Dit manuscript beschrijft een knaagdiermodel om trigeminale neuropathische pijn te bestuderen. De beschreven methoden omvatten chirurgische procedures om een chronische constriktie-blessure van de infraorbitale zenuw van de rat uit te voeren en de post-operatieve gedragstests om de veranderingen in spontaan en uitgelokt gedrag te meten die indicatief zijn voor aanhoudende pijn en allodynie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chronische Vernauwing Letsel van de Rat's infraorbitale Nerve (ionen-CCI) om te studeren Trigeminal neuropathische pijn
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diermodellen zijn belangrijke instrumenten om de pathofysiologie en farmacologie van neuropathische pijn te bestuderen. Dit manuscript beschrijft de chirurgische en gedragsmatige procedures om trigeminus neuropatische pijn bij ratten. Om de specificiteit van de nervus neuropathische pijn syndromen te voldoen, wordt de infraorbitale zenuw (Ion) onderworpen aan een chronische vernauwing letsel (CCI) door losjes ligeren van de zenuw. Een intra-orbitaal aanpak wordt hier gepresenteerd bloot te leggen en ligeren het ion in de orbitale holte. Na ligatie ION, ratten vertonen veranderingen in spontaan gedrag in reactie op von Frey haren stimulatie die indicatief aanhoudende pijn en mechanische allodynie zijn. Twee fasen kunnen worden gedefinieerd in de ontwikkeling van de gedragsveranderingen. Tijdens de eerste week na ionen-CCI (fase 1), ratten vertonen een verhoogde en asymmetrische gezicht verzorging activiteit, dat wil zeggen, met een gezicht wassen slagen in de eerste plaats gericht op de zenuw-gewonden IoN grondgebied. Er wordt onderscheid gemaakt tussen het gezicht groeiende gedrag dat deel uitmaakt van een algemene bodygroom gedrag, dat grotendeels onaangetast door ionen-CCI blijft en gezicht verzorgen die niet voorafgegaan of gevolgd door bodygroom, die aanzienlijk is verhoogd na ION-CCI. Gedurende deze periode wordt reactiviteit op mechanische stimulatie van het gebied IoN verminderd. Dit hyporesponsieve abrupt vervangen door een extreme hyperreactiviteit waarbij zelfs zeer zwakke stimulus intensiteiten lokken nocifensive gedrag (fase 2). De fenomenologische overeenkomsten tussen deze gedragsveranderingen en gemelde tekenen van aangezichtspijn (dwz reacties op schadelijke stimulatie van het gezicht) suggereren dat de aanwezigheid van dysesthesie / paresthesie en mechanische allodynie in de afgebonden IoN grondgebied.
Inleiding
Schade aan de somatosensorische zenuwen leidt meestal tot verlies van gevoel. Het is niet goed begrepen waarom en hoe, in sommige gevallen, perifere zenuwbeschadiging leidt tot chronische pijn. Hierdoor pijnlijke neuropathie blijft een uitdaging aandoening te behandelen 1 en resulteren in een aanzienlijke vermindering van de levenskwaliteit 03/02 patiënten. Dierlijke modellen zijn een belangrijk instrument om de effectiviteit van de bestaande en nieuw ontwikkelde geneesmiddelen te onderzoeken en de pathofysiologische mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling en het onderhoud van neuropathische pijn te identificeren. Een van de belangrijkste uitdagingen voor translationeel pijn onderzoek is het identificeren en meten van spontane pijn bij dieren (dwz, fysiologische, gedrags- of andere manifestaties die de aanwezigheid van pijn bij dieren die niet worden uitgedaagd met indringende prikkelingen die acuut worden bovenop het onderwerp basale voorwaarde geven ). Het algemene doel van deze procedure is om chirurgisch te induceren van eeninfraorbital zenuwletsel in een rat die leidt tot de ontwikkeling van zowel spontane en uitgelokte nocifensive gedrag dat kan gebruikt worden aan de bij trigeminus neuropathische pijn en de behandeling ondrzoeken.
