Ontrafelen Entropic Rate Versnelling geïnduceerd door Solvent Dynamiek in Membrane Enzymen

Samenvatting

Kanalen voor het transport van watermoleculen in enzymen beïnvloeden actieve plaats solvatatie en katalyse. Hierin presenteren we een protocol voor de engineering van deze extra katalytische motieven op basis van in silico computermodellen en experimenten. Dit zal ons begrip van de invloed van oplosmiddel dynamiek op enzymkatalyse verbeteren.

Samenvatting

Enzymekatalyse ontstond in een waterige omgeving. De invloed van oplosmiddeldynamica op katalyse wordt echter momenteel slecht begrepen en wordt meestal genegeerd. De studie van waterdynamica in enzymen en de bijbehorende thermodynamische gevolgen is zeer complex en heeft computersimulaties, nucleaire magnetische resonantie (NMR) experimenten en calorimetrie omvat. Watertunnels die het actieve centrum met het omringende oplosmiddel verbinden, zijn cruciaal voor oplosmiddelverplaatsing en dynamica. Het protocol hierin maakt het mogelijk om deze motieven voor watertransport te ontwerpen, wat invloed heeft op specificiteit, activiteit en thermodynamica. Door een biofysisch kader te bieden gebaseerd op theorie en experimenten, kan de hier gepresenteerde methode worden gebruikt door onderzoekers zonder eerdere expertise in computermodellering of biofysische chemie. De methode zal ons begrip van enzymkatalyse op moleculair niveau verbeteren door de enthalpische en entropische veranderingen te meten die geassocieerd zijn met katalyse door enzymvarianten met belemmerde watertunnels. Het protocol kan worden gebruikt voor de studie van membraangebonden enzymen en andere complexe systemen. Dit zal ons begrip van de belangrijkheid van oplosmiddelreorganisatie in katalyse verbeteren en nieuwe katalytische strategieën bieden in eiwitdesign en -engineering.

Inleiding

Water vormt een hoeksteen voor de chemie van het leven ^1. Water patronen en solvatatie enzym actieve sites van invloed op zowel de enthalpie en entropie van ligandbinding ^1,2 en katalyse ³ in een zeer complexe manier die verder reikt dan het hydrofoob effect ^2,3. NMR ^4, hebben calorimetrie ² en moleculaire modellering van gesolvateerd eiwitten gebruikt om licht te werpen op de rol van expliciete watermoleculen in het verstrekken van een drijvende kracht voor het ligand vereniging ^5-8, specificiteit en activiteit ^2,9,10. Hierin stellen wij een unieke methode voor de experimentele evaluatie van de thermodynamische effecten oplosmiddel verplaatsing van enzym katalyse (figuur 1). Onze gecombineerde strategie is gebaseerd op het gebruik van computersimulaties in overleg met enzyme engineering en thermodynamische analyse (Figuur 1). Dit maakt het mogelijk voor het vergieten van extra licht op de invloed van oplosmiddel dynamiek op catalysis, die momenteel slecht begrepen.

Stabiliserende enthalpische interacties, die door water-gemedieerde waterstofbruggen in gesolvateerde enzym actieve plaatsen, kunnen worden gecompenseerd door entropische sancties ^1. Deze entropische kosten worden geassocieerd met de afname van het aantal vrijheidsgraden weergegeven watermoleculen opgesloten binnen holtes eiwit, in vergelijking met water in bulk ^5. De release van de bestelde watermoleculen kunnen leveren daarmee een entropische drijvende kracht voor ligand vereniging ¹ en katalyse ^3. Een belangrijk aspect oplosmiddel dynamiek is de verplaatsing van watermoleculen tussen het inwendige van proteïnen en buitenzijde oplosmiddel ^4. De bijbehorende veranderingen in activeringsenergie, enthalpie en entropie ¹¹ worden niet volledig begrepen op moleculair niveau. Door belemmeren afzonderlijke tunnels voor het transport van water in enzymen, het belang van oplosmiddel dynamiek en zijn bijdrage aan de activatieenergie kan worden geëvalueerd (figuur 1). Bovendien, door het uitvoeren van één-pot kinetische experimenten bij verschillende temperaturen, de relatieve thermodynamische activering parameters van meerdere substraten kunnen worden gewonnen uit een beperkt aantal experimenten (figuur 1, rechts). Onze interdisciplinaire methode is gevalideerd voor complexe membraangebonden triterpeen cyclase enzymen die polycyclische terpenen van groot belang voor het leven ¹² genereren. Het protocol voorziet in de terugwinning van grote hoeveelheden membraaneiwit (10-20 mg / l) met een standaard centrifuge.

