Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Samenvatting

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Samenvatting

Mitochondria van skeletspieren spelen een specifieke rol in veel ziektepathologieën. Daarom is de meting van zuurstofverbruik als indicator van mitochondriale functie in dit weefsel steeds vaker gebruikelijk geworden. Hoewel er veel technologieën en tests bestaan die mitochondriale ademhalingsroutes meten in verschillende cellen, weefsels en soorten, is er momenteel een hiaat in de literatuur met betrekking tot de compilatie van deze tests met behulp van geïsoleerde mitochondria uit muisskeletspier voor gebruik in microplaat-gebaseerde technologieën. Belangrijk is dat het gebruik van microplaat-gebaseerde respirometrische tests groeit onder mitochondriale biologen omdat het met minimale hoeveelheden geïsoleerde mitochondria hoge doorvoermetingen mogelijk maakt. Daarom werd een verzameling microplaat-gebaseerde respirometrische tests ontwikkeld die mechanistische veranderingen/aanpassingen in zuurstofverbruik kunnen beoordelen in een veelgebruikt diermodel. De hier gepresenteerde methoden geven stap-voor-stap instructies om deze tests uit te voeren met een optimale hoeveelheid mitochondriaal eiwit en reagentia, en met hoge precisie zoals blijkt uit de minimale variantie over het dynamische bereik van elke test.

Inleiding

De belangrijkste fysiologische rol van skeletspieren mitochondriën is om ATP te produceren tegen oxidatieve fosforylering ^1. Belangrijker nog, skeletspieren mitochondriën een specifieke rol spelen in de inspanningscapaciteit ^2, veroudering ^3, degeneratieve ziekte ^{4 en} type II diabetes ^5. Als een vergrijzende samenleving, en type II diabetes zijn de ^7e belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten ^6, is de behoefte aan methoden die de mitochondriale functie te evalueren steeds vaker in het biomedisch onderzoek ^7,8 geworden. Met name de meting van het zuurstofverbruik heeft uitzonderlijk nut bij de beoordeling van de mitochondriale functie, omdat het vertegenwoordigt de gecoördineerde functie tussen mitochondriale en nucleaire genomen om functionele componenten van oxidatieve fosforylering ⁹ te drukken.

Verschillende technologieën bestaan ​​die het mogelijk maken de meting van het zuurstofverbruik in intacte cellen en isolerend mitochondriën ^7-10. Verder zijn assays ontwikkeld voor meerdere celtypes en weefsels, en in een aantal soorten die het mogelijk maken de meting van mitochondriale pathways en respiratoire control ^9,11,12. Er is echter momenteel een leegte in de literatuur met betrekking tot de samenstelling van al deze assays gebruikt mitochondriën geïsoleerd uit muizen skeletspieren voor gebruik in microplaat zuurstofverbruik technologieën. Belangrijker nog, het gebruik van microplaat respirometrische assays groeit onder mitochondriale biologen en zorgt voor een high throughput metingen met behulp van minimale hoeveelheden van geïsoleerde mitochondria ^9. Daarom is een verzameling microplaat respirometrische assays ontwikkeld waarmee aanwijzen waar afwijkingen en / of aanpassingen kunnen voorkomen in de elektronentransportketen (ETC). Daarnaast werden twee extra microplaat respirometrische assays ontwikkeld dat de beoordeling van de coördinatie betwee staatn de tricarbonzuur (TCA) cyclus en ETC en tussen ß-oxidatie en de ETC. Belangrijk is dat de gepresenteerde methoden zorgen voor een duidelijke en beknopte manier om mechanistische veranderingen in de mitochondriale functie in een veel gebruikte diermodel meten.

Protocol

NB: Dit protocol begint na één is geïsoleerd mitochondriën van rood skeletspieren. Mitochondriën werden geïsoleerd zoals eerder beschreven van ~ 75 - 100 mg rode skeletspier ^13. Tussen 5 - 10 ug / ul van mitochondriaal eiwit van deze hoeveelheid weefsel wordt bereikt door resuspenderen de laatste mitochondriale pellet in ≤50 ui isolatiebuffer van mitochondria (IBM) 2 (zie Frisard et al ^13).

