Methodenartikel

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53210

⸱

12 september 2015

 ,  , 
1Department of Physiology & Membrane Biology, University of California Davis

In dit artikel

Samenvatting

De gemodificeerde Landis-techniek maakt gepaarde meting mogelijk van de hydraulische geleidbaarheid van individuele microvaten in de mesenterium van normale en genetisch gemodificeerde ratten onder controle- en testomstandigheden met behulp van microperfusietechnieken. Het biedt een handige methode om mechanismen te evalueren die de doorlaatbaarheid van microvaten en transvasculair uitwisseling onder fysiologische omstandigheden reguleren.

Samenvatting

Experimenten om de permeabiliteit eigenschappen individueel geperfundeerde microvaatjes meten een brug slaan tussen onderzoek naar de moleculaire en cellulaire mechanismen reguleren van vasculaire permeabiliteit in gekweekte endotheliale cel monolagen en de functionele eigenschappen van uitwisseling gehele microvasculaire bedden. Werkwijze voor canule en perfuseren venulaire haarvaten van rat mesenterium en meet de doorlatendheid van het microvaatje wand wordt beschreven. De belangrijkste apparatuur die nodig is voorzien van een intravitale microscoop met een grote aangepaste stadium dat micromanipulators ondersteunt drie verschillende Microtools positioneren: (1) een afgeschuinde glas micropipet om canule en perfuseren de microvessel; (2) een glazen micro-occlusie te transient blokkeren perfusie en maken meting van transvasculaire waterstroom beweging bij een gemeten hydrostatische druk, en (3) een stompe glasstaaf de mesenteriale weefsel stabiliseren op de plaats van de canule. De gemodificeerde Landis micro-occlusie technique gebruikt rode cellen gesuspendeerd in kunstmatige perfusaat als markers van transvasculaire vloeiende beweging, en ook maakt herhaalde metingen van deze stromen als experimentele omstandigheden worden gewijzigd en hydrostatische en colloïd osmotische drukverschil over de microvaatjes worden zorgvuldig gecontroleerd. Metingen van doorlatendheid eerste gebruik van een controlegroep perfusaat, dan na opnieuw canulatie van dezelfde microvessel met de test perfusates vrijgave gepaarde vergelijkingen van de microvessel respons onder deze goed gecontroleerde omstandigheden. Pogingen om de methode uit te breiden tot bloedvaten in het mesenterium van muizen met genetische modificaties wordt naar vasculaire permeabiliteit modificeren waren ernstig beperkt door het ontbreken van lange rechte en onvertakte microvaatjes in de muis mesenterium, maar de recente beschikbaarheid van de ratten met gelijke genetische modificaties behulp het CRISPR / Cas9 technologie zal naar verwachting nieuwe gebieden van onderzoek, waar de hierin beschreven methoden kunnen worden toegepast openen.

Inleiding

Microperfusion in het vaatstelsel inhoudt vaststelling gecontroleerde stroom van een kunstmatige perfusaat van bekende samenstelling via een micropipet in een bloedvat gewoonlijk minder dan 40 micrometer in diameter. De geperfuseerde vaartuig blijft in zijn normale omgeving en weefsel wordt geperfuseerd met bloed van het dier tot het moment van de canule. Bij gebruik in combinatie met een reeks van videobeelden of fluorometrische technieken in situ microperfusion maakt meting van water en opgeloste stof stroomt over de wanden van kleine bloedvaten onder omstandigheden waarbij de drijvende krachten van deze stromen zijn bekend en de permeabiliteit eigenschappen van de vaatwand kan worden direct geëvalueerd. Verder, door het regelen van de samenstelling van de vloeistof rond het microvaatje in het weefsel (perfusaat en superfusate), de regulering van microvaatje permeabiliteit en uitwisseling kan worden onderzocht doordat de endotheelcellen die het microvaatje wand te worden blootgesteld aan diverse eXperimental voorwaarden voor nauwkeurig gemeten tijd (sec HR) (agonisten, gewijzigde perfusie voorwaarden, fluorescerende indicatoren intracellulaire samenstelling en signalering te meten). Bovendien kunnen ultrastructurele of cytochemische evaluaties van belangrijke cellulaire moleculaire structuren reguleren van de barrière onderzocht in dezelfde microvaatjes waarin doorlaatbaarheid wordt direct gemeten. De benadering vormt aldus een brug tussen onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen die endotheliale barrièrefunctie passen in gekweekte endotheliale monolagen en onderzoek intacte microvaatjes. Bekijk de volgende beoordelingen voor verdere evaluatie 1-6.

