opgeschaald door het enten 500 pl van de 10 hr bacteriekweek in 500 ml 2xYT-Cml medium en kweken van de inoculum voor 6 uur bij 35 ° C onder krachtig schudden.
2. Centrifugeer de bacteriële kweek in twee 250 ml flessen bij 3107 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Resuspendeer elk pellet in 30 ml GTE-oplossing (50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl en 10 mM EDTA [pH 8,0]), en voeg vervolgens 500 pl van 60 mg / ml lysozym. Incubeer de beide celsuspensies op ijs gedurende 10 min.
3. Voeg 60 ml vers gemaakte Lysis oplossing (0,2 N NaOH en 1% SDS) aan elke celsuspensie, meng goed totdat duidelijk, en houdt de lysatenbij kamertemperatuur gedurende 10 min.
4. Voeg 45 ml Neutralisatie-oplossing (100 ml, bestaande uit 60 ml 5 M kaliumacetaat, 11,5 ml ijsazijn en 28,5 ml dH ₂ O) aan elke fles, meng goed door omkeren van de flessen, en incubeer de geneutraliseerde lysaten op ijs gedurende 10 min.
5. Centrifugeer de geneutraliseerde lysaten bij 18.566 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng de supernatant van beide flessen in twee nieuwe flessen van 250 ml; Voeg 0,6 volume van 100% isopropanol aan elkaar, en houd ze op ijs gedurende 20 minuten.
6. Spin down de precipitaten bij 18.566 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Oplossen elke pellet in 5 ml TE-buffer, combineren in een 50 ml buis (10 ml totaal) en neerslaan van de RNA door toevoeging van een gelijk volume 5 M lithiumchloride. Incubeer het mengsel op ijs gedurende 10 min.
7. Centrifugeer het RNA neerslag bij 14.636 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng het supernatant naar een nieuwe buis 250 ml precipiteren DNA door toevoeging van 2 volumes 100% isopropanol.Incubeer het mengsel op ijs gedurende 20 min.
8. Spin down het DNA neerslag bij 18.566 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant, resuspendeer de DNA pellet in 9,5 ml TE-buffer (pH 7,6) en voeg 10 g cesiumchloride (CsCl) en 390 gl 10 mg / ml EtBr.
9. Laad de DNA-CsCl-EtBr oplossing in een 16 × 76 mm afsluitbare polypropyleen buis met behulp van een injectiespuit voorzien van een 18 G naald. Draai de afgedichte CsCl gradiënt in een ultracentrifuge bij 401.700 x g gedurende 16 uur bij 20 ° C (figuur 3).
10. Verzamel een DNA-band van BAC plasmide uit de CsCl-gradiënt onder toepassing van een 18 G naald een ontluchter bovenaan de gradiënt en een 20 G-naald uitgeruste spuit het BAC DNA van de zijkant van het verloop ophalen creëren.
11. Voeg 2,5 volumes van dH _{2 O-verzadigde} butanol aan de EtBr-gekleurde BAC DNA-monster en meng door vortexen. Centrifugeer het mengsel bij 13.400 x g gedurende 1 min en breng de onderste waterige fase naar een nieuwe 1,7 ml microtube. Herhaal deze procedure zes keer.
12. Precipiteren de EtBr-vrije BAC DNA door het toevoegen van 1/10 volume 3 M natriumacetaat en 2,5 volumes 100% ethanol om de butanol geëxtraheerd BAC DNA en incubatie gedurende 10 min op ijs. Centrifugeer het neerslag bij 13.400 xg gedurende 10 min, was de DNA pellet met 1 ml 70% ethanol en opnieuw pellet door centrifugeren.
13. Lucht-droog de DNA pellet gedurende 10 min en oplossen in 200 ui TE-buffer (pH 7,6).
    Opmerking: Figuur 4 toont een overzicht van het reverse genetics systeem voor JEV SA ₁₄ -14-2.