Hoewel enzymen geëvolueerd in water, wordt de rol van het oplosmiddel te bevorderen katalyse meestal verwaarloosd. Naast eiwit dynamiek ^13,14 die vorm pre-georganiseerde actieve sites met elektrostatische complementariteit om de overgang staat ^{op 15,} kon water dynamiek zijn van groot belang voor een efficiënte enzymkatalyse. Door het smeden van verschillende interdisciplinaire technieken, onzeDoel is de zeer complexe onderzoek waterdynamica en thermodynamica vergemakkelijken. Deze instrumenten toegankelijker te maken voor de wetenschappelijke gemeenschap te maken zal leiden tot de ontwikkeling van nieuwe strategieën in enzym engineering en eiwit ontwerp voor veranderde activiteiten en specifieke kenmerken.

Protocol

1. In Silico Computer Modeling

1. Download een VOB structuur van het eiwit van interesse uit het eiwit databank (PDB). Bereid de structuur door het verwijderen van overtollige subeenheden en dan toe te voegen ontbrekende waterstofatomen en expliciete oplosmiddel met behulp van de "Cel neutralisatie en p K _{een voorspelling"} experiment in Yasara ^16. Voor membraangebonden triterpene cyclases, geschikte afmetingen van de doos water zijn 91x67x77 Å. Pas de protonatie toestand van de katalytisch actieve aminozuren handmatig.
   Opmerking: Indien nodig, kan een substraat analoog in het VOB-bestand naar een echte substraat worden aangepast met behulp van de "Edit | Swap | Atom" commando.
2. Minimaliseren van de structuur van de "energieminimalisatie" commando met de AMBER krachtveld suite ^17. Gebruik het deeltje mesh Ewald benadering (PME) ¹⁸ om rekening te houden voor de lange afstand elektrostatische interacties. Stel de cut-off voor van der Waals interacties volgensstandaard instellingen.
   Opmerking: De "energieminimalisatie" commando verwijdert conformatie van stress door een korte steilste afdaling minimalisering, vervolgens een gesimuleerde annealing (tijdstap 2 FSEC, atoom snelheden afgebouwd met 0,9 elke 10 ^ste stap) wordt uitgevoerd totdat convergentie is bereikt (dat wil zeggen, de verbetering van de energie minder dan 0,012 kcal / mol per atoom in 200 stappen).

2. Model van de actieve site Solvatatie en Waterstaat Access

1. Na de gesimuleerde gloeien, lopen een 20 nanoseconden moleculaire dynamica (MD) traject en het genereren van ten minste 10 snapshots door de "Bestand | Simulatie Snapshot | Opslaan als" commando, gevolgd door "Simulatie On". Voer de simulaties op een standaard computer met periodieke randvoorwaarden onder de canonieke ensemble. Houd de temperatuur bij 298 K met behulp van een Berendsen thermostaat.
2. Bereid de verkregen van 2,1 snapshots door het verwijderen van alle watermoleculen en de uiteindelijke liganden / substraten met behulp van de4; Bewerken | Verwijderen | Residu "commando superposé elk snapshot individueel op de originele VOB-structuur door de." Superponeren | commando Object "om ervoor te zorgen dat alle structuren dezelfde ruimtelijke positie Sla elk snapshot voorbereid op deze manier als een nieuwe VOB. -bestand (met behulp van de "Bestand | Opslaan als | PDB" commando).
   Opmerking: Voor ervaren modelbouwers: Schrijf een script om dit proces te automatiseren volgens de template opgenomen in aanvullende code File 1.
3. Gebruik de voorbereide snapshots (VOB) van 2.2 die zijn uitgelijnd in 3D-ruimte als input voor de software CAVER 3.0 ^19. Voor de analyse van een beperkt aantal snapshots, lopen CAVER op een standaard computer. Gebruik een straal probe van 0,7 Å ¹⁹ de detectie van tunnels die specifiek zijn voor het transport van watermoleculen verzekeren.
4. Visualiseer de tunnels door CAVER 3,0 gegenereerd in een moleculaire grafische software. Voor eenvoudige visualisatie van tunnels, gebruik het in aanvullende code Fil macroe 2.

