Methodenartikel

Snel

DOI:

10.3791/53165

⸱

23 september 2015

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een snelle en vereenvoudigde in situ hybridisatiemethode die ideaal is voor paraformaldehyde-gefixeerde hersenen, waardoor de noodzaak voor langdurige complexe stappen wordt verminderd bij het gebruik van vers bevroren weefsels. De methode is gevalideerd met behulp van de identificatie van het serotonine 5-HT2A receptorgen htr2a bij ratten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3,4-Methyleendioxymethamfetamine (MDMA; ecstasy) toxiciteit kan region-specifieke veranderingen in serotonerge mRNA-expressie veroorzaken als gevolg van een acuut serotonine (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndroom. Deze hypothese kan worden getest met behulp van in situ hybridisatie om het serotonine 5-HT2A receptorgen htr2a te detecteren. In het verleden waren dergelijke procedures, met behulp van radioactieve riboprobe, moeilijk vanwege de gecompliceerde workflow die meerdere dagen nodig heeft om uit te voeren en de extra moeilijkheid dat de techniek het gebruik van vers bevroren weefsel vereiste dat in een RNase-vrije omgeving werd bewaard. Onlangs heeft de ontwikkeling van korte oligonucleotide probes in situ hybridisatieprocedures vereenvoudigd en het gebruik van paraformaldehyde-prefixed hersensneden mogelijk gemaakt, die breder beschikbaar zijn in laboratoria. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol met behulp van niet-radioactieve oligonucleotide probes op de prefixed hersengeweefsels. Hybridisatie probes die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn dapB (een bacterieel gen dat codeert voor dihydrodipicolinate reductase), ppiB (een housekeeping gen dat codeert voor peptidylprolyl isomerase B) en htr2a (een serotonine gen dat codeert voor 5-HT2A receptoren). Deze methode is relatief eenvoudig, goedkoop, reproduceerbaar en vereist minder dan twee dagen om te voltooien.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serotonine (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndroom is een acuut neurologisch stoornis veroorzaakt door 5-HT-bevorderende geneesmiddelen zoals antidepressiva1, terwijl het ook voorkomt in situaties van MDMA-gebruik voor recreatief gebruik2. Moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor stemmingswisselingen, leer- en geheugentekorten die optreden in verband met het acute syndroom, zijn niet goed begrepen3,4. In situ hybridisatie is een krachtig onderzoeksinstrument dat de detectie en kwantificering van specifieke mRNA's mogelijk maakt, die mogelijk op eencellig niveau worden tot expressie gebracht. De conventionele manier om in situ hybridisatie uit te voeren, is het gebruik van een radioactief gelabelde riboprobe die specifiek het gen van belang hybridiseert. Een groot nadeel is echter dat de methode een gecompliceerde en tijdrovende sondevoorbereiding en hybridisatie vereist, evenals toegang tot vers bevroren weefsel dat in een RNase-vrije omgeving wordt bewaard5,6.

Oligonucleotide-sondes zijn onlangs ontwikkeld om korte RNA-fragmenten te hybridiseren dan die vereist zijn voor riboprobes7. Bovendien produceren de sondes een laag achtergrondsignaal zonder de specificiteit op te offeren8. Deze nieuw ontwikkelde sondetechnologie kan worden gebruikt voor in situ hybridisatie op paraformaldehyde-gefixeerde hersenweefsels die gewoonlijk beschikbaar zijn in immunocytochemische laboratoria.

Hier beschrijven we een protocol voor in situ hybridisatie met behulp van oligonucleotide-sondes op paraformaldehyde-gefixeerde rattenhersenen en vergelijken de bevindingen met die in een vers bevroren hersen5,6. Dit protocol wordt gebruikt om de hypothese te testen dat MDMA-misbruik veranderingen veroorzaakt in 5-HT2A receptor gen htr2a mRNA in de hersenen. We begonnen de procedure met MDMA-behandeling gevolgd door paraformaldehyde weefselperfusie van het dier, in situ hybridisatie van de thr2a sonde en data-analyse. Merk op dat dapB (het bacteriële gen dat codeert voor dihydrodipicolinate reductase) wordt gebruikt als negatieve controle, en ppiB (huishoudgen dat codeert voor peptidylprolyl isomerase B) als positieve controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierlijk gebruik procedures hieronder beschreven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan Ross University School of Veterinary Medicine en de Florida Atlantic University. Hoewel steriele technieken en handschoenen vereist zijn, de RNase-vrije omgeving niet nodig is tijdens het gebruik van dit protocol.