Een beperking van microperfusion is dat het alleen in microvasculaire bedden die dun, transparant zijn en voldoende structurele integriteit cannulatie met een glazen micropipet mogelijk kan worden gebruikt. Terwijl de vroege onderzoeken gebruikt kikker bloedvaten in mesenterium en dun cutane pectoris muscle 7,8, verreweg het meest gebruikte preparaat in zoogdierlijke modellen de ratten mesenterium 9-15. De meeste onderzoeken hebben zich gericht op acute veranderingen in vasculaire permeabiliteit bestudeerd over een periode van 1-4 uur, maar meer recente onderzoeken zijn uitgebreid tot metingen aan individuele vaartuigen 24-72 uur na een initiële perfusie 12,16. De recent ontwikkelde CRISPR technologie, die belooft om meer genetisch gemodificeerde rat modellen beschikbaar te stellen voor het bestuderen van de vasculaire permeabiliteit regelgeving 17 moeten de in deze mededeling beschreven methoden kunnen worden toegepast in venulaire microvaten van het mesenterium in deze belangrijke nieuwe rat modellen.

De werkwijze vereist een omgekeerde microscoop uitgerust met een op maat gebouwde microscooptafel groot genoeg is om zowel de dieren preparaat en ten minste drie micromanipulators gebruikt om positie microtools nabij geperfundeerde vat en een perfusie micropipet passen aan het vat houdenlumen. Bijvoorbeeld een aangepaste platform voor een xy microscoop podium (ongeveer 90 × 60 cm) kunnen worden vervaardigd uit een 1 cm dikke stalen plaat met een rust-proof coating. Het podium is om een ​​technische index tafel of twee dove-tail dia's gemonteerd in een rechte hoek en ondersteund op Teflon pilaren of een bal transfers voor beweging in het horizontale vlak bevestigd. Een typische rig (zie figuur 2) heeft veel gemeen met de microscoop en micropositionering apparatuur die wordt gebruikt voor een reeks van intravitale microcirculatie experimenten zoals die tot enkele bloedvat flow en hematocriet, lokale zuurstof levering van bloed perfusie haarvaten, regulering van de vasculaire gladde meten spierspanning, en de lokale microvasculaire ophoping van fluorescerende tracers geïnjecteerd in de hele omloop. 18-26

Het fundamentele aspect van de techniek is het meten van de volumestroom (J v) over een bepaald oppervlak (S) van het microvaatje wand. Volbrengendit via de gemodificeerde Landis techniek hierin beschreven een eenvoudige omgekeerde microscoop voldoende. Een kleine videocamera gemonteerd op de afbeelding poort en het videosignaal, met een toegevoegde tijdbasis, wordt weergegeven op een videomonitor en geregistreerd in digitale vorm op een computer of een digitaal of analoog signaal op een videorecorder. Zodra de canule microvaatje wordt het gedeelte van het microvaatje zichtbaar voor de camera kan worden veranderd door bewegen van de manipulatoren en fase als een eenheid zonder verstoring van de canule.

