Bestuderen van microbiële gemeenschappen In Vivo: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen Candida albicans En Pseudomonas aeruginosa In het Airways

Samenvatting

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Samenvatting

Bestuderen van gastheer-pathogeen interactie stelt ons in staat om de onderliggende mechanismen van de pathogeniciteit te begrijpen tijdens de microbiële besmetting. De prognose van de gastheer is afhankelijk van de betrokkenheid van een aangepaste immuunreactie tegen de pathogeen ^1. Immuunrespons is complex en de resultaten van de interactie van verschillende pathogenen en immune of niet-immune celtypes ^2. In vitro studies kunnen deze interacties te karakteriseren en gericht op mobiele-pathogeen interacties. Bovendien is in de luchtweg ^3, vooral bij patiënten met etterige chronische longziekte of kunstmatig beademde patiënten, polymicrobiële gemeenschappen aanwezig compliceren gastheer-pathogeen interactie. Pseudomonas aeruginosa en Candida albicans beide problemen pathogenen ⁴ vaak geïsoleerd uit tracheobronchiale monsters, en geassocieerd met ernstige infecties, vooral in intensive care unit ^5. Microbiële interactiesgerapporteerd tussen deze pathogenen in vitro maar de klinische gevolgen van deze interacties onduidelijk ^6. Om de interacties tussen C. Albicans en P. bestuderen aeruginosa, een muizenmodel van C. albicans luchtwegen kolonisatie, gevolgd door P. aeruginosa- gemedieerde acute longinfectie werd uitgevoerd.

Inleiding

Diermodellen, in het bijzonder muizen, zijn uitgebreid gebruikt om immuunresponsen tegen ziekteverwekkers te ontdekken. Hoewel aangeboren en verworven immuniteit verschillen tussen knaagdieren en mensen ^7, het gemak in kweek en de ontwikkeling van knockouts voor tal van genen maakt muizen een uitstekend model om immune responsen ⁸ bestuderen. De immuunrespons is complex en voortvloeit uit de wisselwerking van een pathogeen, de bewoner microbiële flora en verschillende immune (lymfocyten, neutrofielen, macrofagen) en niet-immune (epitheelcellen, endotheelcellen) celtypes ^2. In vitro studies niet toestaan ​​observeren deze complexe interacties en zich vooral richten op unieke cel-pathogeen interacties. Terwijl diermodellen moet met voorzichtigheid worden gebruikt en beperkt tot zeer specifieke en relevante vragen, muis modellen geven een goed inzicht in het zoogdier immuunrespons in vivo en kunnen delen van belangrijke klinische ^{7 vragen} aan te pakken.

In de luchtwegen, de microbiële gemeenschap complex associëren van een groot aantal verschillende micro-organismen ^6. Terwijl wat een "normale" luchtwegen microbiome moet nog worden bepaald, inwoner gemeenschappen vaak polymicrobiële, en afkomstig van verschillende ecologische bronnen. Patiënten met een etterige chronische longziekte (cystic fibrosis, bronchectasis) of mechanisch geventileerde patiënten vertonen een bijzondere flora vanwege kolonisatie van de luchtwegen door milieuvriendelijke verworven micro-organismen ^9. Pseudomonas aeruginosa en Candida albicans zijn beide probleem pathogenen ^5, vaak samen geïsoleerd van tracheobronchiale monsters en verantwoordelijk voor ernstige opportunistische infectie bij deze patiënten, vooral in de intensive care unit (ICU) ^4.

Isolatie van deze micro-organismen tijdens acute longontsteking bij ICU resulteert in anti-microbiële behandeling tegen P. aeruginosa but gist worden gewoonlijk niet beschouwd als pathogeen op deze plaats ^5. In vitro interactie tussen P. aeruginosa en C. albicans zijn op grote schaal gemeld en toonde dat deze micro-organismen groei en overleving van elkaar kunnen beïnvloeden maar studies konden concluderen of de aanwezigheid van C. albicans schadelijk hetzij gunstig voor de host ^10. Muismodellen zijn ontwikkeld om dit relevant P. pakken aeruginosa en C. albicans in vivo, maar de interactie tussen micro-organismen niet het belangrijkste punt. Inderdaad, werd het model opgericht om de betrokkenheid van C. evalueren albicans in gastheer immuunrespons, en het resultaat.

