Dit protocol beschrijft een methode te ontleden, experimenteel manipuleren en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explantkweken zijn bruikbaar wanneer hoge succespercentage, werkzaamheid en reproduceerbaarheid nodig om de effecten van elektroporatie van plasmiden en / of reagens stoffen, dat wil zeggen enzymatische inhibitoren testen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hele netvlies Explantaten van kippenembryo's voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het netvlies is een goed model voor de ontwikkeling van centrale zenuwstelsel. De grote omvang van het oog en vooral de toegankelijkheid voor experimentele manipulaties in ovo / in vivo maakt de kip embryonale retina een veelzijdig en zeer efficiënt experimenteel model. Hoewel de kip netvlies gemakkelijk te richten in ovo door intraoculaire injectie of elektroporatie, kan de doeltreffende en nauwkeurige concentratie van de reagentia in de retina moeilijk volledige controle. Dit kan te wijten zijn aan variaties van de exacte injectieplaats, lekkage uit het oog of ongelijkmatige verspreiding van de stoffen. Bovendien is de frequentie van misvorming en mortaliteit na invasieve manipulaties zoals elektroporatie is vrij hoog.
Dit protocol beschrijft een ex ovo techniek voor het kweken gehele netvlies explantaten van kippenembryo's en een werkwijze voor gecontroleerde blootstelling van de retina reagentia. De protocol beschrijft hoe te ontleden, experimenteel te manipuleren, en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explanten worden gekweekt gedurende ongeveer 24 uur en onderworpen aan verschillende manipulaties zoals elektroporatie. De belangrijkste voordelen zijn dat de proef niet afhankelijk van de overleving van het embryo en de concentratie van de reagentia kunnen worden gevarieerd en gecontroleerd teneinde te bepalen en optimaliseren de effectieve concentratie. Bovendien is de techniek is snel, goedkoop en samen met zijn hoge experimentele slagingspercentage, het zorgt reproduceerbaar resultaten. Benadrukt moet worden dat het dient als een uitstekende aanvulling op experimenten uitgevoerd in ovo.
Inleiding
Het netvlies is onderdeel van het centrale zenuwstelsel en is met zijn relatieve eenvoud en goed gekarakteriseerde cellulaire architectuur, een populair model voor de studie van ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel. Het oog van het kippenembryo relatief groot in vergelijking met de rest van het embryo. Het is dus gemakkelijk toegankelijk in ovo voor experimentele manipulaties, zoals injecties of elektroporatie, en vormt een uitstekend hulpmiddel om kennis retinale cel en ontwikkelingsbiologie in vivo te verkrijgen. Ondanks deze grote voordelen kan overleving van de embryo's laag zijn wanneer experimenten invasieve zoals bij electroporations, herhaalde injecties of gecombineerde experimentele manipulaties.
Elektroporatie van DNA plasmiden in het kippenembryo in ovo is een belangrijke en gevestigde techniek 1. Het maakt het kenmerken van neuronen, het traceren van lot van de cel en neuronale stukken in het centrale Nervous systeem en maakt ectopische genexpressie te analyseren eiwitfunctie in vivo. De techniek is gebruikt voor studies van neurale buis 2, achterhersenen 3 en 4 retina. Elektroporatie van de embryonale retina in ovo heeft enkele experimentele problemen die verband houden met de in vivo situatie. De positie van het oog, vanwege het craniale vouwen van het embryo, relatief dicht bij het hart. Deze nabijheid verhoogt het risico van een hartstilstand elektroporatie, en het risico neemt toe met de leeftijd van het embryo. Bovendien, om het oog, is het noodzakelijk om de embryonale membranen openen, waardoor het risico van bloeden, misvormingen en daaropvolgende verminderde levensvatbaarheid verhogen. Bij het testen en optimaliseren van een nieuwe DNA-plasmide vaak zonder een bekende fenotypische resultaat, kunnen deze beperkingen de effectiviteit en kracht van de werkwijze, zelfs voor een ervaren experimentator verminderen. Zoals gepresenteerd in dit protocol, de cultuur van de whole retinale explantatie, gedefinieerd als het geheel neurale retina met pigment epitheel verwijderd, is een efficiënte methode die een aanvulling op de in ovo benadering.