3. In Silico Enzyme Engineering Water Patterns and Water Dynamics wijzigen

1. Identificeer de hoogst gerangschikte tunnels volgens de header "ID" in de output file "summary.txt" gegenereerd uit de CAVER 3.0 software vermeld.
2. Identificeren van aminozuren langs de hoogst tunnels (3.1) en dat scherm een ​​kleine zijketen richting van het kanaal interieur door visuele inspectie (met behulp van het model verkregen van 2,4). Identificeren enkel aminozuur substituties die de tunnel door de toegenomen sterische hindering met behulp van de "Swap Residu" commando zal blokkeren. Controleer of de tunnel wordt belemmerd door visuele inspectie, en vervolgens door het herhalen van de stappen 1,2-3,1 van het protocol.

4. Weergave van de gemuteerde genen

1. Introduceren van mutaties in het wild-type gen door PCR mutagenese met behulp van niet-overlappende primers ^20.
2. Voeg plasmide DNA dat het gen van belang tubes met competente cellen van een geschikte klonerings- spanning en incubeer op ijs gedurende 30 min. Voer een transformatie heat shock gedurende 45 seconden in een waterbad met het ingesteld op 42 ° C geroerd. Voeg 500 ul van een verse rijk medium (2YT, 16 g / l trypton, 10 g / l gistextract, 5 g / l NaCl) en incubeer bij 37 ° C, 200 rpm gedurende 45 min. Wordt keuze door uitplaten van de getransformeerde cellen op agarplaten aangevuld met geschikte antibiotica.
3. Na verificatie van de DNA-sequentie van het gemuteerde gen, transformeren van het plasmide DNA in een expressievector stam middels hitte shock zoals hierboven beschreven. Voor de expressie van membraangebonden triterpeen cyclases Gebruik BL21 (DE3).
4. Start een 5 ml O / N kweek bij 37 ° C van de expressie stam in 2YT-medium aangevuld met de juiste antibiotica.
5. Inoculeren van een 2 L war schudfles die 300 ml 2YT-medium aangevuld met de juiste antibiotica tot een uiteindelijke OD van 0,05-0,09 (gemeten bij 600 nm). Na inductie bij een OD van 0,6-0.8 en eiwitexpressie invriezen celpellet en bewaar bij -80 ° C.
   1. Voor membraangebonden triterpeen cyclases in een pD861 vector induceren met 0,5 tot 2 mM rhamnose en 4 h expressie bij 37 ° C tot hoge opbrengsten aan eiwit ²¹ te bereiken.