6. Transcribeer synthetische RNA's in vitro van een gelineariseerde Full-length JEV BAC DNA

1. Voer een grootschalige restrictie-enzymdigestie van pBAC / SA ₁₄ -14-2 met XbaI in een totaal volume van 100 pl (met 3 ug DNA, 60 eenheden enzym, 1 × digestiebuffer en 1 x BSA) bij 37 ° C gedurende 12-15 uur. Onderzoek een 3 pl aliquot van het digestion reactie op een 0,8% agarosegel bevattende 0,5 ug / ml EtBr.
2. Incubeer de ontsluitingsreactie verder met 25 U van mungboonnuclease (MBN) bij 30 ° C gedurende 2 uur (Figuur 4A).
3. Breng het volume van de XbaI gedigereerde, MBN-behandelde monster tot 300 gl met dH ₂ O. Voeg een gelijk volume fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) aan het verdunde monster vortex krachtig gedurende 1 min centrifugeren op 13400 x g gedurende 10 min, en vervolgens over de bovenste waterige fase naar een nieuwe 1,7 ml microbuisjes. Voeg een gelijk volume van chloroform en herhaal de extractie procedure.
4. Herstel het fenol / chloroform geëxtraheerd, gelineariseerd BAC door ethanolprecipitatie Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaat en 2,5 volumes 100% ethanol en incubeer op ijs gedurende 20 min. Centrifugeer het neerslag bij 13.400 xg gedurende 10 min, was de DNA pellet met 1 ml 70% ethanol en vervolgens draai het door centrifugeren.
5. Air-droog de DNA pellet gedurende 10 min en oplossen in 30 ul van dH ₂ O. Onderzoek een 1 pi aliquot van het teruggewonnen BAC op een 0,8% agarosegel met 0,5 ug / ml EtBr (Figuur 5A).
6. Voer een run-off transcriptie van het gelineariseerde BAC DNA in een totaal volume van 25 ui (met ~ 200 ng template-DNA, 0,8 mm dop analoge [m ⁷ G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTPs, 40 U RNase-remmer, 20 U SP6 RNA polymerase, en 1 x ⁷² transcriptie buffer) bij 37 ° C gedurende 1 uur (figuur 4B). Omvat 0,5 pM ^[3 H] UTP voor RNA kwantificering op basis van ^[3 H] UTP incorporatie, zoals gemeten door adsorptie aan DE-81 filtreerpapier. ⁶⁹
7. Voer een 1-2 pi hoeveelheid van de run-off transcriptie reactie op een 0,6% agarosegel met 0,5 ug / ml EtBr (Figuur 5B).

7. Bepaal RNA Infectiviteit en Virus Yield

1. Cultiveren BHK-21 cellen in 150 mm Culture gerechten in een dichtheid van 3 x 10 ⁶ cellen / schaal van 24 uur bij 37 ° C met 5% _CO2.
   Opmerking: Handhaaf de BHK-21 cellen in alfa minimaal essentieel medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM glutamine, vitaminen, en penicilline / streptomycine.
2. Spoel de cel monolaag met 10 ml koude oplossing A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄ en 1,5 mM KH _{2PO 4).} Maak de cellen van de gerechten door behandeling met 4 ml trypsine-EDTA (0,25%) en ze verzamelen door centrifugeren bij 270 x g in een desktop centrifuge gedurende 2 min.
3. Resuspendeer de celpellet met 50 ml koude oplossing A in een 50 ml conische buis en centrifugeer de celsuspensie bij 270 x g gedurende 2 min. Herhaal deze procedure wassen drie keer; na de laatste wasbeurt, resuspendeer de celpellet bij een dichtheid van 2 x 10 ⁷ cellen / ml in Sol A.
4. Meng 400 ul aliquot van celsuspensie met 2 μg synthetische RNA in een 2-mm gap cuvette en onmiddellijk electroporate het mengsel met een elektroporator onder optimale elektroporatie omstandigheden: 980 V, 99 psec pulslengte en 5 pulsen (figuur 4C).
   Opmerking: Gebruik de ^3-H gelabelde RNA gesynthetiseerd in Protocol 6.5 rechtstreeks voor elektroporatie zonder verdere zuivering.
5. Verlaat de geëlektroporeerde cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en overbrengen naar een 1,7 ml microbuisjes met 600 ul compleet cultuurmedium.
6. Bereid een 10-voudige seriële verdunning van de geëlektroporeerde cellen in 1 ml compleet cultuurmedium en een plaat 100 pi aliquot van elke verdunning op monolagen van BHK unelectroporated-21-cellen (5 x 10 ⁵⁾ in een 6-wells plaat.
7. Na 4-6 uur incubatie, bedekken de cellen met 0,5% agarose in minimaal essentieel medium met 10% foetaal runderserum. Incubeer de platen gedurende 4 dagen bij 37 ° C met 5% _CO2.
8. Visualiseer de besmettelijke centrums (plaques) van fixatie met 7% formaldehyde en kleuring met 1% kristalviolet in 5% ethanol ²⁷ (figuur 6A).
   1. Optioneel: Onderzoek-RNA geëlektroporeerd cellen bij 18-20 uur na transfectie voor JEV eiwit expressie door immunofluorescentie assays ^27,73 (figuur 6B), en de oogst van de supernatanten van de RNA-geëlektroporeerde cellen op 22 en 40 uur na transfectie voor virus titratie door plaque assays ^27,63 (figuur 6C).