1. Setup

1. Bereid werkvoorraad oplossing (Tabel 1) en mitochondriale test oplossing (MAS) mengsels (tabel 2) voor de volgende assays.
   Opmerking: De meeste van de voorbereiding van de testen kan tevoren als de meeste bestanden oplossingen en MAS kunnen worden opgeslagen.
2. Hydrateren een respirometrische Testcassette in 1 ml ijkoplossing de nacht vóór het experiment in een _niet-CO2 incubator bij 37 ° C.
3. De dag van het experiment, take uit bevroren voorraden (substraten en mitochondriale modulators, MAS mix, MAS w / o BSA, tabel 1) en dooi in 37 ° C bad of incubator.
4. Bereid alle substraatoplossingen (Tabel 3) en injecties (Tabel 4-5) en pas pH wens (pH 7,4). Nadat de pH, slaan op ijs.
5. Programmeer de multiwell-zuurstofverbruik meetmachine de juiste mix, wacht en meet parameters (zie tabel 6) en labelachtergrond groep en / conditie putjes door eerst de analysesoftware, gevolgd door de "Standard" mode.
   1. Voer in de "Guest" forum en klik op de "Assay Wizard". Eenmaal in de "Test Wizard", klik op "Protocol" te mix te veranderen, wacht, en meet parameters. Label de achtergrond putten onder de "Back. Correctie "tab en zorg ervoor om" Do achtergrond correctie ".
   2. Etiket conditions door eerst te klikken op de tab "Groups & Labels", gevolgd door de "Groep Info" tab. Nadat deze parameters zijn ingevoerd, klikt u op "End", gevolgd door "Template Opslaan".

