Methodenartikel

Productie van Dubbelstrengs DNA Ministrings

12.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53177

⸱

29 februari 2016

 ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, University of Waterloo, 2Sgd Health Innovation

In dit artikel

Samenvatting

De lineaire covalent gesloten (LCC) DNA-minivector (DNA-ministring) is een niet-viraal genoverdrachtsvector dat een hoge transfectie-efficiëntie biedt en relevant is voor elke DNA-overdrachtstoepassing. Het productiesysteem is eenvoudig, snel en schaalbaar in vivo. Het volgende protocol biedt visuele stapsgewijze instructies voor de productie van DNA-ministrings.

Samenvatting

Construeerden wij lineaire covalent gesloten (LCC) minivectors DNA als een niet-viraal gen-toedieningsvector alternatief geproduceerd via een eenvoudig platform in vivo. DNA ministrings een verhoogd veiligheidsprofiel bezitten en tevens efficiënte wijze DNA lading doelcellen. Conventionele DNA-vectoren dragen ongewenste prokaryotische sequenties, waaronder antibiotica resistentiegenen CpG motieven, en bacteriële oorsprongen van replicatie, wat kan leiden tot het stimuleren van gastheer immunologische reacties. De biologische beschikbaarheid van conventionele DNA vectoren ook verstoord door hun grotere moleculaire grootte. Hun ronde de natuur kan ook geven chromosomale integratie, wat leidt tot insertie mutagenese.

Bacteriële sequenties worden uitgesneden uit DNA minivectors, waardoor alleen het gen van belang (GOI) en noodzakelijke eukaryotische expressie-elementen. Onze LCC DNA minivectors of DNA ministrings, zijn verstoken van immunogeen bacteriële sequenties; dus het verbeteren van thEIR biologische beschikbaarheid en Indiase overheid expressie. Bij integratie vector in het chromosoom, de LCC DNA Ministring letaal verstoren de gastheerchromosoom, waardoor de potentieel gevaarlijke mutant van de prolifererende celpopulatie verwijderen. Bijgevolg DNA ministrings bieden de voordelen van 'minicircle' DNA terwijl het elimineren van de mogelijkheid van ongewenste vector integratie evenementen. In vergelijking met conventionele plasmiden en hun isogene covalent gesloten circulair (CCC) tegenhangers DNA ministrings tonen superieure biobeschikbaarheid, transfectie-efficiëntie en cytoplasmatische kinetiek - zij vereisen derhalve lagere hoeveelheden kationogene oppervlakteactieve stoffen voor effectieve transfectie van targetcellen.

We hebben in één stap induceerbaar in vivo voor de productie van DNA ministrings in Escherichia coli die eenvoudig te gebruiken, snelle en schaalbare geconstrueerd.

Inleiding

Het doel is om schaalbare hoeveelheden lineaire covalent gesloten (LCC) DNA minivectors met een eenvoudige en hoog rendement eenstaps warmte induceerbare in vivo DNA Ministring productiesysteem produceren. DNA ministrings een veilige en effectieve niet-virale strategie om DNA te leveren. Zij combineren de veiligheid van LCC vectoren met de efficiëntie van DNA minicircles en bieden ook een veiliger alternatief voor virus afgeleide vectoren zonder dat transfectie efficiëntie.

Opdat een transgen afgiftesysteem succesvol te zijn, moet de DNA vector de beoogde gastheercel in en expressie van het gecodeerde transgen (en). Er zijn verschillende cellulaire barrières die overwonnen moeten worden in de praktijk, met name in zoogdiersystemen. Om afbraak door serum nucleasen en immunologische detectie door reticulo-endotheliale systeem, moet de DNA vector bio- en immuun-compatibel met doelsysteem zijn. Onbeschermde DNA wordt snel verteerd door plasma nucleasenen het plasmide membraan bestaat uit dichte lipoproteïne barrières zodat de DNA vector snel kunnen kruisen het plasmamembraan van doelcellen moeten zijn. Eenmaal in de cel, moet de vectoren cytoplasma doorkruisen en door het kernmembraan naar de kern van transgenexpressie voeren. Niet-virale gentherapie technieken gericht op verbetering van weefsel- en cel-targeting. Het gebruik van traditionele plasmiden met deze technieken vermindert transfectie efficiëntie door de aanwezigheid van bacteriële immunogene sequenties, die snel tot zwijgen genexpressie 1,2. Conventionele plasmiden typisch voeren antibiotica resistentiegenen voor het onderhoud in prokaryote systemen. Echter, deze kunnen in menselijke gastheren mogelijke schadelijke effecten te produceren en te geven van de weerstand tegen de natuur voorkomende gastheer flora via horizontale genoverdracht effecten. Conventionele plasmiden bevatten ook dinucleotide CpG motieven 2, dat ongewenst immunostimulerende reactie kan veroorzaken, potentieelhet verminderen of zwijgen transgenexpressie.