Meting van transvasculaire stromen kunnen ook worden gecombineerd met uitgebreide onderzoekingen met een gesofisticeerde fluorescentiemicroscoop met geschikte filters zoals installaties voor metingen van opgeloste permeabiliteit, fluorescent verhouding bewaking van cytoplasmatisch calcium of andere cellulaire mechanismen en confocale beeldvorming 6,12,13, 27. Een belangrijk voordeel van microperfusion aanpak is de mogelijkheid om herhaalde metingen maken op hetzelfde vaartuig, Onder gecontroleerde verandering van de drijvende kracht, zoals hydrostatische en oncotische drukken, of geïnduceerde verandering in het vat reacties op ontstekingen. De meest voorkomende ontwerp is een gepaarde vergelijking van gemeten doorlatendheid (Lp) op hetzelfde vaartuig met het vaartuig eerst geperfuseerd via een micropipet gevuld met een controle perfusaat en de rode celsuspensie een basislijn permeabiliteit staat vast, daarna met een tweede pipet het testmiddel toegevoegd aan het perfusaat. Meerdere canuleringen zijn mogelijk met de cyclus herhaald na reperfusie de controle pipet.

Het onderhavige protocol toont de infusen en microperfusion van een venular vaartuig rat mesenterium water fluxen over het microvaatje wand nemen en te meten het L p van de vaatwand, een bruikbare index van de permeabiliteit van de gemeenschappelijke route voor water en opgeloste stoffen tussen de intacte endotheliale barrière. De procedure wordt de gewijzigde Landis techniq genoemdUE omdat de oorspronkelijke Landis principe van het gebruik van de relatieve beweging van rode cellen als maat van transvasculaire vloeistofuitwisseling na perfusie geblokkeerd bewaard 28, maar het aantal experimentele condities (bijvoorbeeld de hydrostatische en albumine oncotische drukverschillen over het microvaatje wand) beschikbaar na microperfusion is veel groter dan in uncannulated bloed perfusie microvaten 8,29.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.

1. Voorafgaande Fabrication van Micropipetten, fixeren en blokkers

  1. Trek verscheidene schone borosilicaatglas capillairen doormidden met een elektronische puller ingesteld dat, wanneer teruggetrokken, de gestrekte deel van de buis ongeveer 1 cm in lengte en de twee helften enigszins symmetrisch. Zorg dat de tapsheid in overeenstemming met de afmetingen in figuur 1. Gebruik beide helften van micropipetten, restrainers en blockers.
    1. Bevel de micropipetten met behulp van een lucht aangedreven slijpschijf 30 met 0,5 micrometer schuurpapier gebaad met water. Stel de hoek van de micropipet houder, zodat het ongeveer 30 graden van horizontaal.
    2. Grondig te wassen en drogen van de micropipetten met behulp van zuigkracht om schone aceton trekken door de tip en de schacht. Inspecteer de micropipetten (Figuur 1A) met behulp van een kleine rechtopstaande microscoop met 4 × en 40 × doelstellingen voorzien van een alligator clip micropipet houder en een oculair dradenkruis.
    3. Selecteer micropipetten met tip opening ongeveer 50 micrometer lang met een schuine kant waarvan de lengte / breedte verhouding is tussen de 3.1 en 3.5 en met een sterk taps toelopende punt dat helpt doordringen in de taaie collageen vezels in het mesenterium.
    4. Slaan 15-20 micropipetten van lichtjes verschillende grootte in een stofvrije doos.
  2. Maak restrainers met getrokken capillaire buisjes bereid in stap 1.1). Houd een getrokken glas capillair kort bij een MICROVLAM een stomp uiteinde (Figuur 1B) te vormen. Opslaan meerdere in een stofvrije doos.
  3. Maak microoccluders met getrokken capillaire buisjes bereid in stap 1.1). Houd een getrokken capillaire buis onder een MICROVLAM buigt (met een slang adapter, bijv., 23G), de dunne stift (ongeveer 4 mm van top) tot een hoek van bijna 120 graden maakt met de as ( figuur 1C). Maken en op te slaan meerdere.

2. Animal Voorbereiding en Chirurgie

  1. Verdoven mannelijke (350-450 g) of vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (200-300 g) met pentobarbital natrium (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) via subcutane injectie; beschermen mesenterium door geen intraperitoneale injectie.
  2. Gedurende chirurgische procedures en experimentele protocollen houden verdoofd door aanvullende injecties (30 mg / kg) indien nodig. Bepaal de diepte van de anesthesie door teen knijpen of cornea reflex. Na voltooiing van de experimentele procedure, euthanaseren de rat via overdosis pentobarbital of intracardiale injectie van een verzadigde kaliumchloride onder verdoving.