Een vorige model opgericht door Roux et al reeds een eerste kolonisatie met C. albicans gevolgd door een acute longinfectie veroorzaakt door P. aeruginosa. Met behulp van hun model, vonden de auteurs een schadelijke rol van prior C. albicans kolonisatie ^11. Echter Roux et al gebruikten een hoge belasting van C. albicans in hun uitvoering met 2 x 10 ⁶ CFU / muis gedurende 3 opeenvolgende dagen. We een 4-daagse model van C. albicans luchtwegkolonisatie, althans persistentie zonder longbeschadiging, In dit model C. albicans werd teruggewonnen tot 4 dagen na een enkele indruppeling van 10 ⁵ CFU per muis (Figuur 2B) ^12,13. Na 4 dagen werd geen bewijs van inflammatoire cel werving, inflammatoire cytokine productie noch epitheelbeschadiging waargenomen. Op 24 - 48 uur, op het hoogtepunt aanwezigheid van C. albicans, terwijl een cellulaire en cytokine aangeboren immuunrespons waargenomen, was er geen bewijs van longbeschadiging. Verrassenderwijs muizen aldus gekoloniseerd met C. albicans 48 uur voorafgaand aan de instillatie van P. intranasale aeruginosa infectie was verzwakt in vergelijking met muizen met P. aeruginosa infecties alleen. ikndeed, muizen vertoonden minder longbeschadiging en verminderde bacteriële last ^12,13.

Verschillende hypotheses kan dit gunstige effect van voorafgaande kolonisatie met C. verklaren albicans op P. aeruginosa gemedieerde acute longinfectie. Ten eerste, een interspecies overspraak waarbij elk micro-quorum sensing systemen, de homoserinelactone gebaseerde P. aeruginosa systeem en de Farnesol gebaseerde C. albicans systeem geëvalueerd. Ten tweede, C. albicans als een "decoy" target voor P. aeruginosa omleiden van het pathogeen uit longepitheelcellen bestudeerd. Beide hypothesen werden ongeldig (ongepubliceerde gegevens). De derde hypothese was dat van een "priming" van het aangeboren immuunsysteem door C. albicans verantwoordelijk voor een versterkte volgende aangeboren respons tegen P. aeruginosa. Deze laatste hypothese werd bevestigd. Inderdaad C. albicans kolonisatie leidde tot een priming van aangeboren immuniteit through IL-22, voornamelijk uitgescheiden door aangeboren lymfoïde cellen, wat resulteert in verhoogde bacteriële verwijdering en verminderde longbeschadiging ^12.

Concluderend is de gastheer een centrale actor in de interactie tussen microorganismen moduleren van de aangeboren immuunrespons en waarbij verschillende inflammatoire celtypen. Hoewel deze complexe immuuninteracties kan worden ontleed in vitro de oorspronkelijke hypothesen alleen nodig, worden voorzien in vivo modellen. Het volgende protocol geeft een voorbeeld van in vivo onderzoek van gastheer pathogeen gemedieerde interacties die kunnen worden aangepast voor andere micro-organismen.

Protocol

De regionale ethische regionale commissie voor dierproeven heeft deze methode goedgekeurd, in overeenstemming met de nationale en internationale dierlijke zorg en gebruik in onderzoek richtlijnen onderzoek.

1. Sample Collection

1. Monster opslag
   1. Verzamel alle monsters en onmiddellijk op te slaan bij - 20 ° C of op ijs tot diepvries opslag verslechtering te voorkomen. Plaats steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs bronchoalveolaire spoelingen (BAL) te verbeteren.
2. Chirurgie
   1. Steriliseren alle chirurgische apparatuur met behulp van een autoclaaf.
      LET OP: Als het mogelijk is, is het raadzaam om twee verschillende sets van instrumenten te gebruiken voor abdominale en thoracale stappen om kruisbesmetting te voorkomen. Dissectie benodigde apparatuur is beschreven in Figuur 4A