Zoals deze enkel bestaan ​​uit de eukaryote expressiecassette DNA minivectors, zoals DNA minicircles 3, zijn een beter alternatief voor genafgifte mocht vertonen verbeterde extracellulaire en intracellulaire biobeschikbaarheid en verbeterde genexpressie vanwege hun geringere omvang en afwezigheid van immunostimulerende prokaryotische elementen 4. De gereduceerde vector formaat doet het beter met betrekking tot resistentie tegen afschuifkrachten geassocieerd met in vivo toediening aan een doelwitplaats 5. Hoe hoger aantal kopieën van de vector per massaeenheid minder transfectiereagens vereist, waardoor toxiciteit afneemt. In het geval van willekeurige vector integratie in een gastheerchromosoom, cirkelvormig covalent gesloten (CCC) vectoren, waaronder zowel DNA minicircles en conventionele plasmiden, geven moleculaire continuïteit en kan dan ook leiden tot mutagenese, die verwoestende gevolgen hebben 6. Relatief, integratie van een lineaire DNA vector verstoort het chromosoom en initieert celdood routes, waarbij de mutante cel van prolifererende celpopulatie bij het ​​verwijderen van insertie mutagenese 7. Minimalistische immunologisch gedefinieerd genexpressie (MUG) vectoren 8 en micro-lineaire vectoren 9 (MiLV) zijn LCC DNA-vectoren ontwikkeld in vitro. MUG vectoren vertoonde tot een 17-voudige verbetering transgenexpressie in vivo vergeleken met conventionele plasmide DNA vectoren 11 en hebben veelbelovende resultaten vaccin 10 en kanker gentherapie 8 getoond. Bovendien, vanwege de torsievrije structuur van de LCC minivector minder transfectiereagens vereist in vergelijking met de CCC supercoil tegenhanger, waardoor toxiciteit 7 verminderen.

Onze verbeterde LCC DNA-vectoren, DNA ministrings, hebben superieure expressie efficiëntie en bioavai aangetoondlabiliteit 7. Bovendien zijn DNA ministrings geproduceerd op een eenstaps warmte induceerbare in vivo productiesysteem, een doelmatige en kosteneffectief alternatief voor MUG en MiLV LCC vectoren, die meerdere stappen in vitro vereist. De DNA Ministring productiesysteem worden aangetoond een eenvoudige warmte induceerbare werkwijze in vivo uitgevoerd, waardoor het zowel kosteneffectief en gemakkelijk schaalbaar. Dit systeem gebruikt de Yersinia enterocolitica bacteriofaag-PY54 afgeleide Tel / pal protelomerase recombinatie systeem 12 de minimale eukaryote expressiecassette scheiden van de prokaryote plasmideskelet. We hebben Escherichia coli gemanipuleerde cellen (W3NN) Tel protelomerase expressie onder controle van de hitte-induceerbare promoter λ bacteriofaag, cI [Ts] 857 13. Bij expressie, Tel protelomerase handelt pal doelsites aanwezig zijn binnen "Super Sequence" (SS) plaatsen op de voorloper plasmideLCC producten, waarvan de DNA Ministring vervolgens kan worden gezuiverd (figuur 1) werd verkregen. De SS plaatsen op het DNA Ministring precursor plasmide codeert ook doelplaatsen andere recombinases zoals Cre recombinase (LOX), TELN protelomerase (telRL) en Flp recombinase (FRT), waardoor de productie van isogene LCC en CCC minivectors vergemakkelijken van de ene precursor plasmide. Daarnaast is elke SS geflankeerd aan beide zijden door SV40 enhancer (SV40e) sequenties, die dienen om de nucleaire translocatie 14 verbeteren. We hebben elders aangetoond dat toevoeging van achtereenvolgens SV40e geleidelijk verleent overeenkomstige verhogingen van transfectie efficiency 7. De precursor plasmide (pDNA Ministring of PDMS) bevat een polylinker (figuur 1) om het inbrengen van elke gewenste gen van interesse transcriptionele fusie met de groene fluorescente reporter (GFP) te vergemakkelijken.