3. Bereid Solutions en Erythrocyten voor gebruik als Flow Markers

  1. Bereid zoogdieren Ringer's oplossing voor superfusate en controle perfusaat oplossing (kenmerkend zoogdieren Ringer's oplossing bevattende 10 mg / ml vetzuurvrij runderserumalbumine, BSA).
    1. Filter perfusaat door 0,2 um spuit filters om minuscule deeltjes die de micropipet tip kunnen blokkeren te verwijderen; filter in kleine schone container.
  2. Bereid erytrocyten door trekken ongeveer 0,2 ml bloed uit de staartader van de verdoofde rat in een 20G naald op een kleine spuit met 0,05 ml heparine (1000 U / ml) en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis bevattende ongeveer 14 ml zoogdier oplossing van Ringer-oplossing .
    1. Centrifuge zachtjes pak rode cellen (ongeveer max 200 xg gedurende 7 min). Trekken uit het supernatant en resuspendeer de rode cellen in Ringer-oplossing.
    2. Na centrifugeren en verwijderen van supernatant driemaal verlaten het verpakte rode cellen op de bodem van de buis voor later gebruik. Merk op dat deze procedure kan bloedplaatjes in het uiteindelijke perfusates tot minder dan 0,1% van het normale niveau 31.

4. Schik de Tissue op de AnimalDienblad

  1. Scheren de buik van de verdoofde rat van onder de navel tot zwaardvormig proces. Zorg ervoor dat het geschoren gebied strekt zich uit rond de rechterzijde (voor rat geplaatst aan de rechterkant), zodat haar niet vormen een lont aan de superfusate trekken uit van het weefsel ook. Verwijder gesneden haren met een natgemaakte gaasje of weefsel.
    1. Houd de huid met een stompe getande pincet en een middellijn incisie (2-3 cm lang) door de huid met behulp van een stevige schaar. Met een fijne (iris) schaar maken een soortgelijke incisie door de linea alba, het opheffen van de buikwand met gekartelde tang om te voorkomen dat schade aan de darmen.
    2. Met het dier op zijn kant op het dier lade, trek de darmen uit de buikholte met behulp van wattenstaafje applicators (houten stok) gedrenkt in Ringer's oplossing en stompe gekartelde tang. Schik de darm in het weefsel goed, zodat het mesenterium is gedrapeerd over de pilaar voor het bekijken door de microscoop (pote zorg om te voorkomen dat het aanraken van het mesenteriumntially beschadigen microvaten) met ofwel een tang of katoen.
      Opmerking: Het dier tray (figuur 2A) kan worden geconstrueerd uit plexiglas en vereist een weefsel vormt (ongeveer 3 mm diep), een optisch helder pijler (bijvoorbeeld gepolijst kwarts ongeveer 2 cm diameter en 5 mm hoog.), En een verwarmingskussen aangepast aan de temperatuur van het dier te handhaven. De dikte van de pijler mag niet hoger zijn dan de werkafstand van de doelstelling.
  2. Plaats het dier lade op de microscooptafel zodat het mesenterium zichtbaar door de oculairs.
  3. Positioneer een zwaartekracht gevoede infuus lijn continu superfuse het mesenterium met zoogdieren Ringer's oplossing gehandhaafd op 35-37 ° C. Gebruik gaasjes aan de darm zijn plaats te houden, helpen vocht vasthouden, en lont overtollige Ringer's oplossing van het oppervlak. Pas de doorstroming en zuig het effluent een consistente superfusate dikte behouden.
  4. Identificeren doel venulaire haarvaten, dievertakte segmenten benedenstrooms van convergerende stroming, één of twee vertakkingen distaal true capillairen. Vind een onvertakte vat (idealiter 600 tot 1000 urn lang) met stevige bloedstroom en vrij van witte bloedcellen plakken op de vaatwand.
  5. Positioneer de test microvaatje in het midden van het veld microscoop en zet de restrainer in positie in de buurt van de gekozen cannulatie website.