Resultaten

Voor alle positieve streng RNA-virussen, de betrouwbaarheid en efficiëntie van reverse genetics systeem afhankelijk van de genetische stabiliteit van een gekloneerde cDNA van volledige lengte, waarvan de sequentie overeenkomt met de consensus sequentie van viraal genoom RNA. ²⁷ Figuur 1 toont een vijf- stap strategie voor de constructie van een full-length infectieus cDNA als een BAC voor JEV SA ₁₄ -14-2 ^28: Stap 1, zuivering van viraal RNA uit de celkweek supernatant van JEV geïnfecteerde BHK-21-cellen (Figuur 1A); Stap 2 synthese van vier overlappende cDNA-amplicons (F1 tot F4) verspreid over de hele virale genoom (Figuur 1B); Stap 3, subkloneren van elk van de vier aangrenzende cDNA fragmenten in een BAC vector creëren pBAC / F1 tot pBAC / F4 (figuur 1C); Stap 4, wijziging van de gekloneerde cDNA's in vitro run-off transcriptie met SP6 RNA polymerase, dat wil zeggen, het plaatsen van een SP6promoter sequentie direct stroomopwaarts van de virale 5'-uiteinde (pBAC / F1 ^SP6), waardoor een bestaand inwendige XbaI bij nucleotide 9131 door invoeging van een stille puntmutatie, A ⁹¹³⁴ → T (pBAC / F3 ^KO), en invoegen een nieuwe kunstmatige XbaI- run-off site onmiddellijk stroomafwaarts van het virale 3'-end (pBAC / F4 ^RO) (figuur 1D); en stap 5, samenstel van een full-length SA ₁₄ -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2 (figuur 1E) tabel. 1 worden de oligonucleotiden in deze kloneringswerkwijze. ²⁸

Voor de constructie van een functionele JEV cDNA, de eerste belangrijke stap is de synthese van de vier overlappende cDNA-fragmenten met gezuiverde virale RNA als een matrijs voor RT-PCR. Figuur 2 geeft een representatief resultaat voor de vier RT-PCR producten die werden geëlektroforeerd op een 0,8%agarosegel. Deze gel blijkt duidelijk dat een full-length JEV cDNA wordt geamplificeerd in vier overlappende cDNA-fragmenten. Soms kan RT-PCR reacties op één of meer additionele virus-specifieke of niet-specifieke producten die meestal kleiner is dan het verwachte product, vanwege de niet-specifieke hybridisatie van de primers tijdens cDNA-synthese / amplificatie. Anderzijds, weinig of geen verwachte RT-PCR produkt zou worden versterkt door RNase toevallige besmetting tijdens het virale RNA isolatie of onjuist RT-PCR prestaties.

De volgende belangrijke stap is het kloneren en aanpassen van een partiële of volledige lengte JEV cDNA in BAC, wat een relatief eenvoudige procedure die standaard recombinant DNA technieken gebruikt. ⁶⁹ Figuur 3 toont een representatief resultaat voor de zuivering van de BAC kloon die een volledige lengte cDNA van JEV SA ₁₄ -14-2 door strepen in een CsCl-EtBr verloop.In dit experiment werd na centrifugatie gedurende 16 uur bij 401.700 x g, twee verschillende banden, dat wil zeggen, de E. coli chromosomaal DNA boven en sterk gedraaide BAC plasmide-DNA hieronder, zijn zichtbaar in het midden van de buis onder langgolvig ultraviolet licht. Een minimale volume (~ 400 ul) van de onderste BAC DNA-band werd zorgvuldig verzameld door prikken van een gat met een spuit op de zijkant van de buis. Vervolgens de EtBr werd uit de BAC DNA door butanolextractie en de EtBr vrije BAC DNA werd geconcentreerd door ethanolprecipitatie.

