Methodenartikel

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

DOI:

10.3791/53176

⸱

11 juli 2016

 ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) en moleculaire technieken (16S rRNA gen sequencing) maken de identificatie van zeldzame bacteriële pathogenen in routine diagnostische mogelijkheden. Het doel van dit protocol ligt in de combinatie van beide technieken, wat leidt tot meer nauwkeurige en betrouwbare gegevens.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn een aantal zeldzame en derhalve onvoldoende beschreven bacteriële pathogenen die naar verluidt ernstige infecties name in immuungecompromitteerde patiënten. Meestal slechts weinig gegevens, meestal gepubliceerd als case reports, beschikbaar die de rol van dergelijke pathogenen als een infectieus agens onderzoeken. Teneinde het pathogene karakter van dergelijke micro-organismen te verduidelijken, moet worden epidemiologische studies waarbij grote aantallen van deze bacteriën omvatten voeren. De in dergelijke surveillance onderzoeksmethoden moeten de volgende criteria voldoen: de identificatie van de stammen moet nauwkeurig volgens de geldende nomenclatuur zijn, moeten ze gemakkelijk te hanteren (robuustheid), zuinig routine diagnostiek en zij vergelijkbaar moeten genereren resultaten tussen verschillende laboratoria. Over het algemeen zijn er drie strategieën voor het identificeren van bacteriële stammen in een routine instelling: 1) het karakteriseren van de fenotypische identificatie Biochemical en metabolische eigenschappen van de bacteriën, 2) moleculaire technieken zoals 16S rRNA gensequentie en 3) massaspectrometrie als nieuw proteoom benadering. Aangezien massaspectrometrie en moleculaire benaderingen zijn de meest veelbelovende hulpmiddelen voor het identificeren van een grote verscheidenheid aan bacteriën, zijn deze twee methoden beschreven. Vorderingen, beperkingen en mogelijke problemen bij het gebruik van deze technieken worden besproken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Secure identificatie van zeldzame pathogenen in routine diagnostiek wordt bemoeilijkt door het feit dat de klassieke culturele en biochemische methoden zijn omslachtig en soms twijfelachtig. Verder is een diagnostische microbiologie laboratorium een ​​groot aantal pathogenen, variërend van enkele honderden tot enkele duizenden, dagelijks, die het gebruik van geautomatiseerde systemen moeten verwerken. Naast de behandeling van een hoge dagelijks volume wordt de nauwkeurige identificatie van bacteriële species nodig. Dit is gerechtvaardigd omdat zij verschillen in hun antimicrobiële gevoeligheid patroon en dus correcte identificatie geeft de clinicus met essentiële informatie om juiste antibiotica te kiezen (bijvoorbeeld Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

Geautomatiseerde microbiële identificatiesystemen (AMIS) gestandaardiseerde sets enzymatische reacties van toepassing op de metabolische eigenschappen van bacteriële isolaten karakteriseren 13,15,16,26,27. Hoewel de in deze systemen patronen maken gebruik van een groot aantal verschillende biochemische reacties, bijvoorbeeld 47 in de GN kaart van het AMIS gebruikt in deze studie 52 Deze strategie toelaat veilige identificatie slechts een beperkt aantal bacteriën. Bovendien is de database een geavanceerd expertsysteem, duidelijk gericht op detectie van relevante en zeer relevante bacteriën van medisch belang 13,15,16,36. Twee andere systemen op grote schaal gebruikt in laboratoria, ook deze biochemische benadering voor bacteriële identificatie passen. Recente studies tonen vergelijkbare identificatie nauwkeurigheid tussen de in deze studie AMIS en één van de deelnemers (93,7% en 93,0% respectievelijk), terwijl de 3 e AMIS een identificatie nauwkeurigheid van slechts 82,4% op species niveau 35. Dergelijke verschillen kunnen worden verklaard door de kwaliteit van de onderliggende identificatiegegevens gevonden, versies van kits en software, verschillen in metabolisme en vaardigheid van technisch personeel 35,36.