Intraoculaire injecties van chemische reagentia relatief gemakkelijk uit te voeren in ovo. Toch kan de doeltreffende en nauwkeurige concentratie ingespoten reagentia in de neurale retina moeilijk volledig te controleren. De geïnjecteerde volume kan variëren als gevolg van lekkage en de exacte plaats van injectie kan zowel de verdeling van de reagens binnen het oog en de diffusie door het glasachtig lichaam beïnvloeden. De variabiliteit heeft grote gevolgen voor de interpretatie van de resultaten bij dwz een dosis respons curve voor een enzymremmer bepaald hebben; vooral als het effect klein en de vensterfuncties van het effect is smal. Bovendien kan slechts één oog worden uit elk embryo bij het uitvoeren van in ovo experimenten vanwege mogelijke systemische effecten via de bloedstroomop het contralaterale oog. Leeftijd matching is belangrijk bij het bestuderen van de ontwikkeling en de individuele variatie tussen behandelde en controle embryo's kan leiden tot extra experimentele variabiliteit.
Daarom ex ovo methode gebaseerd op retinale explantaten van kippenembryo's ontwikkeld, waarbij de neurale retina kan worden blootgesteld aan een uniform en gecontroleerde experimentele conditie in vitro. Het huidige protocol is ontwikkeld op basis van eerdere protocollen 5-9. Retinale explantaten uit stap (e) 20 (embryonale dagen [E] 3) naar ST31 (E7) kippenembryo's werden ontleed, gekweekt en geëlektroporeerd met een gedefinieerde DNA plasmideconcentratie of blootgesteld aan een medium met een bepaalde concentratie van een chemisch reagens. De hier gepresenteerde protocol is met succes geïmplementeerd in recente publicaties, met behulp van verschillende chemische stoffen, met inbegrip van toezichthouders van de DNA-schade route, zoals KU55933, SB 218.078 en NSC 109.555 ditosylate en de celcyclus, zoals Cdk1 / 2 inhibitor III 10,11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol wordt uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de Vereniging voor onderzoek in de visie en oogheelkunde".
1. Egg Handling en verzameling Eye
- Slaan witte Leghorn eieren bij 12-14 ° C niet langer dan 1 week. Indien beschikbaar, gebruik dan een gekoelde wijnkoeler om de bevruchte eitjes te slaan.
Opmerking: Hogere temperaturen winkel leiden tot abnormale ontwikkeling van embryo's, terwijl lagere temperaturen verhoogt sterfte. Langdurige opslag tijd verhoogt zowel de mortaliteit en abnormale ontwikkeling. - Incubeer de eieren in een 37,5 ° C en 60% bevochtigde incubator met ei zacht schommelen met een frequentie van 5 keer per 24 uur.
- Verwijder de bebroede eieren uit het ei incubator op het gewenste embryonale leeftijd.
Opmerking: De leeftijd van het kippenembryo wordt bepaald als de incubatietijd en wordt aangeduid als embryonale dag (E) of stages (st) Volgens de reeks ontwikkelingsstadia beschreven Hamburger en Hamilton 12. - Plaats de geselecteerde eieren in de laminaire stroming kap. Veeg de eierschaal met 70% ethanol om verontreiniging van het embryo te voorkomen.
Opmerking: Voer alle procedures onder aseptische omstandigheden met steriele oplossingen https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions en instrumenten. - Raak de kant van het ei stevig tegen een hard oppervlak te kraken openen het ei. Plaats de inhoud in een 100 mm petrischaal. Gebruik een kleine lepel om het embryo te brengen naar een 35 mm petrischaal met voorverwarmde (37 ° C) 1x PBS om het weefsel uitdroogt.
- Plaats de 35 mm petrischaal met het embryonaal weefsel op een verrekijker StereoVision dissectiemicroscoop in de laminaire stroming kap. Onthoofden het embryo door knijpen de nek met fijn pincet en het lichaam te verwijderen.
- Gebruik fijne tang om een incisie te maken thruwe de mond, ventraal van het oog. Beginnend op de plaats van incisie, openscheuren het weefsel rondom het gehele oog. Knijpen van de oogzenuw en verwijder de intacte oog uit de oogkas. Verzamel zowel het linker- en rechteroog van dezelfde embryo voor gebruik als controle of behandelde oog.
- Gebruik een kleine lepel om de ogen naar een nieuwe 35 mm petrischaal met voorverwarmde (37 ° C) 1x PBS.
2. Voorbereiding van Whole netvlies Explantaten
- Gebruik fijne tang om alle weefsel rond de ogen te verwijderen inclusief de sclerale anlage.
Opmerking: Het weefsel zal gemakkelijk los laat de retina van het glasachtige lichaam en de lens met de pigment epitheel intact (Figuur 1A-B). - Gebruik fijne tang om een kleine incisie in het pigmentepitheel van het dorsale gedeelte van het oog knijpen zonder de neurale retina (Figuur 1C).