2. Assay Run

1. Laad de injectieoplossingen in een test run cartridge en start de kalibratie door eerst de analysesoftware, gevolgd door invoeren van de "Standard" mode. Voer in de "Guest" forum. Open de sjabloon opgeslagen in stap 1.5 onder de "XF" drive, onder het tabblad "Sjablonen". Eenmaal geopend, klikt u op "Start" om de kalibratie te beginnen.
   Opmerking: De test run cartridge moet in de machine met de getande hoek naar de linkerbenedenhoek worden ingevoerd. Dit duurt ongeveer 30 minuten. Zorg om oplossingen te injecteren in de juiste poorten. Injecties in tabel 4-5 zijn opgenomen in de volgorde van het laden.
2. Zacht, maar grondig de mitochond mixria voorraad door roeren van de oplossing met 200 ul pipetpunt, gevolgd door voorzichtig wrijven de voorraad met een 200 ul pipetpunt dat de opening verbreed door snijden ~ 3 mm van het uiteinde van de tip met een schaar heeft gehad.
3. Voer een bicinchoninezuur (BCA) assay voor de eiwitconcentratie van het mitochondriale voorraad te bepalen.
4. De voorraadconcentratie verkregen uit stap 2.3, resuspendeer 10 ug mitochondriale eiwit / 200 ul van de succinaat / rotenon substraatmengsel (Tabel 3). Resuspendeer 14 ug mitochondriale eiwit / 200 ul van het resterende substraat mengsels (Dit moet voor elk substraat mix) (Tabel 3). Plaats alle mitochondriale eiwit / substraat mengsels op ijs.
   Opmerking: De optimale hoeveelheid mitochondriaal eiwit per putje voor elke test werd bepaald zoals eerder beschreven ^9. Er werd vastgesteld dat de pyruvaat / malaat, palmitoyl carnitine / malaat, glutamaat / malaat eend elektronenstroom assays maakt gebruik van 3,5 ug van mitochondriale eiwit, terwijl de succinaat / rotenone test maakt gebruik van 2,5 ug van mitochondriale eiwit per putje. Daarom moet de onderzoeker moet voldoende mitochondriale eiwitten te resuspenderen 4 repliceert in deze stap, omdat ofwel 2,5 ug of 3,5 ug per 50 ul per putje wordt geplaatst (zie stap 2,6).
5. Meng de mitochondriën / substraatoplossingen voorzichtig, maar grondig door roeren van de oplossing met een 200 ul pipet tip, gevolgd door voorzichtig tritureren de voorraad met een 200 ul pipet tip die tot 3 mm van het einde heeft afgesneden.
6. Plaats een celkweek plaat op ijs in drievoud belasting 50 gl / putje van elk van de mitochondria / substraat mixen. De ontwikkelaars van de microplaat respirometrische test raden het verlaten van een minimum van twee lege (geen mitochondriën) putten, bij voorkeur aan beide zijden op de celkweek plaat.
7. Draai de celkweek plaat bij 2000 g gedurende 20 min bij 4 ° C. Terwijl de plaat is spinning, warmen de substraat oplossingen in een 37 ° C waterbad.
8. Nadat de ronde is voltooid, zorgvuldig laden 450 pi van elke substraatoplossing bovenop zijn respectieve putjes (dwz, laadt de pyruvaat / malaat substraat aan de putjes die mitochondria aanvankelijk geresuspendeerd in deze substraatoplossing hebben). Zorg ervoor dat de plaat te laden bij kamertemperatuur. Opmerking: De lege putjes geladen met 500 pl substraat. Blanco putjes die voor de elektronenstroom bepaling worden geladen met de elektronenstroom substraat (Pyruvaat / malaat + FCCP), terwijl de gekoppelde assayblanco putjes kunnen worden beladen met de koppeling assay substraat.
   Opmerking: Als het uitvoeren van de gekoppelde en elektronenstroom assays op dezelfde plaat, moet de onderzoeker achtergrond putten toewijzen aan de respectieve testen na de test run is voltooid met de "XF Reader" platform via de tab "Instrument". Eenmaal binnen de instelling "Instrument", klik op de "Administratie"tab, gevolgd door "Achtergrond Correction". Hit "End Instrument Setup" als voltooid. Dit is omdat de combinatie van ascorbaat / TMPD O _2, waardoor een aparte achtergrondcorrectie nodig is voor elk type assay kan consumeren.
9. Na 450 pl substraat toegevoegd aan elk putje, bekijk de laag van mitochondriën in de put te zorgen voor de mitochondriën gelijkmatig gedispergeerd in een monolaag (20x vergroting [zie Rogers ⁹ Figuur 4]). Wells die niet op een gelijkmatig verdeelde monolaag moeten worden verwijderd post hoc.
10. Na het inchecken voor mitochondriële therapietrouw, steek de microplaat in de respirometrische test instrument en start de test gerund door te klikken op "OK".
    Opmerking: De kalibratie van stap 2.1 moet volledig zijn voordat de run begint. Zodra de onderzoeker klikt op "OK", zal de machine het nut plaat die werd gebruikt voor de kalibratie uit te werpen.
    1. Verwijder het nut bord en leg de celcultuur plaat die de mitochondriën op de lade bevat. De blauwe inkeping op de celkweek plaat moet in de linkerbenedenhoek van de lade worden geplaatst. Klik op "verder" om de test run te starten.
11. Na de run is voltooid, verwijdert u de celcultuur plaat en de cartridge door op de "Eject" op het scherm.
    1. Zodra de plaat wordt uitgeworpen, te verwijderen en gooi de celkweek plaat en de cartridge en klik op "Doorgaan" op het scherm. De run wordt automatisch opgeslagen als een .xls-bestand in het bestand "Data".
12. Open dit bestand en de weergave van "O2" om "OCR" te wijzigen door op de pijl omlaag onder de "Y1:" marker.
    1. Volgende verandering "Middle Point" naar "Point-to-Point Tarieven" onder de "Rate gegevens weergegeven als:" optie. Klik op "OK" om deze wijzigingen toe te passen.
13. Klik op het tabblad "Nou Group Mode" op linksonder in het scherm om de groep putten van vergelijkbare omstandigheden samen. Tot slot, klik op de "steekproefgemiddelde / Standard Error" tab naar het midden van het scherm naar links. Als alternatief kunnen deze opdrachten worden ingesteld voordat de test begint in de instelling "Assay Wizard".
    Opmerking: Elke voorwaarde zal een gemiddelde ± standaarddeviatie weergegeven voor elk tarief en elke conditie hebben. Er zijn rate metingen per conditie (State 2 [Koppeling] / State3u [Electron Flow] ademhaling gevolgd door vier injecties). Gebruik het gemiddelde van de State 2 snelheid van de tweede meting, bepalen de Staat 4o op het minimum punt na oligomycin injectie de maximale punt van State 3 en staat 3u na respectievelijk ADP en FCCP injectie, en gebruik het minimum voor Antimycin A geïnduceerde ademhaling van de koppeling Testen. Gebruik de maximale voor pyruvaat / malaat geïnduceerde Staat 3u ademhaling, gebruik maken van de minimalevoor rotenone geïnduceerde ademhaling, gebruik dan de maximale voor succinaat geïnduceerde State 3u ademhaling, en gebruik het minimum voor Antimycin A geïnduceerde ademhaling van de Electron Flow test. Alle experimenten werden 3 keer uitgevoerd en de getoonde data zijn de resultaten van een representatieve tracing.

Resultaten

Figuur 1 zuurstofverbruik (OCR) voor de pyruvaat / malaat, succinaat / rotenone, palmitoyl carnitine / malaat, en glutamaat / malaat assays (Coupling Assays). Deze assay traces worden als Zuurstofverbruik Rate OCR, tegen de tijd zijn achtergrond correceted en worden weergegeven als point-to-point tarieven. Elk paneel vertegenwoordigt zuurstofverbruik in verschillende mitochondriale toestanden zoals beschreven door Chance en Williams ^14. Het eerste paneel vertegenwoordigt basale zuurstofverbruik of State 2. De tweede paneel, na injectie van ADP, vertegenwoordigt maximale gekoppeld ademhaling, of State 3. Het derde paneel, na injectie van oligomycin A (een remmer van Complex V), vertegenwoordigt de ademhaling als gevolg proton lek, of State 4o. Het vierde paneel, na injectie van FCCP vertegenwoordigt maximale ontkoppeld ademhaling of State 3u. Tenslotte, het vijfde paneel, na injectie van Antimycin A vertegenwoordigt de remming van oxidatieve respiratie. Met name, all mitochondriale staten hebben minimale standaarddeviatie. Dit komt door grondig mengen van mitochondriale voorraad en mitochondria / substraat mixen en het bereiken van een monolaag van mitochondria na de hechting centrifugeren (stap 2,6). Anderzijds, loading ongelijke mitochondriën in elk putje en niet bereiken van een monolaag van mitochondriën in de put van de microplaat leidt tot grotere standaardafwijking in elke staat zoals weergegeven in figuur 2.