Twee automatische MALDI-TOF MS systeem (MALDI-TOF microbiële identificatiesysteem, MMIS) worden hoofdzakelijk gebruikt. Deze systemen zorgen voor detectie van een groot aantal bacteriesoorten basis van hun eiwitten vingerafdruk massaspectra. Bijvoorbeeld, de databank van de MMIS gebruikte bevat 6000 referentiespectra. Identificatiesystemen op basis van massaspectrometrie bieden een snelle en betrouwbare detectie van een grote verscheidenheid aan micro-organismen waaronder zeldzame pathogenen 11,48,51. Tot op heden zijn slechts een paar directe vergelijkingen zijn beschikbaar tussen de in deze studie gebruikte MMIS en zijn concurrent 19,33. Volgens Dæk et al. Beide systemen een soortgelijk hoge nauwkeurigheid van identificatie, maar de in deze studie MMIS lijkt betrouwbaarder soortenidentificatie 19 zijn.

Op dezelfde manier, het aanpakken van moleculaire technieken goed geconserveerd, maar ook verschillende genen ( bijvoorbeeld 16S rDNA of rpoB) laten een duidelijke soortidentificatie 3,22,61. Van deze, het 16S rDNA is de meest gebruikte housekeeping gen vanwege zijn aanwezigheid in alle bacteriën 34. Zijn functie blijft ongewijzigd en tenslotte, met ongeveer 1500 bp, het is lang genoeg is geschikt voor bio-informatica 14,34 te zijn. Veel onderzoekers beschouwen 16S rRNA-gen-analyse als de "gouden standaard" voor bacteriële identificatie 21. Dit komt door het feit dat weinig laboratoria DNA-DNA-hybridisatie technieken datum voor identificatie van zeldzame of nieuwe bacteriën 14,34. Bovendien, steeds meer databases beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor het 16S rRNA gen analyse 50. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat 16S rDNA gebaseerde detectiesystemen hebben een beperkte gevoeligheid dan standaard PCR-protocollen. Bovendien is de moleculaire benadering is verfijnd, tijdrovend en vereist goed opgeleid personeel engespecialiseerde laboratoria en is daarom niet gemakkelijk geïmplementeerd in routine diagnostische 55. Verder is aangetoond dat de combinatie van ten minste twee verschillende methoden voor bacteriële identificatie leidt tot zeer nauwkeurige stamidentificatienummer. De combinatie van MALDI-TOF MS en 16S rDNA sequentie maakt de identificatie van grote aantallen verschillende bacteriële soorten met hoge nauwkeurigheid. Onlangs heeft de combinatie van MALDI-TOF MS en 16S rRNA gen-analyse werd gepresenteerd voor bacteriële identificatie bestuderen epidemiologische vragen en zeldzame ziekteverwekkers 56.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Winning van bacterieel DNA

  1. Bereiding van PBS oplossing
    1. Weeg 1,65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O en 8,80 g NaCl in een kolf en vul met gedestilleerd water tot een eindvolume van 1000 ml. Breng de pH op 7,4. Voor gebruik in definitieve filteren de oplossing door een bacterie-proof (0,22 pm) filter.
  2. DNA-extractie van Gram-negatieve bacteriën
    1. Streak de patiënt materiaal op de juiste cultuur media (bijvoorbeeld Columbia bloed agar), identificeren en te isoleren potentiële ziekteverwekkers.
    2. Bereid pure cultuur en het uitvoeren van Gram-kleuring om morfotype te bepalen en om de zuiverheid te bevestigen en van de cultuur 49.
    3. Kies een enkele bacteriële kolonie en breng het met een 1 pl eenmalig gebruik enting lus in een steriele 2,0 ml reactie buis die 1 ml PBS-oplossing bevat.
    4. Incubeer deze suspensie in een thermomixer bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Na incubatie liet het bacteriële extract (die het opgeloste DNA) afkoelen tot kamertemperatuur en ofwel zodanig gebruikt voor amplificatie en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik (figuur 1a).
  3. DNA Extraction van Gram-positieve bacteriën
    1. Streak de patiënt materiaal op de juiste cultuur media (bijvoorbeeld Columbia bloed agar), identificeren en te isoleren potentiële ziekteverwekkers. Uitvoeren Gram-kleuring om morfotype van cultuurbevestigende.
    2. Bereid reincultuur en uitvoeren van Gram-kleuring om morfotype bepalen en zuiverheid van cultuurbevestigende.
    3. Kies een enkele bacteriële kolonie met een steriele 1 pi enting lus en hang deze in 500 ul PBS oplossing in een 2,0 ml reactie buis.
    4. Voeg 500 ul glazen kralen en breng de buis een oscillerende homogenisator werkt bij maximale frequentie en amplitude (50 Hz), gedurende 5 min. Gebruik glazen kralen met een diameter 1,0 mmde bacteriële celwanden verstoren.
    5. Incubeer de buis 10 minuten bij 95 ° C en koel af tot kamertemperatuur. Met het extract rechtstreeks voor de PCR-reactie of bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik.