5. Membraan extractie met behulp van een normale Centrifuge en Protein Purification

1. Bereid de volgende buffers: resuspenderende buffer (100 mM kaliumfosfaat, pH 7,5 aangevuld met proteaseremmer tabletten), Detergent buffer (1% (v / v) Triton X-100, 50 mM kaliumfosfaat, pH 7,5) en reactiebuffer (0,2 % Triton X-100, 50 mM kaliumfosfaat, pH 7,5).
   1. Voor squaleen-hopene cyclases of andere membraangebonden enzymen met een lager pH-optimum, vervangen kaliumfosfaat in de resuspensie buffer citraat. Voor dergelijke enzymen de volgende buffers: Detergent buffer (1% Triton X-100, 60 mM citraat, pH 6,0) en de reactie buffer (0,2% Triton-X 100, 60 mM citraat, pH 6,0).
      Opmerking: als een His-tag wordt gebruikt voor de zuivering, een aanvulling op de resuspensie buffer met 20 mM imidazool (uiteindelijke concentratie).
2. Weeg een ingevroren celpellet in een bekerglas. Resuspendeer de cellen in resuspensie buffer met behulp van een homogenisator tot een eindconcentratie van 0,3 g cellen / ml. Lyse de geresuspendeerde cellen door ultrasone trillingen met een amplitude van 80% en een puls van 1 seconde aan en 1 seconde uit. Gebruik drie herhalende cycli van 50 seconden elk.
3. Wasmiddel buffer tot een eindconcentratie van 0,2% (v / v) detergent. Equilibreren eind-over-eind mengen bij 4 ° C gedurende 1 uur. Terugwinnen membraaneiwit fractie door het opslaan van de supernatant na een enkele centrifugatiestap bij 39.000 xg gedurende 50 min bij 4 ° C.
   Opmerking: Als His-tag zuivering wordt gebruikt, voeg ongeveer 1,5 ml Ni-NTA agarose / g cellen en incubeer gedurende 1 uur.
4. Voer een eerste zuiveringstap ofwel ionenwisseling of His-tag zuivering ^21. Vul het evenwicht en elutiebuffers met 0,2% Triton X-100. Concentreer de gezuiverde eiwit vijf keer met behulp van centrifugaal Filter Units met een cut-off van 10 kDa.
   Opmerking: De grootte van het Triton X-100 micellen leidt tot een concentratie van detergens tot een eindconcentratie van ongeveer 1%.
5. Voltooi zuivering door gelfiltratie polijststap met de geconcentreerde proteïneoplossing en een matrix compatibel met fractionering bereik voor globulaire proteïnen van 2 x 10 x ⁴ -8 10 ^6. Gebruik de reactiebuffer als loopbuffer. Meet de hoeveelheid gezuiverde eiwit met de Bradford Ultra kit volgens het protocol van de fabrikant.

6. Kinetics

1. Maak een frisse 5 mM voorraad oplossing van substraat in reactie buffer. Het verkrijgen van een homogene emulsie van ultrasone trillingen op 30% amplitude voor 2-5 min.
2. Evenwicht een thermomixerbij de gewenste reactietemperatuur. Controleer de temperatuur in een glazen flacon met water door een externe thermometer.
3. Voor single-substraat kinetiek, verdunnen de geëmulgeerde substraat in ten minste vijf glazen flesjes naar dezelfde uiteindelijke substraat concentratie.
   1. Voor één-pot relatieve kinetiek met meerdere substraten, ten minste vijf identieke glazen flesjes door het mengen van alle substraten in elke flacon. Voor hydrofobe triterpenen Gebruik eindsubstraat concentraties in het traject van 10-200 pM.
4. Preincubate de glazen flesjes in de thermomixer gedurende 10 min. Begin de reactie door toevoegen van het enzym. Een totaal reactievolume van 1 ml is geschikt. Gebruik een schudsnelheid van ten minste 1200 rpm.
5. Stop de reacties op verschillende tijdstippen door toevoegen van 500 pi ethylacetaat verrijkt met 100 uM decanol als integratiestandaard.