Gericht, geïsoleerde gezicht verzorging is een unieke maatregel van spontane neuropathische pijn bij ratten. Na chronisch constrictie letsel (CCI) van de infraorbital zenuw (ION), ratten vertonen veranderingen in spontaan gedrag en reactie op tactiele stimulatie die indicatief aanhoudende pijn en mechanische allodynie 4 zijn. Volgende ionen-CCI, ratten vertonen een verhoogde en asymmetrische gezicht verzorging activiteit, dat wil zeggen, met een gezicht wassen slagen in de eerste plaats gericht op de zenuw-gewonden IoN grondgebied. In tegenstelling tot de schadelijke stimulatie van het gezicht (bijvoorbeeld formaline injectie) 5, niet-pijnlijke gevoelsstoornissen (dwz eenzijdige vibrissae knippen, verdoving infraorbitale zenuwblokkade, toepassing van minerale olie op vibriSSAE) niet of slechts zeer kort (dat wil zeggen, de eerste minuten na het begin) leiden tot een significante verandering in het gezicht verzorgen gedrag 6. Er werd geconcludeerd dat dit abnormale verzorging na ion CCI is een gedrags uiting van spontane, sterk aversieve sensaties in de gewonde zenuw grondgebied. Dit gedrag in ionen-CCI ratten draagt een sterke gelijkenis met spontane pijn bij patiënten. Verdere studies hebben een belangrijk verschil tussen het gezicht verzorging gedrag dat deel uitmaakt van een meer algemeen Bodygroom gedrag geïdentificeerd (dwz "gezicht verzorging tijdens bodygroom"), dat blijft grotendeels onaangetast door ionen-CCI en nocifensive gezicht verzorging die noch voorafgegaan noch gevolgd door bodygroom (dwz "geïsoleerde gezicht verzorgen"), die aanzienlijk is verhoogd na ION-CCI 7-9. Farmacologisch, gezicht verzorging tijdens lichaam verzorging vormt een uitstekende controle meting voor niet-specifieke effecten van geneesmiddelen ( bijvoorbeeld sedatie), die de motorische functie kan verminderen. Bewegingen van de voorpoten in de twee soorten gezicht verzorging zijn exact hetzelfde.
Volgende ionen-CCI, ratten ook veranderingen vertonen in reactie op tactiele stimulatie die indicatief zijn voor mechanische allodynie 4, 10 zijn. In de eerste week (s) na de ionen-CCI, ratten niet meer reageren op milde of matige tactiele (dwz von Frey ) stimuli. Dit hyporesponsieve wordt vervolgens abrupt vervangen door een extreme hyperreactiviteit waarbij zelfs zeer zwakke stimulus intensiteiten lokken nocifensive gedrag. Het begin van hyperreactiviteit kan variëren ratten, maar de meeste ratten hyperresponsive worden na 3-4 weken na de operatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Ethische verklaring: dieren worden behandeld en verzorgd volgens de richtlijnen van de Commissie voor onderzoek en ethische kwesties van IASP 11. Het protocol wordt goedgekeurd door de institutionele Ethische Commissie.
1. Onderwerpen
- Gebruik mannelijke Sprague-Dawley ratten (250-300 g bij aankomst).
- Huis ratten in vaste bodem kooien in een kolonie ruimte met een relatieve vochtigheid van 40-60% en een kamertemperatuur van 21 ± 1 ° C.
- Maak water en voedsel te vinden op libitum.
- Houd ratten onder een omgekeerde 00:12 uur donker / licht-cyclus (lichten aan om 20 uur).
2. Chirurgie
- Per rat, bereidt twee stukken van chroom darm ligatuur (5-0) van ongeveer 6 cm lang en plaats ze in steriele zoutoplossing om droging en steeds stijf en bros te voorkomen.
- Verdoven het dier met pentobarbital (60 mg / kg, ip) en behandel met atropine (0,1 mg / kg, ip). Monitor het niveau van de anesthesie door de uitbreiding van een been en pinching het web van de huid tussen de tenen met een nagel om te zorgen voor voldoende druk wordt toegepast. Zorg ervoor dat het dier haar ledematen niet buigen. Indien nodig, dienen aanvullende pentobarbital.
- Scheer de kop van de rat zodat een middellijn hoofdhuid incisie kan van ongeveer 25 mm bij gelijke afstanden voorste en achterste naar het midden van de ogen.
- Fix het hoofd van de rat in een stereotaxische frame of anderszins fixeren het hoofd van de rat. Plaats de rat op een verwarmde pad lichaamstemperatuur te handhaven.
- Solliciteer oogzalf aan beide ogen om schade door uitdroging te voorkomen.
- Schrob de geschoren hoofd met alcohol, dan betadine.
- Maak een middellijn hoofdhuid incisie, het blootstellen van de schedel en neusbeen.
- Gebruik een operatie microscoop te stappen 2.9 uit te voeren om 2.16.
- Ontleden de rand van de baan vrij, gevormd door de maxillaire, frontale, traan- en jukbeen botten, met behulp van een wattenstaafje en een paar Dumont tang. Gebruik het wattenstaafje zoak bloed van mogelijke bloeden.
