Label-free Single Molecule Detectie Met behulp microtoroıde optische resonatoren

Summary

We hebben een labelvrij biosensing-systeem ontwikkeld op basis van optische resonatortechnologie, bekend als Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), dat in staat is om enkele moleculen in oplossing te detecteren. Hier worden de procedures achter dit werk beschreven en gepresenteerd.

Abstract

Detecteren kleine concentraties van moleculen tot aan de individuele moleculen limiet heeft invloed op gebieden zoals vroege detectie van ziekten en fundamentele studies over het gedrag van moleculen. Single molecule detectietechnieken gewoonlijk gebruik labels zoals fluorescerende labels of quantum dots echter etiketten niet altijd beschikbaar, vergroten de kosten en complexiteit, en kan verstoren gebeurtenissen onderzocht. Optische resonatoren ontstaan ​​als een veelbelovende manier om enkele moleculen te detecteren zonder het gebruik van labels. Momenteel de kleinste deeltje gedetecteerd door een niet-plasmonically versterkte bare optische resonator systeem oplossing een 25 nm polystyreen bol ^1. We hebben een techniek die bekend staat als Frequency vergrendelen Optical Whispering Evanescent Resonator (bloem) dat deze limiet kunnen overtreffen en het bereiken van label-free single molecule detectie in waterige oplossing ² ontwikkeld. Zoals signaalsterkte schalen met deeltje volume, ons werk is een> 100x improvement in de signaal-ruisverhouding (SNR) over de huidige stand van de techniek. Hier de procedures achteren bloem zijn voorgesteld in een poging om zijn gebruik in het veld te vergroten.

Introduction

Single molecule detectie experimenten ingezet om de hoeveelheid analyt die in biosensoren voor vroege detectie van ziekten en het onderzoek van de fundamentele eigenschappen van moleculen ^3. Dergelijke experimenten worden typisch uitgevoerd met behulp labels echter etiketten niet altijd mogelijk verkrijgen voor een bepaald eiwit, verhogen de kosten, kan verstoren de gebeurtenissen bestudeerd en kan onhandig zijn, met name voor real time-eigen experimenten of point-of- care diagnostiek.

De huidige gouden standaard voor ongelabelde biosensoren is oppervlakteplasmonresonantie ^4, maar de commerciële oppervlakte plasmon resonance systemen hebben typisch een typisch onderste detectielimiet in de orde van nM. Onlangs hebben optische resonatoren ontpopt als een veelbelovende technologie voor het label-free single molecule BioDetection ^5. Optische resonatoren werk gebaseerd op de lange termijn (ns) opsluiting van licht ^6,7. Licht is evanescentlygekoppeld in deze apparaten meestal via een optische vezel. Wanneer de golflengte van het licht dat door de vezel komt overeen met de resonantiegolflengte van de resonator, licht efficiënt paren aan de resonator. Deze gekoppelde licht totaal intern reflecteert binnen de holte resonator genereren van een verdwijnende veld in de nabijheid van de omtrek van de resonator. Aangezien deeltjes komen het verdwijnende veld en binden aan de resonator, de resonantiegolflengte van de resonator verandert evenredig met het volume van het deeltje ^8.

Op het gebied van detectie vermogen, hebben microsferen resonatoren eerder is gebruikt om enkele influenza A-virus detecteren deeltjes (100 nm) ^9,10. Recent zijn plasmonically versterkte microbolletjes optische resonatoren gebruikt om één runderserum albumine te detecteren moleculen ¹¹ en 8-mer oligonucleotiden ^12, maar deze benadering beperkt het deeltje capture gebied 0,3 um per ² deondeugd. Groter gebied vast te leggen biosensoren zijn ideaal voor het maximaliseren van de kans op een deeltje detectie. Huidige-oplossing op basis-label vrij biosensing technologieën met grote (> 100 micrometer ²⁾ capture gebieden zijn beperkt tot het opsporen van polystyreen deeltjes ≥ 25 nm.

We hebben een ongelabelde biosensoren gebaseerd op optische resonator techniek bekend als frequentievergrendeling Optical Whispering Evanescent Resonator (bloem) ¹³ (figuur 1) die in staat is tijdsopgeloste detectie van individuele moleculen in oplossing ontwikkeld. FLOWER maakt gebruik van de lange levensduur van foton microtoroıde optische resonatoren gecombineerd met een frequentie vergrendeling feedback control, evenwichtig detectie, en computationele filtering om kleine deeltjes te detecteren enkel eiwit moleculen. Het gebruik van frequentievergrendeling kan het systeem altijd volgen van de verschuiving van de resonantie microtoroıde als deeltjes binden, zonder te vegen of scan de laser golflengte bovengrote reeksen. De principes van de bloem kunnen worden gebruikt om de detectiemogelijkheden van andere technieken zoals plasmon enhancement verbeteren. Hierna worden de procedures voor het uitvoeren BLOEM beschreven.