7. Extraction en thermodynamische Analyse

1. Pak de reactiemengsels doorvortexen handmatig schudden van de glazen flacons krachtig gedurende 1 minuut. Centrifugeer de glazen vaatjes bij 9600 xg in een tafelblad centrifuge gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Breng de bovenste laag (organische fase) naar een lege buis. Voeg een extra 500 ul extractieoplosmiddel om de reactie buizen en herhaal de extractie procedure.
2. Droog de ​​uitgepakte reactiemengsels met Na ₂ SO _4. Vortex gedurende 5 seconden en laat de buizen rusten gedurende 10 minuten. Voer een laatste centrifugatiestap bij 9600 g gedurende 1 min bij kamertemperatuur met een tafelblad centrifuge. Breng de geëxtraheerde monsters gaschromatografie (GC) flesjes.
3. Herhaal de stappen onder 6,1-7,2 voor elke enzymvariant plaats met behulp van tenminste vier oorspronkelijke concentratie van het substraat (voor enkel substraat kinetiek) en vier verschillende temperaturen (zowel enkel substraat en competitieve kinetiek).
4. Voer GC-analyse zoals eerder beschreven ^3. Gebruik een apolaire kolom voor de analyse van hydrofoobic pentacyclische producten. Stel de aanvankelijke oventemperatuur tot 120 ° C en gebruik van een temperatuurgradiënt van 5 ° C / min, afhankelijk van de producten en de kolom.
5. Integreer het piekoppervlak van het product (en) en product piekoppervlakken zetten in het overeenkomstige product concentratie door gebruikmaking van de oppervlakte van de integratiestandaard (overeenkomend met 100 uM). Plot de concentratie van elk product ([P]) versus de reactietijd (t). Voer lineaire regressie van de gegevenspunten die minder dan 10% omzetting. De initiële reactiesnelheid ₍₀ V) wordt gegeven door de helling van de aangebrachte lijn op:
   
   Opmerking: Voor één-pot relatieve kinetiek met meerdere substraten, V ₀ de aanvangssnelheid van een bepaald substraat onder invloed van andere substraten.
6. Voor enkel substraat kinetiek, perceel V ₀ / [E] tegen de corresponderende concentraties substraat. De schijnbare _kcat / _KM waarde wordt gegeven door de helling van het lineaire gedeelte van de grafiek op:
   
   [S] de concentratie van substraat en [E] de concentratie van het gebruikte enzym in de omzetting. _Kcat / _KM gelijk aan de katalytische constant over de Michaelis-constante. Herhaal de analyse voor elke temperatuur en elke enzymvariant.
7. Voor enkel substraat kinetiek, het uitvoeren van een thermodynamische analyse volgens transitietoestandstheorie ²²
   
   k _{b de} boltzmannconstante, h de constante van Planck, T de temperatuur in Kelvin, en R de gasconstante. Voer een lineaire regressie-analyse van de plot van ln ((k _{cat / K M) / ((k b * T) / h))) versus 1 / T. De activering enthalpie (Δ H ^‡) wordt gegeven door (-slope) * R en de activatie entropie (Δ S ^‡) wordt gegeven door (intercept) * R.
   Opmerking: Evenzo kan een analyse onder verzadigende substraatconcentratie worden uitgevoerd met k cat als snelheidsconstante in vergelijking 3.}
8. Voor één-pot relatieve kinetiek met meerdere substraten op door het relatieve schijnbare
   _kcat / _Km waarden van ^23:
   (K _cat / K _{M) A} / _(kcat / _{KM) B} = _{0 V, A} / V _{0, B} * [B] / [A] (4)
   waarvoor V _{0, A} verwijst naar de oorspronkelijke tarief voor substraat Een in competitie met substraat B.
9. Voor één-pot relatieve kibe- trekking tot meerdere substraten op door het relatieve thermodynamische parameters van activering van B ten opzichte van A als referentie, door niet-lineaire regressie:
   
10. Bereken de absolute activering parameters voor substraat B vanaf de activering enthalpie en entropie van referentie verbinding A:
    

Resultaten

Het belang van water dynamiek in enzymatische polycyclization katalyse wordt geïmpliceerd door in silico analyse en de daaropvolgende visualisatie van aangetroffen tunnels (met behulp van het script in de Aanvullende Code bestand 2). Volgende paragraaf 3 van het protocol, wordt S168 gevonden om een "hot spot" aminozuurrest langs één van de tunnels in de triterpene cyclase enzym uit Alicyclobacillus acidocaldarius (Figuur 1, midden links) zijn. De introductie van de mutatie S168F in silico, wordt de tunnel belemmerd zoals gezien door visuele inspectie (figuur 1, links onder).