2. 16S rDNA PCR

  1. Bereiding van amplificatieprimers
    1. Gebruik de primers TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) als voorwaartse primer en RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') als reverse primer 25. Bereid een primer voorraad oplossing met DNAse en RNAse gratis water, met een concentratie van 100 pmol / ul (100 uM) en vul het verder om een ​​werkende oplossing bij 10 pmol / pl. Bewaar de primer voorraad en werkende oplossing bij -20 ° C of direct te gebruiken.
  2. Bereiding van de PCR-mix
    1. Pipetteer 1 ul van elke primer, 1 ui dNTP-mengsel (100 mM), 2,5 pi van het DNA-extract, 5 gl 10 x PCR-buffer (bevattende 25 mM MgCl 2), 0,25 pl Taq-polymerase (5 eenheden / ul) en 39.25 pi DNase- en RNAse gratis PCR water in een steriele 200 ul reactie buis.
  3. PCR protocol
    1. Start het PCR programma gebouwd als volgt: Ten eerste, een eerste incubatiestap bij 95 ° C gedurende 5 minuten die nodig is om het Taq-polymerase te activeren. Ten tweede, 35 amplificatiecycli, met een 1 min. denaturatiestap bij 95 ° C, 1 min. primer annealing stap bij 50 ° C, en 1,5 minuten primerverlenging bij 72 ° C. Ten derde, een laatste verlenging gedurende 10 min bij 72 ° C. Tenslotte wordt de PCR reactie afgekoeld tot 4 ° C.
      OPMERKING: Staphylococcus aureus en H 2 O fungeren als positieve en negatieve controle (Figuur 1b).
    2. Plaats de buis met het PCR-reactiemengsel in de thermocycler en start het programma.
  4. Zuivering van het PCR product
    Opmerking: Om de PCR te zuiveren, ofwel verscheidene protocollenenzymen gebaseerde of op silica adsorptie- matrix kan worden gebruikt. De single-step PCR cleanup hier gebruikt maakt gebruik van twee hydrolytische enzymatische reacties. Terwijl exonuclease I (Exo I) enkelstrengs DNA verwijdert, garnalen alkalische fosfatase (SAP) hydrolyseert zonder rechtspersoonlijkheid dNTPs. De tweede procedure is gebaseerd op een silica membraan adsorptie techniek met een hoog zoutgehalte snel binden - wassen - laag zoutelutie cyclus.
    1. Voeg 1,5 ul van een mengsel dat zowel enzymatische Exo I en SAP aan 25 ui PCR-product, meng en overbrengen in een thermocycler toepassing van een eenvoudig protocol van eerst 15 minuten bij 37 ° C gevolgd door 15 min bij 80 ° C. Bewaar het gezuiverde PCR-product, hetzij bij -20 ° C of direct gebruiken als doelwit voor PCR labelen.