Protocol

1. Experimentele Setup en Monstervoorbereiding

1. Fabriceren microtoroids met de lithografie, etsen en smelten procedure zoals eerder beschreven ^6. Fabriceer microtoroids op een siliciumwafel (chip) dat typisch een grote diameter van 80-100 urn en een kleinste diameter van 2 urn.
2. Ontspan ongeveer een meter van de single-mode glasvezel (125 micrometer bekleding, 4,3 micrometer modus veld diameter) van de vezels spoel.
3. In het midden van het afgewikkelde deel van de optische vezel, strippen een klein segment (2,5 cm) van de polymere coating rondom de optische vezel via wire strippers. Opmerking: Dit is het deel van de optische vezel die zal worden gebruikt om evanescently paar licht in de microtoroıde.
4. Reinig de gestripte vezel met isopropanol alcohol en een pluisvrije doek.
5. Houd dit gedeelte van de vezel vast met een vezelhouder van magnetisch klemmen.
6. Dun de gestripte vezel tot ~ 500 nm door Melting en het trekken middels een waterstofatoom toorts en twee stappenmotoren bewegen in tegengestelde richtingen met 60 um / min. Plaats de optische vezel binnen het bovenste gedeelte van de vlam, die moet worden ~ 10 mm lang. Stoppen met het trekken van de vezel als de transmissie door de vezel stopt fluctuerende, die ofwel visueel kan worden gecontroleerd (door te kijken naar het licht dat zijdelings wordt verspreid van de vezel knipperen aan en uit), of door het aansluiten van de vezel van een fotodiode, die op een oscilloscoop is aangesloten .
7. Aanhangen het ene uiteinde van de optische vezel en plaats deze in een kale vezel-adapter. Plaats dit uiteinde van de vezel in de ingang van de foto-ontvanger.
8. Fiber paar het andere uiteinde van de vezel spoel laser met een vezeloptische koppelaar.
9. Plaats de microtoroıde chip op een monsterhouder (roestvrij staal, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) met behulp van epoxy of dubbelzijdig plakband.
10. Monteer de monsterhouder op een positioneertafel, dat bestaat uit een 3-as nano-positionering (nanocube) stadium (zie apparatuur lijst) op de top van een 3-assige micrometer. Voer alle experimenten op een pneumatisch geïsoleerde optische tafel om trillingen te minimaliseren.
11. Grof positie het monster chip met behulp van de 3-assige micrometer.
12. Lijn de-microtoroıde met chip parallel aan de optische vezel met behulp van de nano-klepstandsteller. Opmerking: Lijn de microtoroıde binnen een afstand van één golflengte van de input licht (~ 633 nm). Voor weergave van deze werkwijze gebruik van twee kolommen imaging (buis met objectief en camera, zie inventarislijst) gepositioneerd aan de bovenkant en aan de zijkant van de chip.
13. Optimaliseren van de polarisatie van het laserlicht doorheen de optische vezel via een in-line polarisatie controller (zie inventarislijst) met een knop om de polarisatie te passen. Opmerking: optimale polarisatie wordt bereikt wanneer de gemeten dip in de transmissie van de optische vezel wordt het smalste. Observeer deze duik op een oscilloscoop (zie stap 2.2 voor meer informatie).
14. Construereneen monster kamer door epoxying een glazen dekglaasje over het monster podium met een glazen microscoopglaasje als afstandhouder. Opmerking: Een plexiglas behuizing die de hele setup kan nuttig zijn voor het minimaliseren van luchtstromen zijn. Een kleine opening moet worden overgelaten om de oplossing via leiding te pompen.
15. Thermisch evenwicht deeltjessuspensies of single-molecule waterige oplossingen ≥ 1 uur in een waterbad RT (~ 500 ml). Opmerking: De monsters worden verdund tot de gewenste concentratie in microcentrifuge buisjes met behulp van de bijbehorende buffers opgegeven door de fabrikant, bijvoorbeeld PBS of HEPES. Indien geen bindinggebeurtenissen gedetecteerd, verhoging van de zoutconcentratie van de buffer.
16. Vortex deeltje bevattende oplossingen (1 ml) kort voor ~ 2 sec.
17. Injecteer deeltjes bevattende oplossingen in de monsterkamer bij 1 ml / min onder toepassing van een 1 ml spuit pomp.
18. Nadat het monster kamer is gevuld, schakelt u de injectiepomp.
19. Wacht 30 seconden voordat het vastleggen van gegevens te minimaliserende effecten van mechanische trillingen gevolg van fluïdumstroom die de meting kunnen beïnvloeden.