De reactiesnelheid voor de vorming van polycyclische artikelen die door de triterpeen cyclase enzym zeer gevoelig voor temperatuur (Figuur 2A). Na het protocol (sectie 4-7), blijkt dat de schijnbare _kcat / _{M weergegeven met wild-type enzym voor de vorming van pentacyclische producten fiftyfold verhoogt wanneer de temperatuur wordt verhoogd met 25 ° C (figuur 2A). Het blokkeren afzonderlijke tunnels door invoering van een enkele puntmutatie heeft een significant effect op de experimenteel bepaalde absolute schijnbare kcat / Km waarden, en hun temperatuursafhankelijkheid (Figuur 2A).}

Van de experimenteel bepaalde kinetische parameters worden lineaire thermodynamische percelen gegenereerd door vergelijking 3 en volgende paragraaf 6-7 van het protocol voor enkel substraat kinetiek (Figuur 2B). De zeer grote veranderingen in activering entropie en enthalpie waargenomen voor varianten herbergen geblokkeerde tunnels impliceert een belangrijke rol voor de dynamiek van het water in het bevorderen van de polycyclization cascade (figuur 2C, berekeningen op basis van Figuur 2B). Bovendien, Varianten met veranderde water tunnels weer een veranderde Gibbs vrije energie van de activering (Δ G ^‡ = Δ H ^‡ - T * S Δ ^‡, Figuur 2B-C). Bijvoorbeeld, bij 303 K de S168F tunnel variant toont een Gibbs vrije energie van de activering van 14 kcal / mol in vergelijking met 16 kcal / mol voor het wild-type enzym.

Volgens het protocol in hoofdstuk 7, vergelijking 4 zorgt voor de berekening van de schijnbare k _cat / K _M waarden voor extra substraten van de ene pot kinetische experimenten (figuur 3A). Bovendien kan een lineaire thermodynamische grafiek (Figuur 3B) worden geconstrueerd door uitvoering van de essay wedstrijd bij verschillende temperaturen (vergelijking 5). Analoog aan enkel substraat kinetiek, de relatieve activatie enthalpie en entropie voor aanvullende substraten vergeleken met een referentieverbinding zijn readily bereikbaar vanaf de intercept en de helling van de lineaire past bij de experimentele gegevens. Absolute waarden van thermodynamische parameters van activatie kunnen worden beoordeeld vanuit rekenkundige toevoeging door thermodynamische behorend bij de referentieverbinding (vergelijking 6). Met behulp van het protocol hierin gegenereerde resultaten tonen duidelijk aan dat membraan enzym varianten met geblokkeerde water tunnels weer fundamenteel verschillende thermodynamische parameters van de activering voor substraten van verschillende afmetingen (figuur 3C).

Figuur 1. Protocol samenvatting:. In silico computermodellen in overleg met experimentele eiwit ontwerp en thermodynamische analyse zorgt voor een beter begrip van de invloed van oplosmiddel dynamiek op enzymkatalyse Klikhier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. thermodynamische parameters van activatie van wildtype en tunnel varianten uit één substraat kinetiek. (A) Het zichtbare _kcat / _Km waarden verkregen uit experimentele gegevens en door vergelijkingen 1 en 2 (B) Thermodynamische analyse met transitietoestandstheorie en de lineaire regressie van de experimentele gegevens aan de vergelijking 3. (C) thermodynamische parameters van activatie berekend uit plaatsen in (B). De voorgevouwen squaleen substraat wordt getoond met obligaties gevormd / gebroken als stippellijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. thermodynamische parameters van activatie van wild-type en tunnel varianten voor verschillende substraten. (A) Relatieve _kcat / _KM-waarden uit één pot kinetiek verkregen met behulp van vergelijking 4. (B) Thermodynamische plots van de kinetische gegevens op verschillende temperaturen met vergelijking 5 (C) Absolute thermodynamische parameters van activatie berekend door vergelijking 6 en via het substraat squaleen in figuur 2 als referentie. Obligaties gevormd / gebroken in de substraten worden weergegeven als stippellijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De meest kritische stappen bij het bereiken van hoge kwaliteit experimentele thermodynamische gegevens voor wildtype enzym membraan en tunnel varianten zijn: 1) generatie van het computermodel; 2) homogeen gezuiverde eiwitten; 3) geëmulgeerd substraat bestanden; 4) controle van de temperatuur tijdens kinetiek; 5) extractie van reactiemengsels met behulp van interne standaard.