De traces in figuur 1 scherm plateaus voor elke mitochondriale staat en voor elke ondergrond. Het plateau bereikt na twee meetcycli suggereert mitochondriale goede kwaliteit en de mitochondriën gehecht blijven aan de bron gedurende de gehele duur van de test. Bovendien kan het bereiken van een plateau maximale tarieven wenselijker omdat dit stelt de onderzoeker de gemiddelde OCR nemen deze mitochondriale toestanden, waardoor vertekening die kunnen optreden verminderendoor het willekeurig selecteren van een punt.

De hoeveelheid mitochondriën per putje werd bepaald door optimalisatie studies. De optimale hoeveelheid mitochondriën per putje zou resulteren in State 2 weer tussen 100-200 pmol / min / well en state 3 prijzen <1,500 pmol / min / well, aangezien deze waarden liggen binnen de zuurstof sensor dynamisch bereik van de multiwell-zuurstof verbruik meetmachine. Laden met teveel mitochondriaal eiwit per putje kan tot OCRs buiten het dynamische bereik van het instrument (Figuur 3A). Figuur 3 toont loading 3,5 ug mitochondriaal eiwit per putje (blauw tracing) vergeleken met laden 2,5 ug mitochondriaal eiwit per putje (red tracing) voor de succinaat / rotenone assay. Laden met teveel mitochondriaal eiwit per putje kan ook leiden tot uitputting van zuurstof in de microkamer van de put, waardoor accurate meting van OCR voorkomen voor elke volgende meting ⁹ (figuur 3B </ strong>). Point-to-point OCR de momentane snelheid van verandering van de OCR. Als vlak, de OCR is stabiel / stabiel, maar als het verminderen, dan kan er een biologische of technische kwestie. De scherpe daling van OCR in State 3 en staat 3u ademhaling (figuur 3A) wordt veroorzaakt door uitputting van mitochondria de zuurstoftoevoer voor het einde van de meting (figuur 3B).

Figuur 4 geeft OCR versus tijd voor de elektronenstroom assay. De tracering wordt gecorrigeerd en weergegeven zoals beschreven voor Figuur 1. Het eerste paneel in deze test vertegenwoordigt Staat 3u beademing op pyruvaat / malaat via Complex I. De tweede paneel, na injectie van rotenon, vertegenwoordigt remming van Complex I gemedieerde ademhaling. Het derde paneel, na injectie van succinaat, vertegenwoordigt substraat gestimuleerd Staat 3u met elektronen het invoeren van de ETC op Complex II (Complex II gemedieerde ademhaling). Het vierde paneel, na injectie van Antimycin A, vertegenwoordigt de remming van complexe III en dus totaal ademhaling. Tenslotte, het vijfde paneel, na injectie van ascorbaat / TMPD vertegenwoordigt Complex IV gemedieerde ademhaling. Net als het doordrukken in figuur 1, alle mitochondriale staten minimale standaardafwijking, en elk tarief of bijna heeft een plateau bereikt.