5. Vul Micropipet en Mount in Holder

  1. Net voordat cannuleren, schorten de rode cellen in het perfusaat. Voeg 7 pl erytrocytenconcentraat met 0,5 ml perfusaat in een schone reageerbuis boorsilicaat. Opmerking: hematocriet van 1-3% kunnen worden gebruikt, maar consistente hematocriet leiden tot consistente perfusaat concentraties van stoffen die vrijkomen uit de erytrocyten.
  2. Breng een 1 ml spuit met een 23G slangadapter en PE-50 buizen (5-15 cm lengte). Trek het perfusaat / rode cel mengsel in de spuit. Omkeren spuit te mengen en te verdrijven alle luchtbellen uit slangen enadapter. Voor een hogere efficiëntie, pasvorm slang aan verschillende spuiten voor het experiment begint en bewaar ze in een stofvrije doos of plastic zak.
  3. Vul het micropipet door het bevorderen van de slang in het grote einde van de micropipet totdat het aanligt tegen de taps toelopende regio. Breng een zachte snelle druk op de zuiger om de micropipet tip vullen. Opmerking: Een kleine stroom of een druppeltje moet zichtbaar zijn op de tip om volledige vulling bewijs.
  4. Trek de buis, terwijl zachtjes te duwen op de zuiger om het bredere deel van de micropipet as te vullen. Verwijder kleine belletjes in de brede as door voorzichtig flicking de micropipet as. Opmerking: Een soortgelijke procedure is geïllustreerd 32.
  5. Plaats de micropipet in een pipet houder met een zijpoort die een continue vloeistof verbinding met een water manometer maakt. Opdat de houder, die een hydraulische aandrijving worden gebruikt om zeer fijne voortbeweging van de micropipet controle is bevestigd is onder een kleine hoek (15-25 °)de horizontale zodat de rand van de micropipet tapsheid heeft de darm of bak niet raken.
  6. Monteer de hydraulische aandrijving op een beweegbare micromanipulator, waarin x, y en z-drives moet nauwe afstemming op de proef vat (figuur 2) in te schakelen.
  7. Stel de hydrostatische druk waarbij de vloeistof in de micropipet met een injectiespuit of met water gevulde rubberen bol om de hoogte van de vloeistof verandert de waterkolom van de manometer tot ongeveer 40 cmH 2 O boven het mesenterium.
  8. Canule het microvaatje zo snel mogelijk na het vullen van de pipet; rode cellen naar de bodem van de pipet, zodat na ongeveer 40 min weinig rode cellen stroomt in het vat.

6. Microcannulation en microvasculaire Pressure Measurement

  1. Voor het positioneren van de gevulde micropipet onder de microscoop, druk de weerhouder op het weefsel nabij het microvaatje toepassing van voldoende kracht te grijpen het weefsel. Teken desteunkorven rug enigszins uitrekken het weefsel in overeenstemming met de microvaatjes, zodat de spanningen in het mesenteriale collageenvezels zijn afgestemd op het vat.
    1. Lijn de micropipet met het schip en laat deze in het oog door de oculairs. Plaats de punt juist stroomopwaarts van de gekozen canulatieplaats en laat deze op het weefsel, zodat deze gedeeltelijk belemmert stroming binnen het vat, maar niet te verstoppen.
  2. Canule het schip door het rijden van de pipet langzaam in het vat lumen met behulp van de hydraulische aandrijving. Wees niet te duwen door de onderkant van het schip.
    Opmerking: Als de micropipet komt het lumen, het perfusaat snel wast het bloed in het vat buiten het lumen en perfusievloeistof vrij stroomt in omloop distaal van het dier op de proef microvaatje, verplaatsen van sommige van de normale doorbloeding in de downstream vaten.
  3. Verlaag de perfusiedruk door aanpassing van de manometer totdat het bloed (zoals aangegevendoor het dier rode bloedcellen) wordt terug getrokken in de perfusie segment; Dit bepaalt de balans druk waarbij de erytrocyten voorzichtig oscilleren in het lumen van het vat en meet de hydrostatische microvaatje druk (Pc) aan het distale uiteinde van het microvaatje segment. Onderhouden schip perfusie bij elke druk boven deze balans druk.