De laatste stap is het bepalen van de specifieke infectiviteit van de synthetische RNA's in vitro getranscribeerd vanaf de full-length SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2) na RNA-transfectie in gevoelige cellen (Figuur 4). Deze stap omvat drie opeenvolgende stappen: Stap 1, linearisatie van de full-length SA ₁₄ -14-2 cDNA aan het 3'-einde van het virale genoom (Figuur 4A); Stap 2, de productie van synthetische RNA's van de gelineariseerde cDNA door de run-off transcriptie (Figuur 4B); en stap 3, redding van de recombinante virussen in BHK-21-cellen getransfecteerd met de synthetische RNA's (figuur 4C). Experimenteel twee onafhankelijke klonen van pBAC / SA ₁₄ -14-2 werden gelineariseerd met XbaI digestie en behandeld met MBN de vier basen 5 'overhang die door het XbaI-digestie verwijderd. De gelineariseerde BACs werden gereinigd door fenol-chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie. De linearisatie van de twee gezuiverde BACs werd gedemonstreerd op een 0,8% agarosegel (Figuur 5A). De fenol-chloroform extractie moet zorgvuldig gebeuren zodat het gelineariseerde BACs zijn RNase-free. Beide gelineariseerde BACs diende als een template voor cDNA run-off transcriptie met behulp SP6 RNA polymerase in aanwezigheid van de m ⁷ G (5 ') ppp (5) Dop analoog. De integriteit van de synthetische RNA's werd aangetoond door het uitvoeren van aliquots van de twee transcriptie-reactiemengsels op een 0,6% agarose gel, samen met een referentie 1 kb DNA ladder (Figuur 5B). In deze eenvoudige bepaling, de belangrijkste prominente RNA band altijd slechts migreerde onder de 3 kb DNA-band en leek scherp te zijn. Echter, gedegradeerd RNA zou uitgesmeerd verschijning op dezelfde gel hebben.

Een infectieuze center assay is de gouden standaard voor het bepalen van de specifieke infectiviteit van de synthetische RNA's. Deze test werd uitgevoerd door electroporating BHK-21 cellen met RNA-monsters, zaaien gelijke hoeveelheden van de 10-voudig serieel verdund geëlektroporeerde cellen in 6-well platen met naïeve BHK-21 cellen (3 x 10 ⁵ cellen / putje), en bedekken agarose op de cel monolagen. Na incubatie gedurende 4 dagen werden de overlevende cellen gefixeerd met formaldehyde en gekleurd met kristalviolet sPLOSSING het aantal infectieuze centra (plaques), dat overeenkomt met het aantal infectieuze RNA-moleculen afgegeven in de cellen (Figuur 6A) te kwantificeren. Aangezien de cDNA template voor in vitro transcriptie bewezen niet besmettelijk, werd ²⁷ een hoeveelheid van de transcriptie reactiemengsel direct gebruikt voor elektroporatie. Elektroporatie is de voorkeurswerkwijze voor transfectie van RNA; Als alternatief kan RNA worden getransfecteerd met behulp van andere werkwijzen DEAE-dextran en kationische liposomen. RNA elektroporatie is zeer effectief, maar "vonkontlading" van de elektrische puls treedt zelden of zouten aanwezig in de elektroporatie reactie of de elektroporatie cuvette wordt hergebruikt zijn. De expressie van virale eiwitten in RNA-getransfecteerde cellen werd onderzocht door immunofluorescentie assays gebruik van een anti-NS1 konijnen antiserum (figuur 6B). De productie van virale deeltjes verzameld in de supernatanten van RNA-getransfecteerde cellen wasalyzed door plaque assays (figuur 6C). De resultaten van deze experimenten tonen duidelijk aan dat de cDNA-afgeleide synthetische RNA infectieus permissief BHK-21-cellen, het genereren van een hoge titer van recombinant virus.