3. DNA agarosegelelektroforese

  1. Bereiding van de elektroforese buffer (TBE-buffer)
    1. Titreer 54,0 g (445 mM) Tris-base, 27,5 g (445 mmol) boorzuur en 20 ml van een 0,5 M EDTA (10mM) bij pH 8,0 met NaOH in een kolf en vul met gedestilleerd water tot een totaalvolume van 1000 ml. Verdun deze 5x buffer 1:10 met gedestilleerd water (0,5x TBE) voor elektroforese.
  2. Bereiding van de laadbuffer
    1. Meng 250 mg broomfenolblauw, 250 mg xyleencyanol FF en 15 g polysucrose (Materials Table) in een kolf. Vul vervolgens 0,5x TBE buffer tot een totaal volume van 100 ml. Aliquot de lading kleurstof 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik.
  3. Gieten van de Agarose Gel
    1. Weeg 6 g standaard agarose elektroforese 300 ml 0,5x TBE buffer (zie paragraaf 3.1.1) in een kolf, een 2% te bereiden (w / v) agarosegel. Dan zet de agarose mengsel in een magnetron, verwarm het bijna-kookpunt totdat de agarose volledig is opgelost en de oplossing lijkt duidelijk.
    2. Laat de gesmolten agarose afkoelen voldoende en voeg 10 ul van een 1% (w / v) voorraad ethidiumbromide oplostie. Giet de oplossing in een gietvorm en plaats een gel kam (rekening houdend met 30 putjes) in de gietvorm. Verwijder de kam als de gel is volledig gestold en wordt de gel in de elektroforese kamer die 0,5x TBE buffer.
      OPMERKING: Ethidiumbromide is giftig en mutageen. Daarom moet worden behandeld met de nodige voorzichtigheid. Het is raadzaam om nitril handschoenen te gebruiken. Er zijn alternatieve intercalerende nucleïnezuur vlekken die kan worden gebruikt als een niet-toxisch alternatief.
  4. Agarosegelelektroforese van de PCR- producten
    Opmerking: Om de juiste maat van de PCR amplicons verifiëren en de DNA-concentratie van de gezuiverde PCR-product wordt gescheiden in een agarose gel schatten.
    1. Pipetteer 2 pi van de laadbuffer in een PCR-reactie buis en voeg 8 pi van het PCR-product. Pipet dit mengsel in de putjes van de gel. Voeg 8 pi van een molecuulgewicht groottemarker (DNA ladder) in een aparte goed om de grootte van het PCR-product te schatten.
    2. Van toepassing zijneen constante spanning bij 10 V / cm en stop de elektroforese als de broomfenolblauw marker ¾ van de totale lengte van de gel bereikt. Visualiseer de gescheiden PCR-fragmenten met behulp van een UV-transilluminator (golflengte 302 nm) en documenteren ze met behulp van een gel-documentatiesysteem. Schatting van de hoeveelheid DNA door visuele vergelijking met de DNA-ladder. Gebruik ongeveer 10 ng als doelwit voor de etikettering PCR.

4. Sanger Sequencing

  1. Cycle Sequencing PCR
    OPMERKING: Voer de PCR labeling in een 10 ul reactie met behulp van een commerciële kit (Materials tabel).
    1. Voeg 2 pl 5x reactie mastermix, 2 pi van het DNA-preparaat, 1,5 pi TPU1 of RTU4 werkende oplossing (10 pmol / ul) en 4,5 ul DNAse en RNAse gratis water.
    2. Zet deze sequencing reactie mix in een thermocycler en start een ander PCR. In totaal werkwijze 25 cycli bestaande uit een denaturatiestap (96 ° C,10 sec), een annealing stap (45-60 ° C, 5 sec) en een verlengingsstap (60 ° C, 2 min). Koel de reactie bij 4 ° C.
  2. Zuivering van de sequentie reactie
    1. Zuiver het labeling reactiemengsel met behulp van commerciële spin kolommen voor PCR zuivering (Materials tabel).
    2. Load 10 ul van de sequentie reactie op de vooraf gehydrateerde gelfiltratie matrix en voer een centrifugatiestap bij 750 xg gedurende 3 min.
      OPMERKING: Bij de toepassing van deze procedure zonder lokaal kleurstof terminatoren worden vastgehouden in de gelmatrix.
    3. Dan droog het waterige eluaat onder vacuüm concentrator. Centrifugeer bij 2500 xg gedurende 20 tot 30 minuten bij 40 ° C tot volledig droog.
    4. Voeg 10 ul van zeer gedeïoniseerd formamide dan denatureren bij 90 ° C gedurende 2 minuten en koel het mengsel op ijs. Pipetteer 10 ul van de gedenatureerde monsters op een 96 well plaat ul. Bewaar de gedroogde en gereinigd PCR product bij -20 ° C als de analyseop een later tijdstip worden uitgevoerd.
  3. 16S rRNA Gene sequentiebepaling en analyse van de DNA sequentie
    OPMERKING: Voer sequentie-analyse op een geautomatiseerde sequencer (Materials tabel). De sequencer hier gebruikt is een geautomatiseerde op fluorescentie gebaseerde capillaire elektroforese systeem 4 monsters simultaan geanalyseerd (50 cm 4-capillair array) met een vloeibaar polymeer 67 (figuur 1c).
    1. Plaats de microtiterplaat in de sequencer. Schrijf een staalkaart (plaat record) zoals uiteengezet in 2, sla het op en start de sequencing run / analyse na de stappen in 1.
      LET OP: De duur van een reeks run is 2 uur en levert gegevens van 800 tot 1000 bp.
    2. Open de sequencing analyse software (Materials tabel). Sequence gegevens worden gegeven als een tekstbestand (.seq) en een bestand met de elektroferogram zoals kwaliteits-waarden (QV) (.ab1).
      OPMERKING: Base roeping is automatisch pergevormd door de sequentieanalyse software en de onderliggende elektroferogram visueel onderzocht (bijvoorbeeld piekhoogte, piekscheiding) vóór de sequentie wordt gebruikt voor verdere toepassingen.
    3. Vergelijk de opgeslagen DNA-sequentie-bestand naar de NCBI nr database met behulp van BLAST-algoritme (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF-MS