De DNA-technologie kan minivectorworden gebruikt in plaats van gebruikelijke werkwijzen voor genoverdracht expressie van reportergenen en evaluaties naar de efficiëntie van transgene expressie in eukaryote systemen. DNA ministrings combineren de biocompatibiliteit en meer voordelen transfectie efficiëntie van "mini" vectoren met de superieure veiligheidsprofiel van lineair DNA vectoren. Onze robuuste one-step productie platform snel en gemakkelijk produceert DNA ministrings voor elk gen overdracht toepassing en biedt een hogere veiligheidsprofiel.

Protocol

1. Voorbereiding van de Media en Cultuur

  1. LB + Amp: Bereid 500 ml Luria-Bertani bouillon (LB) gesteriliseerd met een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Supplement met ampicilline tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml ampicilline en opslag op bij 4 ° C totdat ze nodig waren.
  2. Voor TB + Amp: Bereid je voor op grote (500 ml of meer) volumes van Ministring productie. Bereid 600 ml steriel Terrific Broth (TB) gesteriliseerd met een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 30 minuten. Supplement met ampicilline tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml ampicilline en opslag op bij 4 ° C totdat ze nodig waren.
  3. LB agar + Amp: Bereid steriele LB-agarplaten door bereiding LB + Amp aangevuld met 15 g / l agar. Aliquot ongeveer 15-20 ml in steriele Petrischalen en opslag ondersteboven op 4 ° C totdat ze nodig waren.
  4. Bereid een streak plaat van W3NN [PDMS] door aseptisch strepen W3NN [PDMS] cellen op LB agar + Amp. Incubeer de plaat overniGHT bij 30 ° C, totdat enkele kolonies kunnen worden waargenomen. Niet broeden W3NN boven deze temperatuur om te voorkomen dat derepressing protelomerase expressie.
  5. Aseptisch overdracht 5 ml LB + Amp in een steriele reageerbuis. Bereid een overnachting cultuur van W3NN [PDMS] door het enten dit volume met een enkele kolonie uit de streak plaat. Incubeer de kweek gedurende de nacht bij 30 ° C in een schudder bij 230-250 tpm.