Oligonucleotide	Sequentie een (5 'tot 3')	Stand b	Polariteit
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	Antisense
1F	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	22/01	Zin
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532-2553	Antisense
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	Mierik voel
2F	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800-1821	Zin
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	Antisense
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	Antisense
3F	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	Zin
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	Antisense
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10.952-10.977	Antisense
4F	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	Zin
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	10.956-10.977	Antisense
SP6F	cataccccgcgtattcccac ta		Zin
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	14/01	Antisense
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	17/01	Zin
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	Antisense
X1F	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	Zin
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	Antisense
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	Zin
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		Antisense
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10.670-10.694	Zin
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10.954-10.977	Antisense
een JEV sequenties worden weergegeven in hoofdletters, en BAC sequenties zijn aangegeven in kleine letters. b Nucleotide positie verwijst naar de volledige genoomsequentie van JEV SA 14 -14-2 (Genbank nummer JN604986).

Tabel 1: Oligonucleotiden gebruikt voor cDNA-synthese, PCR-amplificatie en mutagenese BAC.

Figuur 1.0, Strategie voor de constructie van een full-length cDNA van JEV SA ₁₄ -14-2 als BAC (A) Isolatie van viraal RNA van JEV deeltjes.. Getoond is een schematisch diagram van het genomische RNA van JEV SA ₁₄ -14-2. (B) Synthese van vier overlappende cDNA-fragmenten (F1 tot F4) voor de gehele virale genoom. (C) Subklonering van vier overlappende cDNA-fragmenten in een BAC vector, het creëren van pBAC / F1 aan pBAC / F4. (D) Wijziging van de gekloonde cDNA's voor run-off transcriptie in vitro. pBAC / F1 ^SP6 is een derivaat van pBAC / F1 de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de virale 5'-uiteinde bevat. pBAC / F3 ^KO is een derivaat van pBAC / F3 die een stille puntmutatie (A ⁹¹³⁴ → T, asterisk) bevat. pBAC / F4 ^RO is een derivaat van pBAC / F4 dat een kunstmatige XbaI afvloeiing stroomafwaarts van het virale 3'-uiteinde bevat. (E strong>) Vergadering van een full-length SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA ₁₄ -14-2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Synthese van vier overlappende cDNA-fragmenten (F1 tot F4) verspreid over de volledige lengte genomische RNA van JEV SA ₁₄ -14-2. De vier RT-PCR producten worden geëvalueerd door elektroforese in een 0,8% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. De verwachte grootte van de vier cDNA-fragmenten worden aangegeven aan de onderkant van het beeld van de gel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
Figuur 3. Zuivering van de BAC met een volledige lengte cDNA van JEV SA ₁₄ -14-2. Is de BAC plasmide geïsoleerd uit E. coli DH10B door de SDS-alkalische lysismethode en verder gezuiverd door middel van strepen in een CsCl-EtBr verloop. Gepresenteerd is een voorbeeld van de CsCl-EtBr gradiënt met behulp van een 16 × 76 mm afsluitbare polypropyleen buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Overzicht van de terugwinning van infectieuze virussen uit een full-length JEV SA ₁₄ -14-2 cDNA geassembleerd in een BAC. (A) Linearisatie van de cDNA template. De full-length JEV BAC wordt gesneden metXbaI en behandeld met MBN. (B) Bereiding van de RNA-transcripten. De gelineariseerde cDNA getranscribeerd door SP6 RNA polymerase in aanwezigheid van de m ⁷ G (5 ') ppp (5') Dop analoog. (C) Herstel van de synthetische JEVs. De in vitro getranscribeerd RNA worden getransfecteerd in BHK-21 cellen door elektroporatie, die een hoge titer van synthetische virus