2. Muizen, Bacteriële en giststammen

1. Huis muizen in overeenstemming met de plaatselijke gebruik van dieren in rerichtlijnen zoekopdracht commissie in een geventileerde rack zonder overschrijding van 5 muizen per kooi, met voedsel en water ad lib, in een bioveiligheidsniveau 2 woningen faciliteit te wijten aan het gebruik van bioveiligheidsniveau 2 micro-organismen: P. aeruginosa en C. albicans.
2. Houd de bacteriestammen bij -80 ° C in 40% glycerol medium.
   1. Voeg bacteriën direct uit ingevroren voorraad in kweekbuis met 3 ml steriel Luria-Bertani bouillon met een 10 pl entoog. Laat O / N bij 37 ° C met orbitaal schudden (400 rpm) de dag vóór instillatie.
   2. Harvest bacteriën door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 min.
   3. Zuig het supernatant in een geschikt gesloten biologisch gevaarlijk afval. Observeren witte aanhangend pellet op de bodem van de cultuur buis.
   4. Was de pellet met behulp 5 ml PBS opschorten.
   5. Herhaal de stappen 2.2.2 tot een tweede keer om een ​​tweede wasbeurt te voeren 2.2.3.
   6. Resuspendeer de gepelleteerde bacteriën via 1 ml PBSen kort vortexen.
   7. Bepaal de inoculumdichtheid met optische densitometer bij 600 nm met behulp van een optische dichtheid meter. Een dichtheid van 0,9 komt overeen met 10 ⁹ CFU / ml voor PAO1 dienovereenkomstig verdund.
      Opmerking: Dit resultaat voor elke gebruikte stam worden verkregen door bepalen van de dichtheid van opeenvolgende verdunningen van een gekalibreerde inoculum.
   8. Controleer de entstof door seriële logaritmische verdunningen en de plaat 100 ul van elke verdunning op broomkresolpurper agar (BCP) platen en O / N cultuur. Dien elke muis intranasaal 50 pl van de oplossing met 1 x 10 ⁸ om 2 x 10 ⁸ CFU per ml (5 x 10 ⁶ om 1 x10 ⁷ CFU per muis).
3. Gebruik C. albicans SC5314 als referentiestam. Behoud van de stam in 40% glycerol medium bij -80 ° C.
   1. Supplement Gist-pepton-dextrose bouillon met 0,015% amikacine om bacteriële besmetting te voorkomen en verder tellen vergemakkelijken.
   2. Gist toe te voegen met behulp van 10 &# 181; l enting lus in de voorbereide YPD-bouillon aangevuld met amikacine O / N bij 37 ° C.
   3. Gist oogsten door centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 min.
   4. Verwijder supernatant in een geschikt bioharzard afvalverwijdering. Witte aanhangend pellet moeten worden waargenomen in de bodem van de cultuur buis.
   5. Was en schorten de gepelleteerde bacteriën met behulp van 5 ml PBS en kort vortexen.
   6. Herhaal de stappen 2.2.2 tot een tweede keer om een ​​tweede wasbeurt te voeren 2.2.3.
   7. Resuspendeer de pellet met behulp van 1 ml PBS en kort vortexen.
   8. Bepaal de grootte van het inoculum door telling op een Mallassez hematocytometer met een standaard microscoop bij een vergroting van 40x.
      OPMERKING: Concentratie (in CFU / ml) verkregen met de volgende formule: (aantal gist ⁵ x 10) / (aantal getelde raster rechthoeken op de Mallassez hematocytometer).
   9. Controleren door logaritmische seriële verdunning tot 10 ^-5 en 10 ^-6 om te bevestigen dat de oplossing bevat 2 x 10 ⁶ CFU / ml.
   10. Plaat op YPD-agar-platen, aangevuld met 0,015% amikacine.

3. Airways kolonisatie door C. albicans

OPMERKING: Na het milieu aanpassing worden muizen twee keer per dag gewogen.