Figuur 1. Koppeling assays. (A) 10 mM pyruvaat / 5 mM malaat, (B) 10 mM succinaat / 2 uM rotenon, (C) 40 uM palmitoyl carnitine / 1 mM malaat, en (D) 10 mM glutamaat / 10 mM malaat gekoppeld mitochondriale ademhaling test tracings zoals bepaald door multi-well meting van het zuurstofverbruik. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Mitochondriale eiwit per putje geladen was 3,5 ug voor alle testen behalve succinaat / rotenon, waarvan 2,5 ug van mitochondriale eiwit per putje gebruikt. Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische herhalingen. OCR = Zuurstof verbruik; ADP = adenosinedifosfaat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide 4 - (trifluormethoxy) fenylhydrazon; Anti-A = A Antimycin; PYR = Pyruvate; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; PAL-C = palmitoyl carnitine; GLUT = glutamaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. zeer variabel Pyruvate / Malate Assay. Zeer variabele 10 mM pyruvaat / 5 mM malaat test veroorzaakt door onvolledig mengen mitochondriën van de mitochondriale voorraad in de ondergrond / MAS mix, hetgeen leidt tot een variabele mitochondriale proeiwit lading in elk putje. Mitochondriale eiwit per putje geladen was 3,5 ug. Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische herhalingen. OCR = Zuurstof verbruik; ADP = adenosinedifosfaat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide 4 - (trifluormethoxy) fenylhydrazon; Anti-A = A Antimycin; PYR = Pyruvate. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Overbelasting mitochondriaal eiwit voor de Succinate / Rotenon Assay. (A) Zuurstofverbruik tarieven buiten het dynamisch bereik van de multi-well zuurstofverbruik meetmachine veroorzaakt door het laden van 3,5 ug van mitochondriale eiwit per putje (blauw tracing) in vergelijking met het laden van 2,5 ug van mitochondriale eiwit per putje (rood tracing). (B ) Oxygen spanning naderen nul volgende ADP en FCCP injecties veroorzaakt door het laden van overmatige mitochondriaal eiwit (3,5 pg) per putje (blauw tracing) in vergelijking met het laden van een optimale hoeveelheid (2,5 pg) van mitochondriale eiwit per putje (rood tracing). Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische herhalingen per mitochondriale eiwit bedrag. OCR = Zuurstof verbruik; ADP = adenosinedifosfaat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide 4 - (trifluormethoxy) fenylhydrazon; Anti-A = A Antimycin; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; O ₂ = zuurstof; mm Hg = millimeter kwik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. elektronenstroom Assay. 5 mM pyruvaat / 1 mM malaat + 4 uM FCCP, electron flage mitochondriale ademhaling test tracing zoals bepaald door multi-well meting van het zuurstofverbruik. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Mitochondriale eiwit per putje geladen was 3,5 ug. Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische herhalingen. OCR = Zuurstof verbruik; Anti-A = A Antimycin; ASC = Ascorbate; TMPD = N, N, N ', N' -tetramethyl--p-fenyleendiamine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagens	Stock Concentratie	MW	Final Volume	Mass Toegevoegd	Opmerkingen / Omschrijving
	(M)	(g / mol)	(ml)	(g of ml)
EGTA, pH 7,2	0.1	380,35	100 ml 1 M Tris Base	3,801 g	Bewaren bij 4 ° C
HEPES	1	238,3	250 ml Dih 2 O	59. 57 g	Bewaren bij 4 ° C
MgCl2, hexahydraat	1	203,31	250 ml Dih 2 O	50,82 g	Bewaren bij 4 ° C
Pyruvaat pH 7,4	0.1	88,06 (Komt zo 14.11 M oplossing)	40 ml Dih 2 O	0,283 ml pyrodruivenzuur	Voeg 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C, vers maken tweewekelijks
Succinaat pH 7,4	0.5	118,09	100 ml Dih 2 O	9,4 g succinic zuur	Maak 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C
Malaat, pH 7,4	0.5	134,09	100 ml 95% ethanol	6,7 g appelzuur	Voeg 200 ul porties en bewaar bij -20 ° C
TMPD	0.01	164,25	10 ml	0,0164 g	Voeg 300 ul aliquots en bewaar bij -20 ° C; Meng met een equimolaire hoeveelheid ascorbaat tot TMPD houden verminderde
Palmitoyl L-carnitine chloride	0.01	436,07	1,14 ml van 95% ethanol	0,005 g	Voeg 40 ul porties en bewaar bij -20 ° C
Oligomycin A	0,006	791,06	0,987 ml van 95% ethanol	0,005 g	Voeg 20 ul porties en bewaar bij -20 ° C
FCCP	0.01	254,17	3,9 ml 95% ethanol	0,01 g	Voeg 40 ul porties en bewaar bij -20 ° C
Rotenone	0.001	394,4	10 ml 95% ethanol	0,0039 g	Bewaren bij -20 ° C
Antimycin A	0,005	548,63	9,12 ml van 95% ethanol	0,025 g	Bewaren bij -20 ° C
K + ADP	0.5	501,32	3,9 ml Dih 2 O	1,0 g	Bewaren bij -20 ° C
Appelzuur, pH 7,4	0.5	134,09	40 ml	2,68 g	Voeg 200 ul porties en bewaar bij -20 ° C

Tabel 1. Stock Solutions

Reagens	Stock Concentratie	Mass Toegevoegd	Final Molarity / Procent
	(M)	(g of ml)
Sucrose	-	11,98 g	70 mM
Mannitol	-	20,04 g	220 mm
Kalium monobasisch	-	0,34 g	5 mM
MgCl2, hexahydraat	1	2,5 ml	5 mM
HEPES	1	1,0 ml	2 mM
EGTA	0.1	5,0 ml	1 mM
Wezen Fatty Acid Free-BSA	-	1,0 g	0,20%

. Tabel 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: 25 ml Aliquot en bewaar bij -20 ° C * Opmerking: Uitsluiten BSA voor MAS mix gebruikt voor de test injecties.