- Om toegang te krijgen tot het ion geven voorzichtig buigen de orbitale inhoud met een precisie wattenstaafje, het verzorgen de voorste ethmoïdale zenuw die superieur is aan het ion kruist niet over te belasten. Ontleden ionvrij van het omringende bindweefsel, met een precisie wattenstaafje en een paar Dumont tang met een spreiding beweging. Gebruik het wattenstaafje om te genieten van bloed van mogelijke bloeden.
- Een ligatie voeren, druk op een uiteinde van een stuk chroomzuur darm neerwaarts langs de frontale bot mediaal van de ionen en vooraf enkele millimeters evenwijdig en inferieur aan het ion. De ligatuur is nu op zijn plaats gehouden tussen de ion en de frontale bot.
- Schuif de punt van een 45 graden schuine Dumont tang onder het ion te plaatsen in de nabijheid van de ligatuur. Zachtjes trekken de ionen zijdelings aan de ligatuur en de punt van de tang te onthullen. Pak de ligatuur met de tang en de tang zijdelings onder het ion trekken.
- Trek de ligatuur van de orbitale holte tot beide einden van de afbinding min of meer op gelijke afstand van het ion.
- Maak een "slip knot" van de twee uiteinden van de ligatuur om een perfecte controle over de mate van vernauwing toe te staan en schuif de knoop tegen het ion. Schuif de knoop na het ion vernauwen zodat de diameter van de zenuw wordt verminderd met een enkel merkbare hoeveelheid. Wordt normale knoop boven de schuifknoop zodat de hoeveelheid van beklemming constant blijft (dat wil zeggen te voorkomen dat de spleet knoop wegglijdt).
- Snijd de ligaturen tot ongeveer 2 mm van de vrije uiteinden van de knoop te verlaten.
- Herhaal deze procedure (stap 2,11 tot 2,15) naar een tweede ligatie 2 mm van elkaar maken van de eerste.
- Voor schijnvertoning chirurgie, stappen uitvoeren 2,2-2,10.
- Sluit de hoofdhuid incisie met behulp van polyester hechtingen (4-0) en laat de rat te herstellen op een verwarmde pad. Heeft het dier niet onbeheerd achter, totdat het voldoende nadelen heeft herwonnenciousness om borstligging behouden en niet het dier niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld.
- Om pre-emptive pijnstillende effecten op de ontwikkeling van neuropathische pijn te vermijden, analgesie voor post-operatieve pijn niet toedienen.
3. Behavioral testprocedure
- Sta ratten te acclimatiseren gedurende minstens 8 dagen om de woonomstandigheden voor pre-operatieve testen.
- Wennen ratten de testprocedure ten minste eenmaal per dag gedurende drie dagen voor pre-operatieve testen.
- Gedrag testen in een verduisterde kamer met licht door een 60 W rode lamp opgehangen 1 m boven het midden van het testgebied aansteken van het centrum, maar het verlaten van de omtrek dim en de rest van de kamer donker.
- Zorg ervoor dat er voldoende achtergrondgeluiden om interferentie van plotselinge auditieve stimulatie verminderen. Indien nodig, witte ruis.
- Observatie van het gezicht verzorging gedrag
- TERVOER een enkele rat van de kolonie op de proef kamer in een overdekte plastic kooi zonder beddengoed. Opmerking: Idealiter zou dit een korte trip met minimale externe prikkels zijn.
- Plaats de rat in een overdekte, transparante plastic kooi zonder beddengoed (lxbxh: 24 cm x 14 cm x 17 cm) met een rug in de voorkant van een videocamera gespiegeld.
- Wordt 10 min registratie van het gedrag van het dier. Tijdens de opname, zorg ervoor dat de onderzoeker niet aanwezig is in de testruimte.
- Reinig de observatie kooi voordat u de volgende dier.
- Zorg ervoor dat het opgenomen gedrag wordt geanalyseerd door een experimentator die blind is aan de experimentele conditie van de rat.
- Maak een record van elk gezicht verzorging episode tijdens de 10 min opname. Opmerking: Gezicht verzorging wordt gedefinieerd als bewegingspatronen waarin voorpoten in contact met het gezicht gebieden worden gebracht.
- Maken een onderscheid tussen twee soorten gezicht verzorging gedrag. Als een sequentie niet voorafgegaan of gevolgd doorbodygroom (dat wil zeggen, het verzorgen van een lichaam gebied anders dan het gezicht), categoriseren de episode als geïsoleerde gezicht verzorging. Als het lichaam verzorgen direct voor of na het gezicht verzorging wordt uitgevoerd, categoriseren de episode als gezicht verzorging tijdens het lichaam verzorgen.