1. Onder een zuurkast, borg 500 pi van sevofluraan op een 4 cm x 4 cm gaas (open-drop techniek) ^14.
   1. Onmiddellijk het gaas op de vloer van een ongeveer 750 ml inductie kamer. Plaats onmiddellijk een mesh verhoogd platform boven het gaas om direct contact tussen het dier en het gaas te voorkomen.
   2. Sluit luchtdicht deksel en wacht 1-2 min tot diffusie van Sevofluraan laten in de kamer.
   3. Breng de muis van kooi naar platform en sluit het deksel mesh. Lichte anesthesie met geconserveerde spontane ademhaling moet worden bereikt om 30 45 sec.
   4. Monitor voor hypotonie door het waarnemen van het verlies van oprichtreflex waarna de muis f kan worden verwijderdROM De doos en ingeprent.
2. Intranasale instillatie (kan in 10 seconden worden uitgevoerd door een getrainde operator).
   1. Houd de muis een hand genesteld op zijn rug overeind gehouden (Figuur 4B).
   2. Met behulp van de wijsvinger, ondersteunen het hoofd en gebruik de duim aan de kaak gesloten te houden om te voorkomen dat slijm (Figuur 4C).
   3. Zoals beschreven in stap 2.3.8, ervoor te zorgen dat de voorbereide C. albicans oplossing bevat 2 x10 ⁶ CFU per ml van een 50 pl volume ingeprent.
      OPMERKING: De tweede kritische punt is de bijgebracht volume. Een volume van minder dan 50 ul kan leiden tot een onvoldoende kolonisatie of inhomogene instillatie van de luchtwegen, kan een groter volume verdrinking / verstikking en dood veroorzaken.
   4. Boezemen de muis intra-nasaal door het naderen van de pipet om de neusgaten.
   5. Pipetteer 50 ul druppel vormen van een bel die de oplossing op de neus vervolgens ingeademd door de spontaneously ademhaling muis.
   6. Plaats muis in een herstel gebied (bijvoorbeeld een grote, goed belucht kale kooi met een overhead verwarming lamp). Muizen moeten worden gecontroleerd tot volledig ontwaken. Heeft een dier niet onbeheerd verlaten totdat het voldoende bewustzijn borstligging en oprichtende reflex behouden heeft herwonnen. Op dit punt kan de muis worden teruggebracht naar normale behuizing kooi.

4. P. aeruginosa geïnduceerde Acute Lung Infectie

LET OP: De muizen worden gewogen tijdens de volgende vier dagen. Normaal, muizen gewichtstoename tijdens C. albicans-gemedieerde luchtwegkolonisatie (Figuur 2A).

1. Bereid de suspensie die P. aeruginosa de dag van de instillatie na O / N groei (paragraaf 2.2).
2. Verdoven kort met behulp ingeademd Sevoflurane zoals hierboven (punt 3.1) beschreven.
   OPMERKING: acute longontsteking uit te voeren, raden bacteriële last worden voorgesteld inTabel 1.
3. Boezemen de muis, zoals hierboven (punt 3.2) beschreven met bijzondere aandacht voor de post-instillatie herstel.