7. Microocclusion en verzameling van gegevens

  1. Optionele stap: Voor het gebruik van de micro-occluder om het schip te blokkeren, druk in het weefsel in een niet-gebruikte gedeelte van mesenterium ver van een schip, zodat de punt accumuleert een boete pad van weefsel dat de experimentele vaartuig beschermt tijdens herhaalde micro- afsluitingen.
  2. Plaats de blocker boven de geperfuseerde vat nabij de onderrand van het veld microscoop.
  3. Noteer de volgende met video en audio.
    1. Verbaal noteer de locatie van de blokkadelocatie en onderste schermrand zoals op het oculair reticule.
    2. Met de puntvan de blocker geplaatst boven het microvaatje, met de fijne z controle van de micromanipulator voorzichtig lager de blocker totdat de stroming in het vat is afgesloten. Let op de manometer druk (Pc) met audio. Solliciteer occlusie meestal voor 3-10 seconden, en dan los, het herstel van gratis perfusie. Verplaats de blokkadelocatie het vaartuig naar de pipetpunt in 5-10 micrometer stappen basis van tijd (> 5 min na de initiële blok op een plaats), het aantal occlusies (3-5), om vaatwand schade aan de blokkadelocatie voorkomen .

8. Analyse van de gegevens en de meting van L p (waterdoorlaatbaarheid)

  1. Tijdens het afspelen, bepalen de beginafstand (ℓ 0) een marker rode cel om de occlusie plaats door toepassing van een beeld van een micrometer en de bekende posities van de afbeeldingen. Bepaal de beginsnelheid (dl / dt) van de marker cel van haar positie in een aantal frames tijdens de 3-10 seconden van de opgenomen beelden. Afschrikkenmine vat de straal (r) van de beelden genomen tijdens occlusie (figuur 3).
  2. Bereken J v / S voor elke occlusie als (dl / dt) x (1 / ℓ 0) x (r / 2). Bereken Lp bij een constante druk (J v / S) gedeeld door de aandrijvende druk (microvaatje druk - effectieve colloïd osmotische druk; zie bespreking).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 4 toont de resultaten van het meten van het tijdsverloop van veranderingen in Lp in een rat venulaire microvaatje achtereenvolgens canule met vier perfusates. 33 De omvang van Lp berekend bij een constante druk werd gebruikt als een maat voor veranderingen in microvaatje permeabiliteit, eerste in de controle staat van een perfusievloeistof met 1% runderserumalbumine toen het vat werd blootgesteld aan het ontstekingsmiddel bradykinine (Bk) met een tweede micropipet...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Details van Lp berekeningen. Hoewel transvasculaire vloeistofbeweging optreedt terwijl het vaartuig vrij geperfundeerd, die uitwisseling veel te klein om te worden gemeten tijdens vrije perfusie omdat het meestal minder dan 0,01% van het vaartuig perfusiesnelheid. Wanneer echter perfusie transiënt wordt gestopt door afsluiten van het microvaatje, transvasculaire stroom (dwz filtratie) wordt gemeten door de beweging van marker rode cellen in het lumen de vloeistofkolom tussen een marker rode ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies HL44485 en HL28607.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MICROSCOPE, TABELLE EN STAGE
invers microscoop (metallurgisch type) met trinocular hoofd voor video: voorbeeldOlympusCK-40probeer de oculairen hoger ten opzichte van de stage te plaatsen--je moet door de oculairen kijken terwijl je rond de bovenkant van de stage reikt over de tussenliggende micromanipulatoren
invers microscoop (metallurgisch type) met trinocular hoofd voor video: voorbeeldLeicaDMILprobeer de oculairen hoger ten opzichte van de stage te plaatsen--je moet door de oculairen kijken terwijl je rond de bovenkant van de stage reikt over de tussenliggende micromanipulatoren
objectief met smalle diameter, lange werkafstand: voorbeeldNikonNikon E Plan 10×/0.25 LWD
stageplatform--1/2 inch of 1 cm plaatstaallaswerkplaatsdit moet zwaar zijn om trillingen te verminderen
Unislide x-y tafel: duivenstaart glijbanenVelmexAXY4006W1
VIDEO
CCD videocamera: voorbeeldPulnixTM-7CN (niet langer beschikbaar)geen kleur nodig
video-opnamesysteem met audio--generiek
video-afspeelsysteem (volledig stilstaand frame, enkele framebeweging)
kleine microfoon
MICROMANIPULATORS, HOUDERS
micromanipulator, XYZ (3)Prior/Stoelting (niet langer beschikbaar)zoek naar fijne Z en groter bereik van reizen in grove aandrijvingen voor gemakkelijke positionering
hydraulische sondeaandrijving, één wegFHC50-12-1Cmoet een handmatige aandrijving of elektronische aandrijving kopen