Substraat Medium	Eindconcentratie	Hoeveelheid voorraad (pl)	Bedrag van MAS * (ml)
Pyruvaat / Malate	10 mM / 5 mM	Pyruvaat: 1000	9
		Malaat: 100
Succicinate / Rotenon	10 mM / 2 pM	Succinate: 200	10
		Rotenone 20
* Pyruvaat / Malate + FCCP	5 mM / 1 mM / 4 pM	Pyruvaat: 500	10
		FCCP: 4
		Malaat: 20
Palmitoyl L-carnitine / Malate	40 uM / 1 mM	Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20	10
Glutamaat / Malate	10 mM / 10 mM	Glutamaat: 400	10
		Malaat: 200

Tabel 3. Substraat Solutions pH 7,4: Voeg vers de dag van het experiment. * Elektronenstroom testoplossing.

Injectie Medium	Concentratie	Hoeveelheid voorraad (pl)	Bedrag van MAS (ml)	Hoeveelheid ingespoten in Cartridge	Eindconcentratie
					(Na injectie in de plaat)
ADP	50 mM	300 gl	3	50 gl	5,0 mm
Oligomycin A	20 pM	10 gl	3	55 ul	2,0 uM
FCCP	40 uM	12 ul	3	60 ul	4,0 uM
Antimycin A	40 uM	24 ul	3	65 ul	4,0 uM

Tstaat 4. Injecties voor Gekoppeld Testen pH 7,4. Maak fris de dag van het experiment. * Koppeling testen omvatten (maar zijn niet beperkt tot) pyruvaat / malaat, succinaat / rotenon, palmitoyl carnitine / malaat en glutamaat / malaat.

Injectie Medium	Concentratie	Hoeveelheid voorraad (g of UL)	Bedrag van MAS (ml)	Hoeveelheid ingespoten in Cartridge	Uiteindelijke concentratie (Na geïnjecteerd in de plaat)
Rotenone	20 pM	60 ul	3	50 gl	2,0 uM
Succinate	50 mM	300 gl	3	55 ul	5,0 mm
Antimycin A	40 uM	24 μ; l	3	60 ul	4,0 uM
TMPD / Ascorabte	1 mM, 100 mM	TMPD: 300 gl	3	65 ul	100 pM, 10 mM
		Ascorbate: 0,059 g

Tabel 5. Injecties voor elektronenstroom Assay pH 7,4. Voeg vers de dag van het experiment

Bevel	Tijd (min)	# Cycli
Kalibreren
Wacht	10 min (om de plaat op te warmen van therapietrouw stap)
Mengen	1 minuut	2
Mijasure	2 min
Injecteren A
Mengen	1 minuut	2
Maatregel	2 min
Injecteren B
Mengen	1 minuut	2
Maatregel	2 min
Injecteren C
Mengen	1 minuut	2
Maatregel	2 min
Injecteren D
Mengen	1 minuut	2
Maatregel	2 min

Tabel 6. Instrument Run Protocol.

Discussie

De informatie in dit artikel methoden bieden stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van een verzameling van microplaat respirometrische testen met behulp van mitochondriën geïsoleerd 75-100 mg muis skeletspieren. Deze assays kunnen worden uitgevoerd met een hoge nauwkeurigheid zoals blijkt uit de nauwe standaardafwijking tussen drievoudige putjes. Belangrijk is dat deze respirometrische assays toelaten lokaliseren waar afwijkingen en / of aanpassingen kunnen voorkomen in de ETC, TCA cyclus, β-oxidatie route substraat transporters, etc. Het is gebruikelijk diermodel.