genereert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Synthese van RNA van in vitro transcriptie met behulp van een full-length BAC JEV cDNA als matrijs. (A) Vorming van het gelineariseerde full-length JEV BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2. Twee onafhankelijke klonen van pBAC/ SA ₁₄ -14-2 (Cl.1 en Cl.2) worden gelineariseerd door digestie met XbaI en daaropvolgende behandeling met MBN. De gelineariseerde BACs worden onderzocht door elektroforese in een 0,8% agarosegel. (B) De productie van de synthetische RNA's door de run-off transcriptie. Beide gelineariseerde BACs wordt gebruikt als een matrijs voor SP6 RNA-polymerase run-off transcriptie. Porties van de twee transcriptie-reacties worden uitgevoerd op een 0,6% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Specifieke besmettelijkheid van de synthetische RNA getranscribeerd van een full-length JEV BAC en het herstel van de synthetische virus. BHK-21 cellen zijn mock-geëlektroporeerd (Mock) of geëlektroporeerd met de RNA-transcripten afgeleid frOM elk van de twee onafhankelijke klonen van de volledige lengte JEV BAC (Cl.1 en Cl.2). (A) RNA infectiviteit. De cellen bedekt met agarose en gekleurd met kristalviolet in 4 dagen na transfectie. RNA infectiviteit wordt bepaald door infectieuze midden assays voor de hoeveelheid infectieus RNA geëlektroporeerd in cellen (linker paneel) te schatten. Ook representatieve beelden van besmettelijke centra worden weergegeven (rechter paneel). (B) Eiwitexpressie. De cellen worden gekweekt in 4 putjes objectglaasjes kamer. Virale eiwitexpressie in RNA-geëlektroporeerde cellen op 20 uur na transfectie (HPT) wordt geanalyseerd door immunofluorescentie assays Een primair anti-NS1 konijnen antiserum en een secundair Cy3-geconjugeerd geiten anti-konijnen IgG (rood). De kernen worden tegengekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (blauw). De immunofluorescentie beelden worden bedekt op de bijbehorende differentiële interferentie contrast beelden. (C) virusopbrengst. De cellen worden gekweekt in 150 mm cultuur gerechten. De productie van infectueuze virionen opgebouwd in de kweeksupernatanten van RNA-geëlektroporeerde cellen op 22 en 40 HPT wordt onderzocht door plaque assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol is met succes gebruikt om full-length infectieuze cDNA-klonen van twee verschillende stammen (CNU / LP2 SA ²⁷ en ₁₄ -14-2 ²⁸⁾ van JEV, een flavivirus waarvan de functionele cDNA bleek inherent moeilijk samen te stellen is en genereren propageren vanwege toxiciteit gastheercel en de genetische instabiliteit van gekloneerde cDNA ^8,74-76 Dit protocol omvat drie hoofdcomponenten. eerste, het maximaliseren van de synthese / amplificatie van cDNA een getrouwe kopie van het virale RNA met behulp van high-fidelity reverse transcriptase / DNA polymerase; tweede, het kloneren van de virale prM-E coderend gebied dat toxische sequenties (ongepubliceerde gegevens) ^74,77,78 in een zeer lage kopieaantal vector BAC uit de oorspronkelijke cDNA subkloneren tot de uiteindelijke volledige lengte cDNA montagestappen; en de derde, gebruik van een kloneringsvector die BAC kan een vreemd DNA met een gemiddelde grootte van 120-350 kb, ^19-21 die blijkbaar tolereert grotere DNA inserts dan andere kloneringsvectoren. Deze klonering wordt algemeen toepasbaar op vele andere positieve streng RNA-virussen, met name die met een groot RNA-genoom van ~ 10 tot 32 kb. Genereren van een infectieuze cDNA-kloon is een belangrijke stap in de ontwikkeling van een reverse genetics voor RNA-virussen, met name positieve streng RNA-virussen, omdat het genoom treedt virale mRNA dat vertaald in eiwitten door gastheercel ribosomen. Aldus kan virale replicatie worden gestart door de introductie van een cDNA-afgeleide genoom-lengte RNA molecuul in een vatbare gastheercel. De beschikbaarheid van een infectieus JEV cDNA-kloon, in combinatie met recombinant DNA-technologie, heeft ons begrip van verschillende aspecten van de virale levenscyclus verhoogd op moleculair niveau, zoals genexpressie ^73,79 en genoomreplicatie. ^63,64 ook een full-length JEV cDNA-kloon blijkt een waardevol instrument voor de ontwikkeling van antivirale vaccins ²⁸ en gentherapie vectoren. ^80,81