LET OP: De massaspectrometer maakt gebruik van een 337 nm N2 laser en wordt bediend door een specifieke control software (Materials tabel). Spectra worden in lineaire modus en een massabereik 2.000 tot 20.000 Da valt. Interpretatie van de gegevens en de verdeling van de scores van de monsters wordt uitgevoerd in real time uitgevoerd door een analyse software (Materials Table) (figuur 1d).

  1. Bereiding van bacteriën voor MALDI-TOF MS Analysis
    1. Groeien de bacteriën van belang (bijvoorbeeld, Myroides odoratimimus) op ColUmbia bloed agar met 5% paardenbloed bij 37 ° C gedurende 18 tot 24 uur, afhankelijk van de bacteriestam (Figuur 2a). Uitvoeren Gram-kleuring de morfotype van het onderzochte organisme en zuiverheid van de kweek te controleren.
    2. Gebruik een houten tandenstoker voor het overbrengen van een bacteriële kolonie een putje van een 96 putjes staal target (figuur 2b en 2c). Spot 1 ui 70% mierenzuur bovenop de lucht gedroogd organisme voor het doel staal en laten drogen gedurende ongeveer 2-3 min.
    3. Vervolgens bedekken de plek met 1 pi matrixoplossing, bevattende 50 mg / ml CHCA (α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur) in een organisch oplosmiddel (50% acetonitril, 2,5% trifluorazijnzuur, 47,5% H2O).
      Opmerking: Het zuur overlay methode (op plaat bereidingswijze) gebruikt worden om de kwaliteit van de massaspectra verbeteren. Het is aangetoond dat bij Gram-positieve bacteriën dergelijke "zuuraanval" verhoogt de stand values van de gemeten spectra 45.
      OPMERKING: U een geautomatiseerd monstervoorbereiding (Materials Table) worden toegepast waarin contactloze spots van 1 ui 70% mierenzuur en na een eerste droogcyclus, 1 ui matrixoplossing worden aangebracht op het bacteriële vlek. De monsters worden vervolgens gedroogd onder gestandaardiseerde omstandigheden bij 60% relatieve vochtigheid en zijn klaar om te gebruiken voor analyse.
    4. Laat de uitstrijkjes met matrix bedekt lucht drogen weer voor ongeveer 5 min in een kap. Deze bacteriële uitstrijkje met de toegepaste matrix is ​​nu stabiel gedurende vele uren.
      OPMERKING: Bacteriële uitstrijkjes zonder matrix kan niet stabiel zijn als gevolg van afbraak van eiwitten.
  2. Het uitvoeren van de MALDI-TOF MS Analysis
    1. Introductie van de monsters
      1. Open de besturingssoftware van onze MMIS (Materials tabel).
      2. Beluchten het monster laden haven van de massaspectrometer door op de IN / OUT-toets van het instrument.
      3. Open de laadhaven na een klik en steek de MALDI-TOF-MS doel bord met de gedroogde bacteriële uitstrijkje plus matrix.
      4. Sluit de haven en weer te evacueren. Observeren vacuüm en wanneer zij tot 4,5 x 10 -6 mbar beginnen meting.
    2. monsteranalyse
      1. Open de analyse software van onze MMIS (Materials Table) en klik op het menu "Bestand". Selecteer "Nieuwe classificatie" en een nieuw venster "MALDI biotyper real time classificatie-wizard" wordt geopend. Typ de naam van het project, bijvoorbeeld "Myroides meting project_1, in het veld" naam Project "en druk op de knop" Nieuw ". Onder de nieuwe dialoogvenster met de naam" New project "naam check project en ga door op de knop" OK ".
      2. In de "MALDI biotyper real time classificatie tovenaar" observeren het venster "Analyt plaatsing" geopend. Selecteer doel posities (bijvoorbeeld A1, A2, A3 ...), rechts-click elke geselecteerde positie (aangegeven met een blauw vierkant) en selecteer "samples toevoegen". In de automatisch geopend tabel type in de steekproef van naam, monster-ID en eventueel een reactie uitzicht. Klik op de knop "Next" om verder te gaan.