- Bepaal het aantal gezicht verzorging afleveringen.
- Categoriseren een periode tussen gezicht verzorgen van acties die niet meer dan 4 seconden als een intra-episode ruimte (dat wil zeggen, een pauze tussen gezicht verzorgen van acties binnen een enkele episode).
- Categoriseren een periode tussen gezicht verzorgen van acties die 4 sec overschrijdt als een inter-episode ruimte (dat wil zeggen, een volledige onderbreking van het gezicht verzorgen acties tussen twee afleveringen).
- Mechanische stimulatie testen
- Transport ratten in groepen tot 6 dieren de kolonie naar de meetkamer in een overdekte kooi met beddengoed. Ervoor te zorgen dat dit een korte reis met een minimum aan externe prikkels.
- Plaats deratten afzonderlijk in doorzichtige kunststof kooien met beddengoed (lxbxh: 24 cm x 14 cm x 17 cm) met een scharnierend deksel, zodat het gemakkelijk kan worden geopend en gesloten.
- Gebruik een gegradeerde reeks van vijf von Frey haren. Opmerking: De kracht die nodig is om de haren buigen is 0,015 g, 0,127 g, 0,217 g, 0,745 g en 2,150 g.
- Wennen de ratten de waarneming kooi en het bereiken van bewegingen voor 10 min. Elke 30 seconden, opent u het deksel en zachtjes aanraken van de wand van de kooi met een plastic staaf.
- Wanneer het dier is in een snuiven / nee motoriek staat (dat wil zeggen, met vier poten op de grond geplaatst, noch in beweging, noch bevriezen, maar vertonen snuiven gedrag), gelden de eerste von Frey haar op het grondgebied IoN nabij het centrum van de vibrissal pad , op de behaarde huid rondom de mystacial vibrissae.
- Ril de respons van het dier op de stimulatie te behoren tot één van de volgende categorieën respons 4.
- Categoriseren een compleet gebrek aan respons als0 score.
- Categoriseren een stimulus detectie (dat wil zeggen, de rat draait het hoofd naar de stimulerende object en de stimulans object wordt dan onderzocht) als score 1.
- Categoriseren een terugtrekking reactie (bijv., De rat draait de kop langzaam weg en trekt het flink achteruit wanneer de stimulatie wordt toegepast, soms een enkel gezicht te vegen ipsilateraal aan het gestimuleerde gebied optreedt) als score 2.
- Categoriseren een ontsnapping / aanval respons (bijv., De rat vermijdt verder contact met de stimulus object, ofwel passief door het bewegen van zijn lichaam uit de buurt van de stimulerende object naar een hurkende positie tegen de kooi muur te nemen, of actief door een aanval op de stimulus object, waardoor bijten en grijpen bewegingen) als score 3.
- Categoriseren asymmetrische gezicht verzorging (dat wil zeggen, de rat geeft een ononderbroken reeks van ten minste drie face-wash slagen gericht op de gestimuleerde gezicht gebied) als score 4.
- Binnen elk dier, toepassing stili in een oplopende volgorde van intensiteit. Na een stimulus intensiteit is toegepast aan de ene kant, breng het aan de andere kant voordat u naar de volgende stimulus intensiteit. Willekeurig de volgorde waarin de ipsilaterale en contralaterale zijden worden gestimuleerd. Merk op dat het dier in een snuiven / geen beweging staat moet zijn voor elke stimulatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Ionen-CCI ratten tonen een sterke postoperatieve toename van de hoeveelheid tijd besteed aan geïsoleerde gezicht verzorging (figuur 1). De toename pieken bij het einde van de eerste postoperatieve week en dan afneemt gedurende de volgende weken. Meest recente studies hebben het gezicht verzorgen aanzienlijk worden verhoogd tot drie weken gevonden. Gezicht verzorgen gedrag in sham geopereerde ratten is min of meer ongewijzigd.