Zoals bij alle positieve streng RNA virussen er meerdere kritische stappen bij het ​​construeren van een betrouwbare functionele cDNA voor JEV waaruit zeer besmettelijke RNAs kunnen worden gesynthetiseerd in vitro. Idealiter zou de sequentie van de synthetische RNA getranscribeerd van een kloon van volledige lengte cDNA identiek zijn aan die van het virale genomische RNA, met name de 5'- en 3'-terminale sequenties die nodig zijn voor de initiatie van virale RNA replicatie . ^60-62 In het huidige protocol, de authentieke 5'- en 3'-uiteinden werden verzekerd door het plaatsen van de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de eerste adenine nucleotide van het virale genoom en positioneren van een unieke kunstmatige XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van de laatste thymine nucleotide van het virale genoom, respectievelijk. Capped synthetische RNAs met authentieke 5 'en 3' uiteinden werden geproduceerd door run-off transcriptie van een XbaI-gelineariseerd en MBN behandelde cDNA template gebruik SP6 RNA polymerase geprimed met m ⁷ G (5 ') ppp (5') Dop analoog. Dit protocol kan worden gemodificeerd op verschillende manieren. Voor in vitro transcriptie kan een bacteriofaag RNA-polymerase (bijvoorbeeld T3 of T7) worden gebruikt in combinatie met een goed gedefinieerde promotorsequentie. ²⁷ als run-off site, kan een andere restrictieplaats worden toegepast als het niet presenteren het virale genoom en als synthetische RNA van de gelineariseerde cDNA eindigt met de authentieke 3 'uiteinde. Het belang van het 3'-uiteinde nucleotidesequentie werd aangetoond door een ~ 10-voudige afname in infectiviteit RNA wanneer een synthetisch RNA bevat drie of vier-verbonden-virus nucleotiden aan het 3 'uiteinde. ²⁷ In een in vitro transcriptie reactie, zowel de m ⁷ G (5 ') ppp (5') A en m ⁷ G (5 ') ppp (5') G cap analoog kan evengoed gebruikt, hoewel deze plaatsen een ongerelateerde extra G nucleotide stroomopwaarts van het virale 5 '-end, maar datBovendien neemt niet weg infectiviteit of replicatie van synthetisch RNA. ²⁷ Bovendien is het verwijderen van de matrijs cDNA van het RNA transcripten met DNase I digestie is niet noodzakelijk RNA infectiviteit testen, omdat de cDNA sjabloon zelf is niet besmettelijk. ²⁷

De BAC-technologie is nu toegepast op de bouw van infectueuze cDNA-klonen voor een handvol positieve streng RNA-virussen, namelijk twee JEVs, CNU / LP2 ^{27 en} SA ₁₄ -14-2 ²⁸ (genoomgrootte, ~ 11 kb); twee dengue virussen, BR / 90, ^{26 en} NGC ²⁹ (~ 11 kb); het bovine virale diarree virus, SD1 (~ 12 kb), ²⁵ twee klassieke varkenspest virussen, C en Paderborn (~ 12 kb), ²⁴ de border disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), ²⁴ het porcien reproductief en respiratoir syndroom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); ³⁰ de overdraagbare gastro-enteritis virus, PUR46-MAD (~ 29 kb); ¹⁶ de feline infectieuze peritonitis virus,DF-2 (~ 29 kb); ³² het Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus, Urbani (~ 30 kb); ⁹ het Midden-Oosten respiratoir syndroom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), ^{17 en} het menselijk coronavirus, OC43 (~ 31 kb) ³¹ Het belangrijkste voordeel van het gebruik van BAC's voor cDNA constructie is het hoge genetische stabiliteit van de grote, 1- of 2-kopie plasmiden BAC.; De intrinsieke aard van zijn extreem lage aantal kopieën is ook een groot nadeel, omdat zeer lage opbrengsten van BAC DNA en de daaruit voortvloeiende verlaging van de zuiverheid van het BAC DNA opzichte van chromosomaal DNA gastheer. In het huidige protocol is de opbrengst van BAC DNA gemaximaliseerd door groeiende E. coli DH10B getransformeerd met de besmettelijke BAC pBAC / SA ₁₄ -14-2 in een voedselrijke medium, 2xYT. Dit neemt de gemiddelde opbrengst slechts ~ 15 pg BAC DNA van 500 ml 2xYT bouillon. Tevens is de zuiverheid van het BAC DNA best bereikt door CsCl-dichtheidsgradiënt centrifugatie EtBr voor zuiveringIn plaats van de gebruikelijke kolommen gebaseerde plasmide-isolatie. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat de BAC-getransformeerde E. coli mag niet overwoekeren, omdat het de genetische stabiliteit van het gekloonde cDNA in gevaar kan brengen, en een hogere groei leidt niet noodzakelijk tot een grotere opbrengst of hogere zuiverheid BAC DNA.