      3. In de "MALDI biotyper real time classificatie tovenaar" observeren het venster "Selectie van MALDI biotyper methods" geopend. Selecteer "Bruker Taxonomie" van "MSP's van taxonomie bomen" en klik op "Next" om verder te gaan.
      4. In de "MALDI biotyper real time classificatie tovenaar" observeren het venster "Project summary" geopend. Controleer de geplaatste inzendingen hierboven gegeven voor de eigenlijke indeling project. Start de indeling gerund door op de knop "Finish" (figuur 2d - f). De meting wordt automatisch gestart wanneer de juiste vacuüm is bereikt.
      5. Volg de kwalificatie run totdat de meting is voltooid. Bekijk hier de resultaten tabel in thij "MALDI Biotyper Realtime Classification Project Myroides meting project_1" opent het menu "View" en klik op "resultaten".
      6. Bekijk de "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classification resultaten" als HTML-bestand in de standaard webbrowser. Afdrukken en de resultaten opslaan.
    3. Meet een testnorm dagelijks voorafgaand aan analyse proeven om het instrument te kalibreren en het uitvoeren van instrument validatie wekelijks (instrument zelftest).
      LET OP: Tijdens de meting MALDI-TOF spectra worden geanalyseerd in real time door de analyse software (Materials tabel). Een lijst van tien soorten met hun scores gegeven en wordt in de laboratorium informatiesysteem (LIS) voor het melden.
    4. Evalueer kritisch de MALDI-TOF MS resultaten (zie representatieve resultaten) en eventueel ook andere tests, zoals biochemische en antibioticagevoeligheid profielen of 16S rRNA gen sequencing en eventueel Gram-kleuring voortoewijzen van een bacteriële soort tot de microbiologische rapport.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS is een nieuwe, snelle en goedkope methode voor het microbiologische routine diagnostiek. Bacteriesoorten identificatie door MALDI-TOF MS spectra produceert hoofdzakelijk uit ribosomale eiwitten maar ook andere "zeer geconserveerde eiwitten met huishouding functies die voor een minimale mate door omgevingsfactoren" 17 .De database dit MMIS bevat een groot aantal referentiespectra en zelfs bacteriën die zelden worden gevonden in klinische isolaten kan veil...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zowel MALDI-TOF MS en 16S rRNA gensequentie bieden de mogelijkheid om grote aantallen verschillende bacteriën te identificeren. MALDI-TOF MS is een snelle en goedkope methode die gemakkelijk te hanteren en grote databases van bacteriële massaspectra zijn. Daarom MALDI-TOF MS is een snelle, kosteneffectieve en betrouwbare methode voor screening studies gericht op zeldzame bacteriële pathogenen 17,20,39,51 voeren. In een prospectieve studie ter vergelijking van MALDI-TOF MS met andere fenotypische identificatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Prof. Enno Jacobs bedanken voor zijn voortdurende steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 LSigma-Aldrich Chemie, München, Germany270733
Tissue Lyser LTQiagen, Hilden, Germany85600Oscillerende homogenisator
Glass-beads 1.0 mmVWR International, Darmstadt, Germany412-2917
Thermomixer 5436Eppendorf, Hamburg, Germany2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen, Hilden, Germany51306
Taq PCR Core Kit (1.000 U)Qiagen, Hilden, Germany201225
Forward Primer TPU1 (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)biomers.net, Ulm, Germany -
Reverse Primer RTU4 (5’-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3’)biomers.net, Ulm, Germany -
Mastercycler Eppendorf, Hamburg, Germany- Thermocylcer