5. Meet van Lung Injury Index

1. Bereid een oplossing van FITC-gemerkte albumine. Injecteer deze oplossing 2 uur voor dieren euthanasie.
   1. Weeg 0,2 mg albumine-FITC met de juiste apparatuur.
   2. Voeg 0,2 mg in 1 ml PBS. Kort vortex. Indien niet onmiddellijk gebruikt, plaatst u de oplossing in folie om de blootstelling aan omgevingslicht te voorkomen.
   3. Injecteer intraperitoneaal 200 ul FITC-gelabelde albumine oplossing voor elke muis.
2. Euthanasia
   1. Weeg de muizen voor de laatste gegevens over het gewicht.
   2. Euthanaseren een enkele muis in overeenstemming met lokale gebruik van dieren in het onderzoek de commissie richtlijnen met behulp van een intra-peritoneale injectie van een dodelijke overdosis van pentobarbital: 300 ul van 5,47% pentobarbital.
   3. Verwijder muis van de kooi en ontvangt lEthal injectie door de operator.
   4. Na injectie, overdracht van de muis alleen een andere kooi, verborgen voor andere dieren. Let op de muis totdat er geen beweging. Bevestig de dood is door de afwezigheid van beweging, met name respiratoire beweging, gebrek aan impuls.
   5. Het uitvoeren van chirurgische verzamelen van monsters op dode dieren, dus zonder verdoving of pijnstillers.
3. Chirurgische monstername: Thoracic podium.
   OPMERKING: Om steriele omstandigheden te handhaven, wordt al een operatie uitgevoerd met behulp van steriele apparatuur in een bioveiligheidsniveau 2 omgeving.
   1. Breng ethanol op de huid. Voer een middellijn incisie in de huid van het borstbeen tot medio buik met een schaar. Van middellijn insnijden langs de ribbenkast aan beide zijden. Vouw de huid aan beide zijden van de thorax aan de ribbenkast visualiseren.
   2. Voer een verticale insnijding van de ribbenkast aan weerszijden gaand naar de sleutelbeenderen om te kunnen het gehele voorste borstwand aanliggen met de achterstevenum waardoor de perfecte visualisatie van het hart en de longen (figuur 5A, 5B).
   3. Verzamel bloed met behulp van een pre-heparined spuit door aanprikken van het hart naast de interventriculaire slagader. Trek minimaal 500 ul minstens 100 pl plasma te verkrijgen. Leg het bloedmonster op het ijs.
   4. Voer een middenlijn cervicale insnijding aan de luchtpijp (figuur 5B en 5C) te visualiseren. Ontleden de fascia rond de luchtpijp zorgvuldig. Plaats een hechting achter de luchtpijp (figuur 5C en 5D). Vervolgens wordt de hechtdraad gesloten rond de canule naald om goede lavage waarborgen.
   5. Katheteriseren de luchtpijp met behulp van de 20-G gemodificeerd maagsonde naald (Figuur 5D en 4A). Bind een chirurgische knoop rond de gecanuleerde luchtpijp met de eerder geplaatste hechtdraad.
   6. Om bronchoalveolaire spoelingen (BAL) uit te voeren, voorzichtig en geleidelijk te injecteren en trekken 500 ul ijskoude PBS in / uit de long. Plaats het monster op de ice cellulaire lyse voorkomen.
   7. Herhaal stap 5.3.6, 3 keer in totaal 1500 pl BAS vloeistof en pool lavage monsters krijgen in een 2 ml centrifugebuis (figuur 5E).
   8. Verwijder de longen uit de borst. Plaats een long-segment (grootte moet overeenkomen met de helft van een long of een kwab) in 1,5 ml centrifugebuis en opslaan snel bij - 80 ° C.
   9. Plaats een long-segment in een vooraf gewogen hemolyse buis met PBS om bacteriële last te bepalen en plaats het op het ijs.
4. Chirurgische monstername: abdominale podium.
   1. Voer een incisie aan de linkerkant van de buik. Let op de milt door het buikvlies.
   2. Verwijder de milt en plaats in een tweede hémolyse buis met 1 ml PBS en plaats op ijs.
5. Longbeschadiging index
   OPMERKING: alveolaire capillaire membraan-permeabiliteit wordt bepaald door het meten FITC-gelabelde albumine lekkage uit het vasculaire compartiment naar de alveolaire-interstvrijwaart de oorspronkelijke compartiment.
   1. Centrifuge bloedmonster en BAL vloeistof voor 10 min bij 1500 x g. Verzamel supernatanten in nieuwe centrifugebuisjes. De pellets overeen met aangeworven plasma of BAL cellen en moeten op ijs geplaatst.
   2. Voeg 100 ul van elk supernatant bloed (plasma, geel) of BAL supernatant van een 96-well ruit (300 ui putjes). Plaats een folie op de plaat als het niet onmiddellijk wordt gebruikt.
   3. Meet fluorescentie niveaus in plasma en BAL supernatanten met behulp van een fluorescentie microplaat lezer (excitatie 487 nm, emissie 520 nm).
   4. Bepaal de longbeschadiging index door het berekenen van de fluorescentieverhouding [(BAL supernatant / bloed supernatans) x 100].
6. Bronchoalveolaire lavage (BAL) differentiële celtelling.
   OPMERKING: Gebruik de cel pellet verkregen uit centrifugeren van BAL vloeistof in stap 5.5.1.
   1. Indien nodig, gebruik van rode cellysisbuffer. Voeg 500 ul van rode cellen lysis buffer in de centrifugebuis die de CELl pellet. Kort vortex en laat 10 min op ijs. Voeg 500 ul PBS rode-cellysis stoppen.
   2. Oogst de cellen door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 1500 x g. Verwijder supernatant en schorten de cel pellet in 1 ml steriele PBS. Inventariseer cellen op een Mallassez hematocytometer. Met behulp van een hemacytometer om Cells Count. Concentreer cellen op een dia met een cytospin.
   3. Vlek cellen met behulp van kleuring kit voor de identificatie en telling (macrofagen, lymfocyten, neutrofielen) cel.
7. Long bacteriële belasting en bacteriële verspreiding
   OPMERKING: long bacteriële belasting en bacteriële verspreiding, longen en milt beoordelen respectievelijk verzameld en opgeslagen in vooraf gewogen hemolyse buizen met 1 ml PBS (stap 5.3.9).
   1. Weeg hemolyse buisjes met 1 ml PBS en hetzij longen en milt. Homogeniseer de monsters met een weefselhomogenisator long homogenaten en milt homogenaten verkrijgen.
   2. Stort 100 pl weefsel homogenates in centrifuge buisjes die 900 ul steriel PBS tot seriële logaritmische verdunningen te verkrijgen.
   3. Plaat de laatste twee geschikte verdunde monsters (10 ^-3 en 10 ^-2) aan beide BCP-agar voor P. aeruginosa of YPD-amikacine-aangevuld agar voor C. albicans long en milt last bepalen.
   4. Incubeer de platen O / N bij 37 ° C. De volgende dag opsommen de kolonies op platen.
   5. Index het resultaat longgewicht een CFU per gram long verkrijgen. Lung steekproefomvang niet hetzelfde, de resultaten worden uitgedrukt in CFU per gram long.
      Formule voor de index is: [CFU] x [gewicht van hemolyse buis en longen] - [gewicht van hemolyse buis].