1. Voorbereiding

  1. Tissue voorbereiding en snijden
    1. Ratten willekeurig toekennen in drie groepen: verse / zoutoplossing (SAL; 0,9% NaCl), voorafgegaan / SAL en voorafgegaan / 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA, zie details in tabel 1).
    2. Dien drie doses van 1 ml / kg SAL en 10 mg / kg intraperitoneaal MDMA respectievelijk, de SAL en MDMA groepen 2 uur interval. Toestaan ​​dat dieren op de behandeling overleven voor 6 dagen.
    3. Op dag 7, bestuurt 100 mg / kg ketamine bij combinatie van 5 mg / kg xylazine intraperitoneaal aan de ratten een diepe narcose (bijvoorbeeld verlies van cornea knipperen en tail knijpen reflexen).
    4. Voor de verse / SAL groep snel onthoofden ratten en verwijder de hersenen voor de verse hersenen-test (zie details in de referentie 5).
    5. Voor de vooraf / SAL en voorvoegsel / MDMA groepen maken een snede langs het borstbeen ongeveer 10 -12 cm en dan het einde van het borstbeen bloot.
    6. Het uiteinde van het borstbeen met een hemostaat en snijd de membraan zijdelings aan beide zijden met scherpe schaar en knip omhoog over de ribben en evenwijdig aan de longen.
    7. Met een hand, houd de ventrale punt van het hart met kleine tang. Met de andere hand, doorboren de linker hartkamer met een 18 G injectienaald (let op de adapter kant van de naald is verbonden met een Y-vormige siliconen slang ijskoude SAL en paraformaldehyde containers en peristaltische pompen, zie referentie 9).
    8. Zet de SAL pomp op het middenniveau van de stroomsnelheid (~ 5 ml / min) en het rechter atrium doorboren met een tang om het ontsnappen van terugkeer circ toestaanning. Handhaaf SAL perfusie gedurende 30 min.
    9. Zet de pomp paraformaldehyde op het middenniveau en laat de ijskoude 4% paraformaldehyde het dier perfuseren gedurende 30 min.
    10. Verwijder perfusie instrument en onthoofden het dier. Maak een posteroanterior dwars door de middellijn van de schedel, en dan flap de schedel aan de schedel holte 10 bloot te leggen.
    11. Verwijder de hersenen met een spatel uit de schedel holte en plaats de hersenen in een 50 ml centrifugebuis die 25 ml 4% paraformaldehyde. Houd de hersenen binnen de paraformaldehyde bevattende buis bij 4 ºC koelkast gedurende 24 uur.
    12. Verplaats de hersenen in een 50 ml centrifugebuis die 25 ml 30% sucrose-oplossing bij 4 ° C gedurende 3 dagen. Uiteindelijk slaan de hersenen in plastic zakken bij -80 ° C tot gebruik.
    13. Monteer de hersenen op een boorkop met het inbedden van de media en de verankering van media die de hersenen bevriezen in een cryostaat bij een temperatuur van -26 ºC. Snijd de verse bevroorn hersenen in 20 urn secties en paraformaldehyde-voorvoegsel hersenen in 10-um secties. Breng de sectie om een ​​RT microscoopglaasje door het aanraken van de dia naar de sectie.
    14. Lucht drogen bij kamertemperatuur gedurende 4 uur. Sla het gedeelte schuift in een strak verzegelde zak bij -80 ° C tot gebruik.
  2. Uitdroging
    1. Neem dia's uit de -80 ° C vriezer en toewijzen delen in een van de drie tests: HT2A, ppiB (positieve controle) of dapB (negatieve controle); merk en label secties met een balpen (geen gebruik maken van een potlood). Dompel slides in 100% alcohol bij kamertemperatuur 5 min. Droog de glaasjes gedurende 5 minuten in een zuurkast.
  3. Voorbehandeling
    1. Pipetteer 20 ul van de voorbehandeling-1 reagens (inactivatie van alkalische fosfatase) aan de secties op objectglaasjes. Plaats de glaasjes op een rackrail in een vocht tray (De lade is bedekt met een deksel met een hoge vochtigheidsgraad te handhaven ter voorkoming verdamping uit de reactie solution).
    2. Schud het vocht lade op een horizontale schudder bij een lage snelheid gedurende 10 min. Was de dia's tweemaal met dubbel gedestilleerd water (DDH 2 O) voor 2 min. Dompel de schuif in een bekerglas van 200 ml met 150 ml van de voorbehandeling 2-reagens (het breken van de verknopingen geïnduceerd door paraformaldehyde fixatie). Kook de objectglaasjes gedurende in totaal 5 minuten bij 100 ° C (warmte geïnduceerde herstel van de RNA structuur 11).
    3. Was de glaasjes tweemaal met DDH 2 O 2 min. Plaats de objectglaasjes in 100% alcohol gedurende 5 min. Droog de dia's voor 5 min in de zuurkast. Gebruik van een hydrofoob pen een cirkel rond het geselecteerde gebied in het weefsel te trekken (bijvoorbeeld, niet-ritmische, waaronder thalamus en hypothalamus zoals geschetst in figuur 2).
    4. Pipetteer 10 ul van de voorbehandelingsvloeistof 3-reagens (verhogingen sondepenetratie) aan elk geselecteerd gebied en bedekken het vocht tray met deksel. Plaats de bak in de hybridisatieovenuitgerust met de horizontale shaker en stel de temperatuur van de oven op 40 ° C; schud de lade voor 30 min. Was de glaasjes tweemaal met DDH 2 O 2 min.