De hier beschreven protocol is een geoptimaliseerde, efficiënte en gestroomlijnde werkwijze voor de constructie en vermeerdering van een genetisch stabiele full-length infectueuze cDNA-kloon als een BAC voor JEV, een procedure ooit gedacht praktisch onmogelijk. Dezelfde klonen strategie kan ook worden toegepast op vele andere positieve streng RNA virussen. In het algemeen infectieuze cDNA-klonen kunnen wij verschillende mutaties (bijvoorbeeld deleties, inserties en puntmutaties) introduceren in een viraal RNA-genoom van hun biologische functies te bestuderen virale replicatie en pathogenese. Deze cDNA-gebaseerde reverse genetics systeem maakt het mogelijk om de ontwikkeling en test vaccins en therapeutische kandidaten richten een virulentiefactor (en) van een bepaalde positieve streng RNA-virus van belang. Bovendien kan deze infectieuze cDNA techniek ook worden gebruikt als een virale vector, in staat is tot expressie van een vreemd gen (en) van belang voor vele toepassingen in biomedisch onderzoek.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1. Moleculaire Kloning
2xYT Broth	Sigma-Aldrich	Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	Radioactief
50 ml Buis	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
250 ml Fles	Beckman Coulter	356011
Agarose	Lonza	50004
Agarose (Laag Smeltpunt)	Life Technologies (Invitrogen)	16520-100
AvaI	New England BioLabs	R0152S
AvrII	New England BioLabs	R0174S
BamHI	New England BioLabs	R0136S
BsiWI	New England BioLabs	R0553S
BsrGI	New England BioLabs	R0575S
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Cesium Chloride	Fisher Scientific	BP1595-1
Chloramfenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	Carcinogeen
DE-81 Filterpapier	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
dNTP mix	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E7637	Toxisch en zeer mutageen
Filterkolom (Plasmid Maxiprep Kit)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
Glazuur Azijnzuur	Sigma-Aldrich	A6283	Irriteerbaar
Glucose	Sigma-Aldrich	G5400
Glycogen	Roche	10901393001
Hoog-getrouwe DNA Polymerase	New England BioLabs	M0491S
Isoamyl Alcohol	Sigma-Aldrich	I9392	Ontvlambaar
Isopropanol	Amresco	0918	Ontvlambaar
LB Broth	Life Technologies (Invitrogen)	12795-027
Lithium Chloride	Sigma-Aldrich	L9650
Lysozyme	Amresco	0663
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
M-MLV Reverse Transcriptase	Life Technologies (Invitrogen)	18080-044
Mung Bean Nuclease	New England BioLabs	M0250S
Naald (18G, 20G)	BD	305196, 305175	Biogevaarlijk (Scherp afval)
NotI	New England BioLabs	R0189S
Oligonucleotide	Integrated DNA Technologies	Custom Oligonucleotide Synthese
PacI	New England BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
Fenol (Buffer-verzadigd)	Life Technologies (Invitrogen)	15513-039	Toxisch en zeer corrosief
Fenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Life Technologies (Invitrogen)	15593-031	Toxisch en zeer corrosief
Fenol:Guanidine Isothiocyanaat	Life Technologies (Ambion)	10296-010	Toxisch, corrosief en irriterend
Pme I	New England BioLabs	R0560S
Kalium Acetaat	Amresco	0698
RNase Inhibitor	Life Technologies (Invitrogen)	10777-019
rNTP Set	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
Versluitbare Polypropyleen Buis (16 × 76 mm)	Beckman Coulter	342413
SfiI	New England BioLabs	R0123S
Sma I	New England BioLabs	R0141S
Natrium Acetaat	Sigma-Aldrich	S2889
Natrium Dodecyl Sulfaat	Amresco	0227
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
SP6 RNA Polymerase	New England BioLabs	M0207S
Spinkolom (Plasmid Miniprep Kit)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-11
Spuit	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
tRNA (gist)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
XbaI	New England BioLabs	R0145S
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2. Celcultuur
Alpha Minimum Essentieel Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Conische Buis (50 mL)	VWR	21008-242
Kristal Violet	Sigma-Aldrich	C0775
Kweekschaal (150 mm)	TPP	93150
Cuvet (2-mm Gap)	Harvard Apparatus	450125
Fetaal Rundserum	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F1635	Toxisch en kankerverwekkend
Glutamine	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimum Essentieel Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-