ION CCI-ratten ook vrijwel volledig ontbreken van...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest interessante aspect van het ion-CCI-model is dat het een uniek maatregel van spontane, niet opgeroepen (neuropatische) pijn. De meeste dierproeven van neuropathische pijn, met behulp van spinale zenuwen modellen, uitsluitend richten nocifensive gedrag (bijv., Stemgebruik en intrekking reacties), als gevolg van overgevoeligheid voor mechanische of thermische prikkels 12. Echter, de belangrijkste klinische klacht bij patiënten is voortdurende pijn, niet hyperalgesia of allodynia 13....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen het werk dat werd gedaan door de eerste auteur van het IoN-CCI model, Bart Vos†.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chromic catgut | Dynek | CG504 | |
| Nembutal (pentobarbital) | Pharmacy | ||
| Atropine | Pharmacy | ||
| Clippers voor kleine dieren - Favorita II | Aesculap | GT104 | |
| Stereotaxisch instrument | Stoelting | 51600 | |
| Oftalmische zalf (Liposic) | Pharmacy | ||
| Homeothermische bewakingssysteem | Harvard Apparatus | PY8 50-7221-F | |
| Wattenstaafje | Pharmacy | ||
| Precisie katoenen staafje | Qosina | 10225 | |
| Operatiemicroscoop | Kaps | SOM 62 | |
| Dumont #5 pincet | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont pincet - Micro-bote uiteinden (#5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Schaar - bote uiteinden | Fine Science Tools | 14574-09 | |
| Polyester hechtdraad - Mersilene (4-0) | Ethicon | R871H | |
| Digitale videocamera | Sony | HDR-CX330E | |
| Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit | Stoelting | 58011 |
Referenties
- Jensen, T. S., Gottrup, H., Sindrup, S. H., Bach, F. W. The clinical picture of neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 429 (1-3), 1-11 (2001).
- Meyer Rosberg, K., et al. Neuropathic pain a multidimensional burden for patients. Eur J Pain. 5 (4), 379-389 (2001).
- Meyer Rosberg, K., et al. Comparison of the SF 36 and Nottingham Health Profile in patients with chronic neuropathic pain. Eur J Pain. 5 (4), 391-403 (2001).
- Vos, B. P., Strassman, A. M., Maciewicz, R. J. Behavioral evidence of trigeminal neuropathic pain following chronic constriction injury to the rats infraorbital nerve. J Neurosci. 14, 2708-2723 (1994).
- Clavelou, P., Pajot, J., Dallel, R., Raboisson, P. Application of the formalin test to the study of orofacial pain. Neurosci Lett. 103, 349-353 (1989).
- Vos, B. P., Hans, G., Adriaensen, H. Behavioral assessment of facial pain in rats face grooming patterns after painful and non-painful sensory disturbances in the territory of the rats infraorbital nerve. Pain. 76 (1-2), 173-178 (1998).
- Deseure, K. R., Adriaensen, H. F. Comparison between two types of behavioral variables of non evoked facial pain after chronic constriction injury to the rat infraorbital nerve. Comp Med. 52 (1), 44-49 (2002).
- Deseure, K., Adriaensen, H. Nonevoked facial pain in rats following infraorbital nerve injury a parametric analysis. Physiol Behav. 81 (4), 595-604 (2004).
- Deseure, K., Hans, G. Behavioral study of non evoked orofacial pain following different types of infraorbital nerve injury in rats. Physiol Behav. 138, 292-296 (2015).
- Deseure, K., Koek, W., Adriaensen, H., Colpaert, F. C. Continuous administration of the 5 hydroxytryptamine1A agonist (3-Chloro-4-fluoro-phenyl)-[4-fluoro-4-[[(5-methyl-pyridin-2-ylmethyl) -amino]-methyl]piperidin-1-yl]-methadone (F 13640) attenuates allodynia like behavior in a rat model of trigeminal neuropathic pain. J Pharmacol Exp Ther. 306 (2), 505-514 (2003).
- Zimmerman, M. Ethical Guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
- Mogil, J. S., Crager, S. E. What should we be measuring in behavioral studies of chronic pain in animals. Pain. 112 (1-2), 12-15 (2004).
- Backonja, M. M., Stacey, B. Neuropathic pain symptoms relative to overall pain rating. J Pain. 5 (9), 491-497 (2004).
- Imamura, Y., Kawamoto, H., Nakanishi, O. Characterization of heat hyperalgesia in an experimental trigeminal neuropathy in rats. Exp Brain Res. 116, 97-103 (1997).
- Chichorro, J. G., Zampronio, A. R., Souza, G. E., Rae, G. A. Orofacial cold hyperalgesia due to infraorbital nerve constriction injury in rats reversal by endothelin receptor antagonists but not non steroidal anti inflammatory drugs. Pain. 123 (1-2), 64-74 (2006).
- Kramer, P. R., Bellinger, L. L. Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents. J Vis Exp. (83), e50745(2014).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to Measure Changes in Nociceptive Behavior. J Vis Exp. (76), 50336(2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