2. Hybridisatie en Amplificatie

  1. Pipetteer 10 ul van htr2a, ppiB en dapB probe reagentia, respectievelijk op de geselecteerde gebieden. Bedek het vocht tray met deksel om verdamping van het reagens te verhinderen. Schud op de horizontale shaker ingesteld op een lage snelheid. Incubeer de glaasjes bij 40 ° C in de oven gedurende 2 uur.
  2. Was de glaasjes tweemaal met een wasbuffer gedurende 2 min. Pipet 10 ul van de Amplification-1 reagens op elk geselecteerd gebied, schudden en incubeer de dia's bij 40 ° C gedurende 30 minuten.
  3. Was de glaasjes tweemaal met een wasbuffer gedurende 2 min. Pipet 10 ul van de Amplification-2 reagens op elk geselecteerd gebied, schudden en incubeer de dia's bij 40 ° C gedurende 15 min.
  4. Was de dia's twee keer wet een wasbuffer gedurende 2 min. Pipet 10 ul van de Amplification-3 reagens op elk geselecteerd gebied, schudden en incubeer de dia's bij 40 ° C gedurende 30 minuten.
  5. Was de glaasjes tweemaal met een wasbuffer gedurende 2 min. Pipet 10 ul van de Amplification-4 reagens op elk geselecteerd gebied, schudden en incubeer de dia's bij 40 ° C gedurende 15 min.
  6. Was de glaasjes tweemaal met een wasbuffer gedurende 2 min. Pipetteer 10 ul van de amplificatie-reagentia 5 voor elk gekozen gebied, schudden en incubeer de glijbanen bij kamertemperatuur 30 min.
  7. Was de glaasjes tweemaal met een wasbuffer gedurende 2 min. Pipetteer 10 ul van de amplificatie-6 reagens op elk geselecteerd gebied, schudden en incubeer de glijbanen bij kamertemperatuur 15 min. Was de glaasjes tweemaal met een wasbuffer gedurende 2 min.