Resultaten

Zoals eerder gezien tijdens het protocol beschrijving, het experiment moet 5 dag (Figuur 1: experiment tijdlijn) te voltooien. Een operator gevraagd tijdens de gehele run van het experiment en kan omgaan met de processen tot een maximum van 10 muizen. Als er meer dieren nodig zijn, zijn twee personen nodig zijn in het bijzonder voor chirurgische monstername. Inderdaad alle monsters moeten worden verzameld in het kader van 2 uur tot een verhoogde passief alveolaire-capillaire lekkage van FITC-gelabelde a...

Discussie

Diermodellen, in het bijzonder zoogdieren, bruikbaar complexe mechanismen van gastheer-pathogeen interactie helderen op het gebied van immuniteit. Natuurlijk, de behoefte aan informatie verkregen uitsluitend uit dierlijke modellen moeten onontbeerlijk zijn; Anders moet gebruik van dieren worden vervangen door in vitro modellen. Dit diermodel illustreert het inzicht dat alleen kan worden verschaft door een diermodel aangezien de interactie tussen pathogenen wordt gemedieerd door een multi-component gastheerrespo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 ml plastic fles
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	referentie in eerste kolom	geen commentaar
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	20x per eenheid
Pentobarbital sodique 5.47%	CEVA	6742145	100 ml plastic fles
2-headed valve	Distrimed	92831	geen commentaar
Steriele inoculatie-lus 10 µl	Dutscher	10175	x1.000 conditionering
Insuline spuiten 1 ml	Dutscher	30003	per 100 conditionering
2 posities Cultuurbuis 8 ml	Dutscher	64300	geen commentaar
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	geen commentaar
Hemolysebuisjes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS - Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	verpakt in 500 ml
amikacin 1 g	Mylan	62516778	per 10
Heparine 10.000 IE in 2 ml	Pan pharma	9128701	10x per eenheid
RAL 555 kleuring kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons van 100 mL
1,5 ml microcentrifugebuisje	Sarstedt	55.526.006	x 1000
Transparante 300 µl 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	geen commentaar
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in poeder
FITC-albumine	Sigma	A9771	in poeder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in poeder
25-gauge naald	Terumo of unisharp	A231	x 100 conditionering
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	geen commentaar