Het genereren van het computermodel wordt sterk vergemakkelijkt door het gebruik van software met een user interface die verschillende platforms ondersteunt. Daarom wordt dit protocol gebaseerd op het Yasara modelleren suite ¹⁶ om onze strategie te bereiken zelfs voor het modelleren van niet-experts te maken. Een computermodel voor watertunnel identificatie moet idealiter basis van een kristalstructuur van het enzym van belang ^24. Daartoe de rijkdom van kristalstructuren in de Protein Data Bank is zeer gunstig. In onze ervaring, een belangrijk aspect in de succesvolle voorbereiding van TEMplaten voor tunnel identificatie te kristallografische wateren houden. Het is even belangrijk een gesolvateerde enzym box gebruikt bij het uitvoeren van moleculaire dynamica simulaties, die kan worden uitgevoerd op een gewone computer. De triterpene cyclase uit Alicyclobacillus acidocaldarius is stabiel in het water tijdens de MD-simulaties ^3. Maar door kristallografische detergentia en / of gebruiken celmembraan nabootst zou wellicht vereist voor potentieel onstabiele enzymen zorgen voor langere MD-simulaties. Het wordt voorzien dat het geminimaliseerde kristalstructuur van zeer uitdagende doelen belangrijk mechanistisch inzicht zou kunnen bieden met behulp van het protocol, hoewel dit niet dynamische aspecten van de tunnel organisatie zou veroveren.

CAVER ¹⁹ in de basis staat, met een enkele of een beperkt aantal snapshots als input kunnen worden gebruikt door niet-deskundigen op een standaard laptop. Gebaseerd op onze ervaring ^3, tunnels met een straal bottleneck (dat wil zeggen, de straalop het smalste punt) kleiner dan 1 A kan worden zeer relevant voor het water, vooral als kristallografische watermoleculen bevinden binnen de voorspelde tunnel (Figuur 1, midden links). Anderzijds kan een grotere radius bottleneck een tunnel voor het transport van het substraat in en uit de actieve plaats ¹⁰ impliceren. Het script aanvullende codebestand 2 kan worden gebruikt door niet-deskundigen voor de visualisatie van voorspelde tunnels. Toekomstige experimenten zal uitwijzen of homologie modellen van voldoende hoge resolutie zal zijn om te zorgen voor de atomistische studie van waternetwerken en dynamiek. Belichten hoe het uitvoeren moleculaire dynamica simulaties met en zonder een ligand aanwezig in de actieve plaats, beïnvloedt het proces van tunnel identificatie ook van belang zijn.

Kinetiek van membraaneiwitten kan een enorme uitdaging ²⁵ vormen. Het protocol uitvinding is gebaseerd op een eenvoudig membraanextractie protocolhet membraan enzym zonder het gebruik van dure uitrusting, krijgen bijvoorbeeld een ultracentrifuge. Het gebruik van gelfiltratie als laatste polishing stap verwijdert potentiële residuele membraan deeltjes en maakt een passend reinigingsmiddel omgeving ^25.

Een belangrijk aspect bij het bereiken van reproduceerbare kinetische resultaten van het protocol is om de substraat voorraad oplossing door ultrasone trillingen emulgeren. Eenvoudige wervelen hydrofobe substraten verdund in reactiebuffer geeft homogeen substraat-detergent mengsels. Het pipetteren van niet-geëmulgeerde substraatoplossingen leidt tot reproduceerbare concentraties (bevestigd door kwantitatieve GC), die nauwkeurige bepaling van beginsnelheden voorkomt. Daarentegen dient het pipetteren van goed geëmulgeerd voorraadoplossingen leiden tot lineaire regressieanalyse van beginsnelheden met ^R2 in het bereik van 0,98-0,99. Een ander belangrijk aspect van hydrofobe substraten is de schijnbare oplosbaarheid substraaten de beschikbaarheid in het substraat-detergent mengsels. In feite was het niet mogelijk de triterpeen cyclase met referentiesubstraat squaleen verzadigen. Daarom blijkt _kcat / _Km waarden middelen zijn die bijdragen van bindende en chemie kunnen bevatten. Toch is gebleken dat de chemie is snelheidsbepalend voor _kcat / _KM voor polycyclization cascade uitgevoerd door triterpeen cyclases ^3.