3. Signal Detection

  1. Pipetteer 10 ul van het Red reagens aan elk geselecteerd gebied (Merk op dat het reagens een mengsel van rood en rood-B-A in een 1:60 verhouding en moet i wordenmmediately). Plaats de dia in het vocht lade op de horizontale schudinrichting bij kamertemperatuur en voorzichtig schudden bij een lage snelheid gedurende 10 min.
  2. Was de glaasjes tweemaal met (DDH 2 O) gedurende 10 min. De dia's bij 60 ° C drogen in de oven gedurende 15 min. Plaats de objectglaasjes in xyleen onder de zuurkast gedurende 5 min. Pipet 20 ul-xyleen gebaseerde montage media op elk geselecteerd gebied en bedek met een dekglaasje.

4. Fotolader

  1. Neem digitale microfoto's van de geselecteerde gebieden (bijvoorbeeld hypothalamus, figuren 1 en 3) met een vergroting van 4 × 20 × en objectieven. Sla het beeldbestand.

5. Afbeelding Particle Analysis

  1. Sleep de image-bestand in de belangrijkste ImageJ venster. Ga naar de menubalk en selecteer 'Afbeelding', naast selecteer 'Type' uit het drop-down menu, en selecteer '8-bit'.
  2. Kies 'Aanpassen' en selecteer 'Threshold 'om het dialoogvenster te openen. Pas de onderste balk waarde in het dialoogvenster, zodat de ongewenste achtergrond wordt verwijderd. Ga naar de menubalk en selecteer 'Analyseren', selecteer 'Analyze Deeltjes' om een ​​tweede dialoogvenster te openen.
  3. Stel deeltjesgrootte op 10, daarna selecteert u 'Toon schetst' en selecteer 'Geef resultaten' en 'samenvatten' dozen. Tot slot klikt u op 'OK' om deeltjes gegevens te zien in de dialoogvensters.

6. Spreadsheet Berekening

  1. Voer de gegevens in het Excel en het gemiddelde van het aantal deeltjes in de SAL groep als basislijn. Bereken het percentage van elk gedeelte en een dienovereenkomstig grafiek (figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oligonucleotide RNA probes (<25 nt), kan hybridisatie worden gedetecteerd als rode punten in de hypothalamus cellen bereid uit het paraformaldehyde en vooraf bevroren hersenen. De htr2a mRNA-moleculen aanwezig in sommige cellen (met getrokken pijlen), maar anderen niet (open pijl). We vonden dat er geen verschil tussen de vooraf paraformaldehyde en vers ingevroren weefsel (Figuur 1). Succesvolle hybridisatie kan eerst worden geëvalueerd met het blote oog (figuur 2). We vo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de belangrijkste punten bij een in situ hybridisatietest is het kiezen van geschikte technieken voor RNA-behoud vanwege RNase-enzymen. Het is bekend dat deze enzymen wijdverspreid aanwezig zijn in de cellen en het milieu, wat de resultaten kan beïnvloeden. De enzymactiviteit kan echter snel worden onderscheiden door het weefsel in de droogijs/alcohol-oplossing te plaatsen5,12. Hoewel snelle bewaring cruciaal is voor hybridisatie met een riboprobe13, is er weinig bekend over de exper...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de NIH-subsidie ​​(R15DA029863), de Florida Atlantic University undergraduate onderzoek subsidie ​​(M30014) en de Ross University School of Veterinary Medicine onderzoek subsidie. We willen graag het National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) bedanken voor het verstrekken van (±) 3,4-methyleendioxymethamfetamine (± MDMA) voor dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RNAscope Negative Control Probe-DapBAdvanced cell diagnostic, INC310098
RNAscope Pretreat 4Advanced cell diagnostic, INC320046
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - RedAdvanced cell diagnostic, INC310036
RNAscope Probe - Rn-PpibAdvanced cell diagnostic, INC313921
Rat Htr2aAdvanced cell diagnostic, INC300031
CryostatLeicaCM 1850
Horizontal shakerVWR88032-088
Hybridization ovenThermo Fisher Scientific222000
Superfrost Plus microscope slideFisher Scientific12-550-15
Hydrophobic penVectorH-4000
MicroscopeOlympusProvis AX70

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234(2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Met paraformaldehyde gefixeerd breinHTR2A genexpressievoorbehandelingsreagentiaamplificatiestappenFast Red detectieImage J analyseRNA kwantificering

Gerelateerde artikelen