Het is belangrijk de rationale voor het gebruik van verschillende brandstoffen en inhibitoren gebruikt in dit protocol te markeren. Het pyruvaat / malaat en glutamaat / malaat respirometrische assays mogelijk maken de beoordeling van Complex I gemedieerde ademhaling, evenals de beoordeling van de respectieve transporteurs, en in het geval van glutamaat, de deaminase ^15. Als alternatief kan de combinatie vansuccinaat / rotenone laat de beoordeling van mitochondriale respiratoire flux door Complex II van de ETC sinds rotenone remt complex I en succinaat biedt elektronen Complex II via de vermindering van flavineadeninedinucleotide (FADH ₂₎ ^15. Deze testen geven substraat specifieke informatie over koppelingsefficiëntie en maximaal ademhaling. De elektronenstroom test is uniek doordat de combinatie van substraten en remmers maakt de beoordeling van meerdere complexen in mitochondriale respiratoire flux ^9. De aanvankelijke substraat mix van pyruvaat / malaat + FCCP maakt de evaluatie van de maximale ademhaling aangedreven door Complex I, terwijl de injectie van rotenon gevolgd door succinaat maakt de beoordeling maximale ademhaling aangedreven door Complex II. De injectie van Antimycin A, een remmer van complex III, gevolgd door de injectie van ascorbaat / TMPD kan de voor de evaluatie van de ademhaling veroorzaakt door Complex IV aangezien de Ascorbaat / TMPD eenelektron donor van cytochroom C / Complex IV. Hoewel geen informaties over koppelrendement wordt verkregen, is de werkwijze geschikt voor zeer kleine monsters te beletten dat het uitvoeren van meerdere substraten onafhankelijk. Tenslotte, het gebruik van palmitoyl carnitine / malaat maakt de beoordeling van de coördinatie tussen β-oxidatie en de ETC omdat de reducerende equivalente geproduceerd door de oxidatie van palmitinezuur (β-oxidatie) meegenomen in de ETC via de electron flavoproteïne ¹⁵ overdragen. Opgemerkt wordt dat de koppeling en elektronenstroom assays ook kunnen worden gebruikt in combinatie met veranderingen in de mitochondriale functie te identificeren vanwege enkele interventie (behandeling met geneesmiddelen, genetische manipulatie).

De hoge nauwkeurigheid bereikt bij deze testen is voornamelijk het gevolg van grondig mengen van mitochondria, of het vóór eiwitbepaling, of met het substraat oplossingen. Langs deze lijnen, zodra de mitochondria is resuspendend in het substraat solutions, is het essentieel om deze oplossing grondig vóór het laden van de celkweek plaat zoals beschreven in stap 2.2 met een verbrede opening pipetpunt mengen. Als de mitochondriën meng leidt tot grote variatie binnen de assay. Bovendien, met een smalle opening pipetpunt wordt afschuifkrachten creëren tijdens het mengen van de mitochondriën en verhoogt het potentieel om de mitochondriale membranen en afgifte van cytochroom C. De hechting trap (2,7) is een kritische stap in het protocol beschadigen. Verzuim om de beladen celkweekplaat lang / snel genoeg draaien zal resulteren in een onvolledige naleving van de mitochondriën naar de bron, hetgeen leidt toegenomen variabiliteit tussen putten en metingen.

Is geoptimaliseerd de beschreven protocol op te nemen: het laden van een optimale hoeveelheid van mitochondriaal eiwit per putje, met behulp van de juiste concentraties / bereidingswijzen om de balans en de ondergrond oplossingen te maken, het veranderen van de test run om mitochondriale staat pla zorgenteaus en passende vermenging van de mitochondriale voorraad en mitochondriale / substraat mixen. Voorafgaand aan deze optimalisatie inspanningen, de auteurs aangetroffen valkuilen in de test run. De volgende bespreekt methoden / wijzigingen die nuttig zijn bij het optimaliseren van dit protocol waren het oplossen van problemen. Met betrekking tot een optimale belading, zal het laden te weinig mitochondria niet ontlokken een robuuste reactie, tijdens het laden te veel mitochondriën zal de zuurstof uitlaat binnen de microkamer en leiden tot onnauwkeurige metingen. Rogers et al ⁹ geeft voorbeelden van het bepalen van de optimale belading hoeveelheden mitochondriën per goed voor microplaat respirometrische assays. Vaker, is te veel mitochondriën per geladen en, zoals blijkt uit de staat 2 tarieven meer dan 100-200 pmol / min / goed en de toestand 3 tarieven> 1500 pmol / min / goed. Als over lading optreedt, voert een experiment met verschillende concentraties van mitochondriale eiwit (bijvoorbeeld tussen 1 -. 10 ug) tot OCRs lokken binnen de dynamische range van het zuurstofverbruik meetmachine. De voorbereiding en het gebruik van de juiste concentraties van substraten en de voorraden is van het allergrootste belang. Gebruik altijd de zure vorm van substraten / injecties en de pH met kalium hydroxide of HCl; natrium buffers / oplossingen worden niet aanbevolen. Daarnaast resuspenderen substraten / voorraden in DMSO of 100% ethanol zal resulteren in de meting storing of fout. Zorg ervoor dat u 95% ethanol te gebruiken indien aangegeven. Het is gebruikelijk palmitoyl carnitine neerslaan van de 95% ethanol na het ontdooien van de bevroren voorraad, waardoor grote variabiliteit. Zorg ervoor dat u op te warmen de palmitoyl carnitine voorraad en vortex goed voor gebruik. Bovendien kan een zeer variabele pyruvaat / malaat testresultaat vanwege het pyruvaat stock wezen> 2 weken oud. Zorg ervoor dat bevroren monsters van pyruvaat om de 2 weken remake. De test run werd gewijzigd om 2-min metingen om mitochondriale staat plateaus zorgen. Als observatie van uitputting van ADP gewenst is, kan de onderzoekerverlenging van de meettijd onder het tabblad "Protocol" in het "Test Wizard" forum. Tot slot, grote variabiliteit treedt op wanneer de mitochondriale voorraad en mitochondriën plus substraatoplossingen niet volledig vóór het laden gehomogeniseerd. Als variabiliteit tussen de putten is hoog na de test run, moet u de substraat oplossing volledig te mengen voorafgaand aan het volgende experiment. Vortex nooit de mitochondriën / substraat oplossingen, in plaats van roer, puree, en voorzichtig vermaal met een verbrede opening pipetpunt.