Het is van groot belang voor de actuele temperatuur in een reactie glazen flesje verifiëren met een externe thermometer. Toch kunnen lineaire fits armer varianten essentiële constante schijnbare _kcat / _Km waarden bij verschillende temperaturen. Dit wordt benadrukt de S168F variant hierin (figuur 2A) met een activering enthalpie dicht bij nul (figuur 2B en 2C). Erg small temperatuurafhankelijke veranderingen in schijnbare k _cat / K _M, kan onzekerheid in de waargenomen activatie entropie induceren Δ S ^‡ (dwz het snijpunt van de lineaire plots figuur 2B). In principe zou de waargenomen activatie entropie ook beïnvloed worden door een andere overvloed van actieve enzymen voor verschillende varianten, die niet wordt gedetecteerd door meting van de eiwitconcentratie. Verwacht wordt dat experimentele fouten worden gereduceerd bij het mengen meerdere substraten in één pot. Dit is omdat alle verschillende substraten interageren met dezelfde hoeveelheid enzym onder deze omstandigheden (vergelijking 4). Het gebruik van een extractieoplosmiddel verrijkt met een interne standaard rekening worden gehouden met verschillen in extractie en / of GC-injectie.

Transitietoestandstheorie is met succes gebruikt in Enzymology ^26. Deze belangrijke theoretisch kader was oorspronkelijk dewikkeld voor unimoleculaire reacties in de gasfase. Echter is gebleken dat vooral enzymen werken door verlaging van de klassieke activatie energiebarrière ^26. De transmissie coëfficiënt verondersteld één hierin zijn van invloed kunnen zijn de gemeten activering enthalpie en / of entropie. De bijdrage van tunneling en andere niet-klassieke effecten zoals recrossing van de overgangstoestand, ruwweg bijdragen 1000-voudig tot katalyse ²⁶ overeenkomend met ongeveer 4 kcal / mol energie. Te zien is dat de activatie entropie weergegeven door het wild-type enzym (16 kcal / mol bij 328 K, figuur 2C) is veel groter dan die van niet-klassieke effecten veroorzaakt door een ongelijkmatige overdracht coëfficiënt. De impact van de transmissie-coëfficiënt zou afnemen bij het vergelijken van thermodynamische parameters van de activering van wild-type en de tunnel varianten met behulp van het protocol.

De Gibbs vrije energie van de activering (Δ G ^‡) is composed van zowel een enthalpische (Δ H ^‡) en een entropische (- T * Δ S ^‡) termijn. Oplosmiddel reorganisatie in enzymen tijdens katalyse kunnen beide parameters beïnvloeden. Verwacht wordt dat het huidige protocol voor de studie van deze fenomenen te vergemakkelijken door het samenstellen van een toolbox van relevante en gebruiksvriendelijke in silico computationele gereedschappen met de nodige biofysische experimentele kader. De werkwijze is overwogen bruikbaar voor het bestuderen van een overvloed aan enzymatische processen, waaronder katalyse door membraangebonden enzymen zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
YASARA	YASARA Biosciences	http://www.yasara.org/	Moleculair modellerings- en simulatieprogramma
CAVER	CaverSoft	http://caver.cz/	Tool voor analyse van tunnels in eiwitten, gratis licentie voor academisch gebruik
Bradford Ultra	Expedeon	BFU1L, BFU05L	Eiwitbepaling in oplossingen die tot 1% detergent bevatten
Potter-Elvehjem homogenisator	VWR	432-0205, 432-0217	Homogenisatie van bevroren celpellet
Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	4693159001	Protease remmer
Centrifuge Filter Units	Millipore	UFC901008	Centrifuge filter units voor het concentreren van eiwitten, MWCO 10 kDa
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer voor monster incubatie