2. Groei Fase

  1. Aseptisch overbrengen 10 ml LB + Amp in een steriele 125 ml Erlenmeyer kolf en beënt met 100 pl van de overnacht W3NN [PDMS] cultuur in de voorbereide LB + Amp, waardoor een 1: 100 verdunning.
    1. Voor grotere hoeveelheden, voeg 500 pl kweek gedurende de nacht in 50 ml TB + Amp in een 250 ml Erlenmeyer kolf, in plaats van LB + Amp.
    2. Als alternatief, als de tweede 'vertegenwoordiger' cultuur in stap 2.2.
  2. Incubeer in een schudincubator bij 30 ° C en 250 rpm tot de cultuur bereikt midden tot late log-fase, aangeduid met een optische dichtheid (OD) of absorptie: A600 = 0,8. Na 1-2 uur, moet het medium troebel beginnen om met het blote oog.
    1. Aseptisch breng 1 ml van de cultuur om een ​​schone spectrofotometer cuvette.
    2. Meet de lichtabsorptie met behulp van een UV-vis spectrofotometer met ingesteld op 600 nm golflengte. Met 1 ml van het medium waarin de cellen werden gekweekt tot de blanco (LB of TB) ingesteld. Optioneel gebruik maken van de vertegenwoordiger van de cultuur van stap 2.1.3 voor deze stap plaats.
    3. Als de cultuur nog niet de juiste OD heeft bereikt, terug te keren naar de shaker en laat wederom elk half uur. Controleer de OD vaker als de A 600 benadert 0,8.
  3. Zodra de cultuur late log-fase, aangeduid met A600 = 0,8 werd bereikt, aseptisch overbrengen van de cultuur in steriele 50 ml centrifugebuizen.
  4. Verzamel cellen door centrifugeren van de cultuur bij 10.000 xg gedurende 10 min. Inspecteer voor een pellet op de bodem van de buis.
  5. Schenk de heldere supernatant in een geschikte container biologisch gevaarlijk afval. Niet storen de cel pellet.
  6. Herhaal stap 2,4-2,5 totdat alle cellen zijn verzameld.
  7. Resuspendeer de pellet in 100 ui LB + Amp. Aspireren met een micropipet of een vortex mixer. Voor een grotere Ministring productie, resuspendeer de pellet van een 50 ml TB + Amp cultuur in 1 ml vers LB + Amp media.

3. Ministring Production

  1. Voeg aseptisch 20 ml van LB + Amp in een 125 ml erlenmeyer en verhit tot 42 ° C. Voor grotere Ministring productie, bereiden 500 ml van LB + Amp voorverwarmd tot 42 ° C.
  2. Breng de resuspensie in de voorverwarmde medium.
  3. Incubeer bij 42 ° C en 250 rpm tot voorbij de log-fase, aangeduid met A600 = 1,0. Laat geen 20 ml van de cultuur bij 42 ° C afgelopen 1 uur.
  4. Verlaag de temperatuur tot 37 ° C en laat de kweek een additionele 90 min. 500 ml, laat de kweek gedurende nog inductieperiode van 90-120 min en niet de temperatuur te verlagen.
  5. Verlaag de temperatuur tot 30 ° C en laat de cultuur schudden bij 200 rpm gedurende nog terugschakelen temperatuur gedurende 2 uur. Voor 500 ml, breiden de temperatuur terugschakelen om 4 uur of 's nachts.

4. Oogsten Ministrings

  1. Aseptisch overdracht van de cultuur in steriele 50 ml centrifugebuizen. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 min en controleer een pellet.
  2. Schenk de bovenstaande vloeistof in een geschikte container biologisch gevaarlijk afval zonder de pellet te verstoren. Herhaal dit tot alle cellen zijn verzameld.
  3. Bewaar de pellet van plasmide extractie met commerciële extractie en verwijdering van endotoxinen kit of flash bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C voor latere extractie.

Resultaten

Na DNA-extractie, resterende voorloper plasmide, LCC prokaryote ruggengraat, en het DNA Ministring zal worden gerealiseerd. Over het algemeen plasmide opbrengst en zuiverheid kunnen worden beoordeeld met behulp van een spectrofotometer. Zuiverheid wordt geschat met de verhouding van de absorptie bij 260 nm en 280 nm (A260 / A280) waarbij een verhouding van 1,9-2,0 optimaal. Alle LCC en CCC producten kunnen worden gescheiden door middel van agarose gel elektroforese (AGE) (figuur 2). AGE visualiseert de resultaten van Ministring de productie na hitte inductie, voorafgaand aan Ministring zuivering. Een kwalitatieve beoordeling van Ministring productie kan in dit stadium worden gedaan door vergelijking van de bandintensiteit Ministring (2,4 kb) bovenliggende plasmide (5,6 kb) (figuur 2). Ministring DNA kan worden hersteld via standaard plasmide gel extractie protocollen volgende AGE. Figuur 3 vat Ministring productie-efficiëntie onder verschillende omstandigheden kunnen optreden tijdens het dragening uit het protocol. Ministring productie-efficiëntie werd bepaald op basis van DNA bandintensiteit met GC de fabrikant programma. Soortgelijke densitometrie programma kan worden gebruikt om de resultaten van AGE analyseren.