- Gebruik fijne tang om voorzichtig te scheuren open het pigment epitheel starting op de plaats van incisie, waardoor de lens en de gehele retina bevestigd aan het glaslichaam (figuur 1D). Houd het oog in warm (37 ° C) 1x PBS om de verwijdering van het pigment epitheel bevorderen.
Opmerking: Het pigment epitheel kan moeilijk te verwijderen, in het bijzonder langs het ciliaire lichaam rond de pupil, in het voorste gebied van het oog en langs de spleet choroidea. Derhalve sommige pigment epitheel kan worden overgelaten aan de neurale retina (Figuur 1E-F).
3. Behandeling van Whole Retinale Explantaten
- Elektroporatie van gehele netvlies explantaten
Opmerking: Elektroporatie van gehele netvlies explantaten kan direct na stap 2 worden uitgevoerd.- Bereid kweekmedium dat 1: 1 DMEM: F12 Nutrient mix, 10% FBS, 10 U / ml penicilline streptomycine, 5 ug / ml insuline en 2 mM L-glutamine.
- Snijd een 1,5 ml wegwerp plastic cuvet (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (of een kleine container kunnen houden 300-400 ul oplossing) ongeveer 8 mm vanaf de bodem met een fijn bladen saw.
- Verdun het DNA-plasmide keuze in 1xDPBS tot een eindconcentratie van 0,1 ug / ul.
- Schakel de electroporator en ingestelde parameters tot 15 V voor ST20 - ST25 (E3-E4) netvlies en 20 V voor ST26 - ST27 (E5) netvlies. Stel de puls-herhalingen tot 5 pulsen van 50 msec puls-length met 1 seconde intervallen. Gebruik een pulsgenerator die kan worden geregeld door een voetpedaal op de vloer beide handen nodig om de elektroden op zijn plaats.
- Verbind twee paddle gevormd (plat cirkelvormig diam. 4 mm) platina-elektroden (figuur 2A) aan de uitgang van de pulsgenerator.
Opmerking: De platina-elektroden die in dit protocol zijn gemaakt door de universiteit workshop. De elektroden werden gemaakt van 0,1 mm platina plaat "rondelles" (platina rang: 950 Pt / 5 Cu). De verbindende 0,8 mm wire werd geïsoleerd met behulp van plastic buizen. - Overdracht van de hele retina explant voorzichtig uit stap 2.3 tot de cuvet (of gelijkwaardig kleine container) met behulp van een polyethyleen Pasteur pipet met de tip afgesneden om de juiste tip-opening grootte te verwerven voor de retinale explantatie. Vermijd het gebruik van pipet tips als het netvlies heeft de neiging om te hechten aan de kunststof en verscheuren.
- Gebruik een 100 ul pipet om verwijder voorzichtig de gehele 1x PBS rondom het netvlies explant zorg het netvlies om te voorkomen dat scheuren niet aan te raken.
- Voeg 100 ul plasmide-oplossing voor de cuvet om de hele retina explantaat dekken. Duw onderaan de retinale explantatie met een tang als het drijft naar de top. Tang of elektroden om de lenspositie één zijde van de cuvette en de oogzenuw staan onderaan de cuvette.
- Plaats de positieve elektrode voor de lens en de negatieve elektrode achter de retina (Figuur 2A), zonder het weefsel.
- Breng de huidige door te drukken beneden de voet-pedaal. Controleer voor bellen op de elektroden aangeeft succesvolle ontlading.
- Gebruik een pipet om 100 ul alle plasmide mix van de cuvette te verwijderen zonder beschadiging van het netvlies. Het plasmide mix kan 3-5 maal hergebruikt worden.
- Vul de cuvette met voorverwarmde (37 ° C) 1x PBS. Gebruik een tang om voorzichtig los de retinale explantatie van de wand van de cuvette. Na elektroporatie van de retina soms bedekt met bellen, waardoor het zich aan de wand van de cuvette.
- Gebruik het polyethyleen Pasteur pipet om de gehele retina explantaat over in een 24-wells plaat met 1 ml voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium per well. Incubate een retinale explantatie per goed.
- Incubeer de retinale explantatie bij 37 ° C op een rotator shaker met een constante snelheid van 50 opm, in een cel incubator met 5% CO2 gedurende 24 uur. De rotatie is om maximale blootstelling ervoor te zorgen dat het medium en prevent hechting van de retina naar de bodem van de 24-well plaat.
- Ga verder naar stap 4.