manuele trommelaandrijving FHC50-12-9-02
of hydraulische aandrijving, 3-wegSiskiyou CorporationMX610 (1-weg) of MX630 (3-weg)geweldig voor korte armen, gevuld met water en moet elke 2 jaar worden teruggestuurd om te worden bijgevuld
connectoren/stang/houdersSiskiyou CorporationMXC-2.5, MXB etc.
pin visStarrett162Com de begrenzer vast te houden
pipethouderWorld Prescision InstrumentsMPH3
watermanometer ~120 cm
MICROSCOPEN SCHEIDISCH
helder Plexiglas voor microscoop schaal voor dier
3/4 inch gepolijste kwarts schijf ~1/4 inch hoogQuartz Scientific Inc.custom (of gepolijst plexiglas, glas); zorg ervoor dat de hoogte minder is dan de werkafstand van het objectief
Plexiglas lijm (Weld-on 4: VOORZICHTIG CARCINOGEN)
medisch lijm voor weefselputjeNuSilMED-1037
All-purpose siliconen rubber hittemat, 5" L x 2" WCole ParmerEW-03125-20verwarmer voor microscoop schaal--heeft snoer en controller nodig--240V versie beschikbaar
Netvoedingsadapter voor Kapton Heaters en Kits, 6 ft, 120 VACCole ParmerEW-03122-75
STACO 3PN1010B Variabel-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V UitCole ParmerEW-01575-00
PIPET MAKERIJ
verticale pipet pullerSutter Instrument CompanyP-30 met nichrome gloeidraad
1.5 mm OD dunne wand capillaire buisSutter Instrument CompanyB150-110-10
pipet grinder luchtsteen en dissectiemicroscoop--zie referentie in tekstof koop een pakket van Sutter Instruments of World Precision Instruments
RX Honing Machine, System IIRX Honing Machine CorporationMAC-10700 Rx System II Machinealternatief voor luchtsteen, gebruik met een dissectiemicroscoop onder een hoek gemonteerd
   met keramische slijpschijfRX Honing Machine Corporationgebruik "zoals het is" of bevestig slijpfilm
slijpfilm vellen, 0.3 of 0.5 um3Monderdeelnr. 051144 80827268X Imperial slijpfilm vellen met zelfklevende achterkant--kan worden gekocht bij Amazon

Referenties

  1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
  2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
  4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
  5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
  6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
  7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
  8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
  9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
  10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
  11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
  12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
  14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
  15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
  16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
  17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
  18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
  19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
  20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
  21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
  22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
  23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
  24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
  25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
  26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
  27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
  28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
  29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
  30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
  31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
  32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
  34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
  35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
  36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
  37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
  38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
  39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
  40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
  41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
  42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
  43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hydraulische geleidbaarheidintravitale microscopiemicro occlusiemethodetransvasculaire vloeistofuitwisselingcontrole van perfusaatsamenstellinghydraulisch aandrijfsysteemgenetisch gemodificeerde ratten

Gerelateerde artikelen