Er zijn enkele beperkingen van deze techniek die het vermelden waard zijn. Ten eerste, het aantal putten op de celkweekplaat voor deze testen is relatief laag (bijv., 24 wells en minstens 2 aangewezen blanco wells). Indien het gewenst is om alle 5 van deze testen uit te voeren op een plaat, de onderzoeker slechts in staat om de antwoorden van één muis te onderzoeken tegelijk. Er moet echter worden opgemerkt dat 96 ook instrumenten beschikbaar voor higher throughput. Ten tweede zijn er inherente sterke en zwakke punten beoordelen mitochondriale dysfunctie in geïsoleerde mitochondriën in vergelijking met intacte cellen ^1. Enkele zwakke omvatten met minder fysiologische relevantie vergelijking met intacte cellen en induceren voorwerpen uit het isolatieproces. Tenslotte, het succes van deze werkwijze is afhankelijk van de kwaliteit van het mitochondriale isolatieproces.

Hoewel sommige van deze testen zijn ofwel ontwikkeld in verschillende systemen of gevalideerd in andere dierlijke modellen, de hierin gepresenteerde methoden zijn eerste alle bovengenoemde bepalingen synthetiseren voor optimaal gebruik in een multi-well zuurstofverbruik meetmachine met de muis skeletspier. Belangrijk al 5 deze assays kunnen worden uitgevoerd met de hoeveelheid mitochondriën geïsoleerd uit ~ 75 - 100 mg muis skeletspieren, waardoor hoge doorvoer met minimale materiaal. Van groot belang is het vermogen van multi-wellzuurstofverbruik technologieën assays met minimale hoeveelheden mitochondria, gecombineerd met een geoptimaliseerde isolatie werkwijze uit te voeren, kan de onderzoeker een veelheid van andere experimenten met de rest van skeletspierweefsel (bv., western blots uitgevoerd, RT-PCR, enzymatische assays, etc.), die vaak een strijd met dit diermodel.

Tot slot, de hier gepresenteerde methoden bieden stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van een verzameling van microplaat respirometrische assays met minimale hoeveelheden muis skeletspieren. Belangrijk is dat de gepresenteerde methoden vereisen minimale hoeveelheden weefsel en mitochondria. Eenmaal knie, zal de hierin beschreven technieken kunnen onderzoekers een mogelijk mechanisme van een verbinding of genproduct op mitochondriale zuurstofverbruik bepalen een veelgebruikte diermodel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903	Bewaar bij RT
D-Mannitol	Sigma Aldrich	63559	Bewaar bij RT
Kaliumfosfaat monobasicum, minimum 99,0%	Sigma Aldrich	P5379	Bewaar bij RT
Magnesiumchloride hexahydraat, ACS-reagens, 99,0-102,0%	Sigma Aldrich	M9272	Bewaar bij RT
HEPES minimaal 99,5% titratie	Sigma Aldrich	H3375	Bewaar bij RT
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	Bewaar bij RT
Essentially Fatty	Sigma Aldrich	A6003	Bewaar bij 4 °C
Acid Free- BSA
Pyruwzuur, 98%	Sigma Aldrich	107360	Bewaar bij 4 °C
Bernsteenzuur	Sigma Aldrich	S9512	Bewaar bij RT
L(-) Appelzuur, BioXtra, ≥95%	Sigma Aldrich	M6413	Bewaar bij RT
L-Glutaminzuur	Sigma Aldrich	G1251	Bewaar bij RT
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-fenyleendiamine	Sigma Aldrich	T7394	Bewaar bij RT
99%, poeder [TMPD]
Palmitoyl L-carnitine chloride	Sigma Aldrich	P1645	Bewaar bij -20 °C
Oligomycine A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Bewaar bij -20 °C
Carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)	Sigma Aldrich	C2920	Bewaar bij 2 - 8 °C
fenylhydrazone
≥98% (TLC), poeder [FCCP]
Antimycine A van streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Bewaar bij -20 °C
Adenosine 5′-difosfaat monokaliumzout dihydraat [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Bewaar bij -20 °C
Rotenon	Sigma Aldrich	R8875	Bewaar bij RT
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	N/A