figure-results-1
Figuur 1:. Overzicht Ministring productie (A) De oudervector bevat een polylinker transcriptionele fusie met een reportergen, omlijst door twee SS sites. De ruggengraat codeert voor beta-lactamase voor ampicillineresistentie en bevat ook een aantal unieke knipplaatsen voor de ruggengraat in vitro vertering. (B) Overzicht van het protocol. Stappen 2) en 3 groeifase) Ministring productie zijn weergegeven in een diagram een ​​algemeen schema van de betrokken stappen bieden, aandacht voor de eenvoud van het protocol. (C) Ministring inductie. Hitte inductie inactiveert de temperatuurgevoelige repressor, waardoor tel expressie gevolgd door Tel activiteit op SS sites in de bovenliggende plasmiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Ministring de productie na afwijkingen van het protocol. 1: Control, 2: Ongeïnduceerde, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: Early Removal. DNA Ministring is ongeveer 2,4 kb, LCC backbone is 3 kb, en pNN9 ouder plasmide is 5,6 kb. Band intensiteit van Ministring en LCC backbone bands druppel met afwijkingen van het protocol, wat aangeeft lagere Ministring opbrengst. Van links naar rechts: 1 kb ladder van New England Biolabs; Control, volgende protocol; Niet-geïnduceerde, geen temperatuur opschakelen; Overgrown, temperatuur upshift during stationaire fase; Overinduced, uitgebreid temperatuurbereik opschakelen; Vroege verwijdering, geen temperatuur terugschakelen. Plasmiden werden geëxtraheerd met behulp van de Omega-Biotek EZNA Plasmid Mini Kit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3:. Effecten van afwijkingen van het protocol op Ministring productie-efficiëntie (PE) De resultaten zijn het gemiddelde van 3 studies. PE wordt geschat op basis van de relatieve band intensiteit gemeten met behulp van AlphaImager HP na AGE. De afwijkingen optreden op de volgende stappen: Control, volgens het protocol; Niet-geïnduceerde, geen temperatuur upshift bij stap 2; Overgrown, temperatuur opschakelen begon tijdens de stationaire fase bij stap 1.6; Overinduced, verlengd temperatuur opschakelen bij stap 2.3; Vroege verwijderen, cellen verwijderd en geëxtraheerdzonder temperatuur terugschakelen bij stap 2.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We beschrijven hier een eenvoudig systeem voor de productie van LCC DNA ministrings middels een stap hitte-induceerbare protocol, waarbij geen speciale apparatuur vereist afgezien van die welke wordt gebruikt in de typische bacteriegroei en manipulatie. DNA ministrings zijn torsie-vrij, stabiele lineaire DNA-expressiecassettes, verstoken van prokaryotische genetische elementen. Zij kunnen worden gebruikt in plaats van gebruikelijke werkwijzen voor genoverdracht expressie van reportergenen, maar ook in evaluaties naar de efficiëntie van transgene expressie in eukaryote systemen. DNA ministrings combineren de biocompatibiliteit en meer voordelen transfectie efficiëntie van "mini" vectoren met de superieure veiligheidsprofiel van lineair DNA vectoren. Onze robuuste éénfasige in vivo productieplatform snel en gemakkelijk produceert ministrings DNA voor genoverdracht applicatie zonder de noodzaak voor meerdere dure in vitro werkwijzen.