- Behandeling van gehele netvlies explantaten met chemische reagentia
Opmerking: Chemische behandeling van hele netvlies explantaten kan direct na stap 2 worden uitgevoerd.- Bereid kweekmedium dat 1: 1 DMEM: F12 Nutrient mix, 10% FBS, 10 U / ml penicilline streptomycine, 5 ug / ml insuline en 2 mM L-glutamine.
- Gebruik een kleine lepel om de retinale explantatie brengen van stap 2.3 in een 24-wells plaat met 1 ml voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium per well. Incubate een retinale explantatie per goed.
- Incubeer de hele retina explantaat gedurende 60 min bij 37 ° C op een rotator shaker met een constante snelheid van 50 opm, in een cel incubator met 5% CO 2 voor het toevoegen van een chemisch reagens of voertuig.
- Bereid de chemische oplossing, bijvoorbeeld Cdk1 / 2 inhibitor III, een remmer van de M-fase-progressie 13, bij een uiteindelijkeconcentratie van 30 uM in DMSO.
- Verwijder de 24-wells plaat met het gehele netvlies explantaat uit de celincubator. Voeg 10 ul van het chemische reagens of vehikel (DMSO) rechtstreeks op het netvlies medium, wat resulteert in een eindconcentratie van 300 nM Cdk1 / 2 inhibitor III in 0,01% DMSO. Handmatig roteren 24-putjesplaat zorgen voor een gelijkmatige verdeling van het chemische reagens of het voertuig in de oplossing.
- Incubeer de retinale explantaten bij 37 ° C op een rotator shaker met een constante snelheid van 50 opm, in een incubator met 5% CO2 gedurende de gewenste tijd (tot 24 uur).
- Ga verder naar stap 4.
4. Fixatie en Bevriezing van Whole netvlies Eexplants
- Verwijder de 24-wells plaat met het behandelde gehele retina explantaat uit de cel incubator.
- Gebruik een kleine lepel om de retinale explantatie overbrengen naar een 24-wells plaat met 1 ml / putje ijskoude 4% paraformaldehyde in 1xPBS. Incubate op ijs gedurende 15 min.
- Gebruik een kleine lepel om het gehele netvlies explantaat overbrengen naar een 24-wells plaat met 1 ml / putje ijskoude 1xPBS het netvlies te wassen. Incubeer op ijs gedurende 10 min.
- Gebruik een kleine lepel om het gehele netvlies explantaat overbrengen naar een 24-wells plaat met 1 ml / putje ijskoude 30% sucrose in 1xPBS. Incubeer op ijs gedurende 1-3 uur afhankelijk van de embryonale dag van de retina. Voor ST20 - ST25 (E3) netvliezen, incubeer gedurende 1 uur, ouder netvliezen nodig langere incubatietijd in sucrose.
- Gebruik een kleine lepel om het hele netvlies explant overbrengen naar een paraffine film met ongeveer 500 ul cryostaat bevriezing montage medium. Verwijder zoveel mogelijk sucrose door zachtjes bewegen van de retina explantaat in het invriesmedium met de kleine lepel.
- Breng de retinale explantatie om een inbedding mal met bevriezing medium. Positioneer het oog op toekomstige snijden vergemakkelijken. Zet de inbedding mal met het hele netvlies explantaat op Dr.y ijs tot het medium wordt bevroren vaste stof. Bewaren bij -80 ° C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft de bereiding (figuur 1A-F) en het kweken van gehele netvlies explantaten uit kippenembryo's. Dit protocol werd met succes gebruikt voor gehele netvlies explantaten uit embryo's van ST20 (E3) naar ST31 (E7).
Elektroporatie van DNA plasmiden in gehele netvlies explantaten maakt etiketteren en traceren van retinale voorlopercellen of overexpressie van verschillende genproducten. Voor elektroporatie experimenten werd het pigment epitheel voorzicht...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit werk een gedetailleerd protocol voor dissectie, elektroporatie of chemische behandeling, en het kweken van hele netvlies explantaten van kippen embryo's wordt gepresenteerd. Dit protocol is eenvoudig, snel en zorgt voor zowel een hoog slagingspercentage en reproduceerbare resultaten.
Elektroporatie van gehele netvlies explantaten produceert grote delen van cellen die het gen construct van interesse te tonen. Het is gemakkelijk om de juiste positie van de elektro...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Het werk werd ondersteund door Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbeidsnämnd för synskade, Synfrämjandets forskningsfond en St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μl pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 ml disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300 nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platinum, op maat gemaakt | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Verdunning 1/4.000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm dikte |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Lokale leverancier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlijn Duitsland |
Referenties
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