2. Frequentie Locking

1. Opnieuw koppelen de torus de optische vezel door het bewegen van de monsterhouder met nanopositioner, omdat de koppeling wordt verstoord als gevolg van de injectie van vloeistof.
2. Zoek de resonantiegolflengte van de microtoroıde door het scannen van de computergestuurde laser invoer via verschillende golflengtes. Voer deze stap voor het sturen van een driehoekige golfvorm spanningssignaal om een ​​piëzo-elektrisch element in de laserbesturing, dat de golflengte van de laser regelt. Voeren experimenten met zichtbaar licht (635 nm ± 2,5 nm) omdat er lage absorptie van licht in het water bij deze golflengte.
3. Meet de lichttransmissie door de optische vezel door de stekker van de uitvoer van de optische vezel in een automatische uitgebalanceerde foto-ontvanger. Sluit de output van de foto-ontvanger in een oscilloscoop met een BNC kabel. Observeren on de oscilloscoop dat op de resonantie golflengte van de microtoroıde, transmissie via de optische vezel daalt.
4. Bevestig de output van de foto-ontvanger de belangrijkste ingang van de frequentie vergrendeling terugkoppelregeleenheid (zie inventarislijst) via een kabel.
5. Voer de frequentie vergrendeling feedback controller in autolock modus met behulp van top-of-peak vergrendeling met een dither frequentie van 2 kHz en een amplitude van oscillatie golflengte van 19 fm. Empirisch set de proportionele-integrale-afgeleide instellingen in de software-venster met behulp van Ziegler-Nichols tuning regels ^14. Opmerking: Deze waarden hoeven slechts eenmaal aan het begin van alle experimenten.
6. Auto-lock de golflengte van de laser om de resonantie golflengte van de microtoroıde. Voer deze stap na het vullen van de monsterkamer. Opmerking: Als de golflengteverschuiving te groot is, dan is de feedback controller slot verliezen en schakelt automatisch over naar de scanmodus om de resonantie golflengte locatie te vinden. Dit ocstraathonden voor golflengte verschuift groter dan ongeveer een lijnbreedte (ten minste 600 fm voor alle systemen hier onderzocht).
7. Noteer de uitvoer van de terugkoppelregelaar bij 20 kHz met een 24-bit data acquisitie kaart. De gegevens te exporteren als een tekstbestand via data-acquisitie software.

3. Data Processing & Analysis

1. Fourier de gegevens om te zetten in MATLAB.
2. Lage passeren de gegevens met behulp van een "brick-wall" filter met een cut-off bij 1 kHz tot de opgelegde dither frequentie van 2 kHz te verwijderen (zie Aanvullende Code File screenshot 1).
3. Computationeel notch de gegevens filteren met behulp van een raam grootte van 16 Hz. Let op: Dit wordt gedaan om bekende bronnen van ruis te verwijderen, in dit geval, 60 Hz elektronische ruis en zijn harmonischen, evenals 100 Hz (afkomstig van de laser driver) en de harmonischen (zie Aanvullende Code File screenshot 1).
4. Omgekeerde Fourier transformatie van de data terug naar het tijdsdomein.
5. Mediaanfilter de gegevens met behulp van een venstergrootte van 1001 monsters (zie Aanvullende Code File Screenshot 2).
6. Lokaliseren stap veranderingen in de resonantie golflengte met behulp van de stappen vinden algoritme van Kerssemakers et al. ^15.
7. Genereren van histogrammen van de amplitude van elke binding stap.
8. Bereken deeltjesgrootte met Eq. (1) (zie Discussie).

Results

Deeltje binding gebeurtenissen zijn duidelijk gezien als een stap-achtige veranderingen in de resonantie golflengte van het microtoroıde na verloop van tijd (Figuur 2A). De hoogte van deze stappen worden getoond als een histogram in figuur 2B. De figuren 2-4 tonen vertegenwoordiger sporen uit de binding van exosomes (nanovesicles), 5 nm silica kralen, en single humaan interleukine-2-moleculen, respectievelijk. Het feit dat de stapvormige events schaal met een deeltjesgr...

Discussion

Als deeltjes bindt, de resonantie golflengte (λ) van de torus toeneemt. Wanneer een deeltje unbinds de resonantiegolflengte dienovereenkomstig afneemt (een naar beneden event). De deeltjesdiameter (d) kan worden bepaald door middel van histogrammen van de amplitude van elke golflengte stap. De hoogte van elke golflengtestap varieert als gevolg van variaties omvang van de gebonden deeltjes en door de ligging van de microtoroıde waarbij het deeltje bindt. De maximale verandering in resonantiegolflengte (...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Afstembare diodelaser	Newport	TLB-6300
Lasercontroller	Newport	TLB-6300-LN
Frequentie-locking feedbackcontroller	Toptica Photonics	Digilock 110
Automatisch uitgebalanceerde foto-ontvanger	Newport	Model 2007
Inline polarisatiecontroller	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bit data-acquisitiekaart	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant humaan interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm polystyreenkralen	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Optische tafel	Newport	VH3660W-OPT
Objectieflens voor beeldvormingskolom	Navitar Machine Vision	1-60228
Beeldvormingskolom (adapterbuis)	Navitar Machine Vision	1-60228
High-Res CCD-camera voor beeldvormingskolom	Edmund Industrial Optics	NT39244