Er zijn verschillende kritische stappen teoptimale Ministring productie (figuren 2 en 3). Hitte inductie is de meest kritische stap om Ministring productie. Volledig gebrek aan Ministring productie waarschijnlijk door een gebrek aan warmte inductie (cellen bij 30 ° C gehouden), waarbij onderdrukking van protelomerase expressie verhindert omzetting van precursor plasmide LCC Ministring. Naar aanleiding van de hitte inductie protocol, verwacht een productie-efficiëntie van ongeveer 75%. Heat inductie is optimaal, terwijl cellen in log-fase. Hoewel er geen statistisch significant verschil in Ministring PE bij gebruik van cellen in de stationaire fase ( "Overwoekerde", figuur 3), we waarnemen bijna 50% daling van de totale opbrengst plasmide. Opbrengst zal afhangen van het plasmide extractie protocol. Voor een optimale Ministring productie, leiden tot warmte inductie, terwijl cellen in log-fase. Arme Ministring productie zal zeer waarschijnlijk een gevolg van langdurige temperatuur opschakelen of insufficie zijnnt temperatuur terugschakelen. Langdurige temperatuur opschakelen wordt afgeraden omdat dit activeert de E. coli heat shock respons 15, die protelomerase activiteit kan remmen en interfereren met plasmide stabiliteit. Daarom is de timing van de temperatuur terugschakelen is een cruciale stap voor een efficiënte Ministring productie. Zonder bijkomende incubatietijd bij 30 ° C, werd Ministring productie-efficiëntie blijkt zeer slecht te zijn ( "Early Removal", figuur 3). Dit kan worden toegeschreven aan de hoeveelheid tijd die nodig Tel expressie en activiteit. De van oorsprong profaag PY54 encoding Tel protelomerase normaal infecteert Yersinia, die optimaal groeit rond de 28 ° C 12, wat aangeeft dat 30 ° C ook optimaal voor Tel activiteit kan zijn.

De DNA minivector productie-systeem maakt gebruik van een in-vivo-platform van hoge kwaliteit bacteriële sequentie-vrij DNA minivectors te genereren. Wijzigingen in het protocol kan include wijziging van de groeimedia plasmide en eiwitproductie optimaliseren om celgroei tijdens de groeifase (TB plaats van LB) bevorderen of verhogen Ministring productie en omzettingsefficiëntie. Voor grotere cultuur volumes (200 ml en hoger), de temperatuur terugschakelen en incubatie bij 30 ° C kan overnacht worden verlengd zonder ernstige negatieve impact op Ministring PE. We hebben opgenomen modificaties in ons protocol voor 500 ml kweken als voorbeeld. Zuivering van DNA ministrings kan worden versneld door middel van in vitro endonuclease digestie van het prokaryote backbone. Er zijn een aantal endonuclease doelplaatsen (bijvoorbeeld PI-SceI, PvuI, Seal) op de prokaryotische ruggengraat van de precursor plasmide, die kan worden gesneden open einden bloot lineaire, waardoor in vitro degradatie van de prokaryote backbone. Isolatie van ministrings uit andere vector species kunnen ook worden bereikt door anionuitwisselingsmembraan 16 chromatografie.

Een stroombegrenzing geassocieerd met de LCC DNA vector productiesysteem is de behoefte aan zuivering van het DNA uit andere Ministring LCC en CCC producten. Hoewel gemakkelijk gezuiverd met behulp van standaard plasmide isolatiemethoden, kan de isolatiestap nog een nadeel grootschalige setting. Scheiding van de Ministring kan tijdrovend met behulp van AGE als de Ministring en de LCC prokaryote ruggengraat zijn ook vergelijkbaar in grootte zijn. Als alternatief kan anionuitwisselingsmembraan chromatografie betere scheiding van ministrings van CCC vector species 16 verschaffen. Temperatuur opschakelen kan een andere potentiële beperking als hoge temperaturen ook de heat shock respons in E. activeren coli die recombinant eiwit negatief effect oplevert 17 en daardoor tarieven plasmide verminderen Ministring conversie. Wij rapporteren elders optimalisatie van de productie-platform te omzeilen en / of dergelijke effecten van heat shock 18 verzachten. Wijworden momenteel ook het optimaliseren van methoden op te heffen of te verminderen LCC prokaryotische backbone besmetting in vivo.