Reactiebuis 1,5 mlSARSTEDT, Nümbrecht, Germany72.692
Reactiebuis 2 mlSARSTEDT, Nümbrecht, Germany72.693.005
PCR 8er-CapStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany711040X
PCR 8er-SoftStripsBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany711030X
Sharp R-ZV11 Sharp Electronics, Hamburg, Germany-Microgolfoven
Titriplex III (EDTA Na2-zout dehydraat; 1 kg)Merck, Darmstadt, Germany1084211000
SeaKem LE AgaroseBiozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany849006
SmartLadder SF - 100 tot 1.000 bpEurogentec, Luik, BelgiëMW-1800-04
Bromofenolblau (25 g)Sigma-Aldrich Chemie, München, GermanyB0126
Xyleen cyanyl FF (10 g)Sigma-Aldrich Chemie, München, GermanyX4126
ComPhor L Maxi Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany-
Ethidiumbromide oplossing 1% (10 ml)Carl Roth, Karlsruhe, Germany2218.1
Gel Doc 2000Bio-Rad Laboratories, München, Germany-Gel-documentatiesysteem 
ExoSAP-IT (500 reacties)Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Verenigd Koninkrijk78201
Buffer (10x) met EDTA Life Technologies, Darmstadt, Germany402824
BigDye Terminator Kit v1.1Life Technologies, Darmstadt, Germany4337450
Hi-Di formamide (25 ml)Life Technologies, Darmstadt, Germany4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)Qiagen, Hilden, Germany63206
3130 Genetic AnalyzerLife Technologies, Darmstadt, Germany-Sequencer
MicroAmp optische 96-well reactieplaat met barcodeLife Technologies, Darmstadt, Germany4306737
3130 Genetic Analyzer, plaatbasis 96-wellLife Technologies, Darmstadt, Germany4317237
3130 Genetic Analyzer, plaathouder 96-wellLife Technologies, Darmstadt, Germany4317241
3130 Genetic Analyzer, plaatplaatjesLife Technologies, Darmstadt, Germany4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymeer, 7 mlLife Technologies, Darmstadt, Germany4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cmLife Technologies, Darmstadt, Germany4333466
Sequencing Analysis Software 5.4Life Technologies, Darmstadt, Germany-
microflexBruker Daltonik, Bremen, Germany-Onze mMIS
VITEK MSbioMérieux, Nürtingen, Germany 2de mMIS
flexControl 3.4Bruker Daltonik, Bremen, Germany-Apparaatbesturingssoftware
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)Bruker Daltonik, Bremen, Germany-Analysesoftware
α-cyano-4-hydroxycinnaminezuur, HCCA, 1 gBruker Daltonik, Bremen, Germany201344
Peptide Calibration Standard IIBruker Daltonik, Bremen, Germany222570
MSP 96 doel gepolijst staalBruker Daltonik, Bremen, Germany8224989
peqGREENpeqlab 37-5010
MALDI Biotyper Galaxy Bruker Daltonik, Bremen, GermanyArtikelnr. 1836007 Geautomatiseerd monstervoorbereidingssysteem
Vitek 2 bioMérieux, Nürtingen, Germany Onze aMIS
MicroScan Beckman Coulter, Krefeld, Germany2de aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology SystemBD, Heidelberg, Germany3de aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, FrankrijkPositieve controle voor PCR 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521(2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491(2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412(2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289(2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985(2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095(2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

16S rRNA gensequencingidentificatie van bacteri le pathogenendetectie van zeldzame bacteri nmassaspectrometrieanalysemoleculaire techniekendiagnostische microbiologieproteoomgebaseerde benaderingbiochemische profileringSanger sequencing

Gerelateerde artikelen