Chromosomale integratie van de DNA LCC Ministring verstoort de gastheerchromosoom en onderwerpt de cel apoptose. Niet alleen heeft deze vermindering van de potentiële negatieve gevolgen van mutagenese zoals oncogenese en silencing van aangrenzende genen, waardoor de veiligheid te verbeteren; het letale effect kan ook dienen als een ideale methode voor het uitschakelen in en genvervanging studies zonder de bijbehorende bijwerkingen en beschadigingen van integratie. Ministring DNA vectoren kunnen worden toegepast op de overdracht en expressie van genen voor therapeutische eiwitten, RNA, antilichamen of antigenen in een gegeven doel in vivo of vervanging van een storing of niet-functioneel allel. De eenvoudige eenstaps warmte induceerbare in vivo productiesysteem laat Ministring DNA vectoren gemakkelijk worden geproduceerd voor klinische of industriële toepassingen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC) voor de financiering van dit werk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
E. coli W3NNMediphagestrain voor ministring-verwerking: Nafissi & Slavcev, 2012
pDMS.IRES.GFPMediphagemoederplasmide voor ministring-verwerking: ook wel pDNA Ministring (pDMS) genoemd
BD Difco Gedehydrateerd Cultuurmedia: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)Fisher Scientific244620
Fisher BioReagents Terrific BrothFisher ScientificBP2468500
BD Bacto Gedehydrateerd AgarFisher Scientific214010
AmpicillineMP Biomedicals LCC2190147
Ultrapure Milipore WaterFisher Scientific Z00Q0V0USModel: Mili-Q Advantage A10 Waterzuiveringssysteem
Chirurgische handschoenenVWR(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430     
Fisherbrand Petri-schalen met helder deksel verhoogde rand (100 x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712
30 ml KIMAX TestbuizenVWR89001-448
SpectrofotometercuvetSarstedt67.74
Steriele 15 ml Falconbuizen BD Falcon62406-200,
Steriele 50 ml Centrifugeerbuizen FroggaBio2930-S0
Falcon wegwerpbare polystyreen serologische pipetten 10 mlBD Falcon13-675-20
Falcon wegwerpbare polystyreen serologische pipetten 25 mlBD Falcon13-668-2 
Micropipettor (100-1.000 μl)FroggaBioC1000-1
Micropipettor (20-200 μl)FroggaBioC200-1
Steriele pipettenpunten (100-1.250 μl)VWR89079-472 
Steriele pipettenpunten (1-200 μl)VWR89079-460
Fisher Scientific Economy-branderFisher Scientific03-917Q
Incubator-schudderaarNew Brunswick Scientific M1352-00000
Steriele Erlenmeyerkolf (125 ml)Pyrex (Sigma Aldrich)CLS4980125 Aldrich 
Steriele Erlenmeyerkolf (250 ml)Pyrex (Sigma Aldrich)CLS4980250 Aldrich 
Steriele Erlenmeyerkolf (500 ml)Pyrex (Sigma Aldrich)CLS4980500 Aldrich 
SpectrofotometerThermo Fisher Scientific335901Model: Genesys 10 Vis
VloercentrifugeBeckman Coulter 369001Model: Avanti J-E
Benchtop-centrifugeBeckman362114Model: GS-6R
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-365
1 kb DNA LadderNew England BioLabsN3232S

Referenties

  1. Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon γ. Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).
  2. Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides. Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).
  3. Darquet, A. M., et al. Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer. Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).
  4. Gracey Maniar, L. E., et al. Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).
  5. Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery. Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).
  6. Hacein-bey-abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).
  7. Nafissi, N., et al. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).
  8. Schakowski, F., et al. A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA. Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).
  9. Wang, H. S., et al. A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors. PLoS One. 7 (10), (2012).
  10. López-Fuertes, L., et al. DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice. Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).
  11. Schakowski, F., et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).
  12. Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends. Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).
  13. Nafissi, N., Slavcev, R. A. Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system. Microb Cell Fact. 11 (1), 154(2012).
  14. Xu, Z. L., et al. Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).
  15. Hoffmann, F., Rinas, U. Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli. Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).
  16. Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography. J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).
  17. Hoffmann, F., Rinas, U. Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis. Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).
  18. Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system. PLoS One. 9 (2), (2014).

Herprints en machtigingen

Tags

Lineair covalent gesloten DNAin vivo productieplasmidzuiveringagarosegelelektroforesetemperatuurverschuivingsinductieendotoxine-verwijderingskitEscherichia coli-cultuurantibioticaresistentiegengenoverdrachtsvector
Productie van Dubbelstrengs DNA Ministrings
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.