Anti-virulente Verstoring van pathogene biofilms met Engineered Quorum-blussen Lactonases

Samenvatting

Quorum-quenching enzymen zijn anti-virulente en antibacteriële opties die pathogenese kunnen verminderen zonder het risico op resistentie, door het voorkomen van de expressie van virulentiefactoren en genen die geassocieerd zijn met antibioticaresistentie en biofilmvorming. In deze studie rapporteren we een methode die de werkzaamheid van quorum-quenching enzymen bij het onderbreken van bacteriële biofilms aantoont.

Samenvatting

De snelle opkomst van multi-resistente bacteriën heeft de noodzaak versneld voor nieuwe therapeutische benaderingen om levensbedreigende infecties te bestrijden. De aanhoudendheid van bacteriële infecties wordt vaak geassocieerd met quorum-sensing-gemedieerde biofilmvorming. Daarom vormt de verstoring van dit signaalcircuit een aantrekkelijke anti-virulentiestrategie. Het is gemeld dat quorum-quenching lactonasen effectieve verstoorders zijn van quorum-sensing circuits. Er zijn echter zeer weinig meldingen geweest van het effectieve gebruik van deze enzymen bij het verstoren van bacteriële biofilmvorming. Dit protocol beschrijft een methode om biofilmvorming in een klinisch relevante A. baumannii S1-stam te verstoren door het gebruik van een geëngineerde quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is een belangrijke humane pathogeen die wereldwijd betrokken is bij ernstige ziekenhuisinfecties en de virulentie ervan wordt voornamelijk toegeschreven aan de vasthoudendheid van zijn biofilm. De behandeling met de geëngineerde lactonase bereikte een significante reductie van A. baumannii S1 biofilm. Deze studie toonde ook de mogelijkheid aan om geëngineerde quorum-quenching enzymen te gebruiken bij de toekomstige behandeling van door biofilm gemedieerde bacteriële ziekten. Ten slotte kan de methode worden gebruikt om de competentie van veelbelovende quorum-quenching enzymen te evalueren.

Inleiding

Behandelingsopties voor infectieziekten zijn gecompliceerd door de snelle toename van multiresistente bacteriën die immuun zijn voor een breed scala van antibiotica ¹ zijn. Met een hoge morbiditeit en mortaliteit van resistente bacteriën veroorzaakte infecties, bestaat er behoefte aan de ontwikkeling van geneesmiddelen processen escaleren en / of zoeken naar betere anti-bacteriële alternatieven voor therapeutische opties te verbeteren. De laatste tijd is de anti-virulentie benadering wint belang gezien de mogelijkheden in het voorkomen van virulentie via niet-bacteriedodende methoden, vandaar het verminderen van de risico's van resistentie mechanismen ^2.

Quorum-sensing is een 'hoofdschakelaar' in bacteriële virulentie en verstoring van deze signalering fenomeen is een veelbelovende anti-virulentie methode tegen pathogenese ^3. Het begin van virulentie vereist de accumulatie van quorum moleculen in de extracellulaire omgeving na een kritische bacteriepopulatie dichtheid wordt bereikt. Zoals quorum diffunderen terug in de intracellulaire matrix binden aan hun verwante receptors leidt tot de activering van virulentiefactoren en genen geassocieerd met resistentie tegen antibiotica en biofilmvorming ^4. In het algemeen, quorum-sensing verstoring gaat remmen quorum molecuul en receptor interactie zonder dat primaire metabole routes. Daarom heeft het geen directe implicaties voor cellulaire groei. Omdat geschiktheid niet wordt aangetast, er minimale selectiedruk bacteriën evolueren en weerstand tegen dergelijke behandelingen ⁵ krijgen. Bovendien kunnen quorum-sensing verstoring verstoren inherent bacteriële beschermingsmechanismen zoals bij biofilmvorming, die bescherming tegen antibacteriële middelen verschaft en gastheer immuunreacties.

Geschat wordt dat 99% van de microben op aarde bestaat in complexe biofilm-achtige matrices, verleent cruciaal overleving voordelen voor de micro-organismen die binnen these structuren ^6. Belangrijker vorming van deze sessiele domeinen is de oorzaak van de meeste hardnekkige en chronische ziekenhuisinfecties ^7. Acinetobacter baumannii is een van de belangrijkste menselijke pathogenen die verband houden met globale ziekenhuisinfecties en de virulentie is grotendeels toegeschreven aan quorum-sensing gemedieerde biofilmvorming ^8. Quorum-quenching enzymen zijn met succes gebruikt bij het ​​verstoren van quorum-gemedieerde signaaltransductie door zich te richten een groep van verbindingen bekend als N-acyl homoserine lactonen (AHL's) die worden gevormd door Gram-negatieve bacteriën ^9. Verschillende studies hebben ook uitgebreid op het gebruik van deze enzymen om bacteriële pathogenese te blokkeren door de vermindering van virulentiefactor expressie en celaantallen in biofilms ^10,11. Helaas blijft er een gebrek aan tastbare demonstratie van het effectieve gebruik van quorum quenching enzymen tegen biofilmvorming door bacteriële pathogenen. Dere pogingen om quorum remmers (AHL-analoga), in plaats van quorum-quenching enzymen, A. verstoren geweest baumannii biofilmvorming ^12. Hoewel deze methode van het gebruik van kleine moleculen remmers is een geldig aanpak, het behoud van de biologische beschikbaarheid in translationeel toepassingen kan een uitdaging zijn. Daarentegen kan het gebruik van katalytische-quorum quenching enzymen de biobeschikbaarheid probleem omzeilen enzymen ontvankelijker richting immobilisatie op oppervlakken van biomedische inrichtingen voor therapeutische effecten.

Hier beschrijven we een beoordeling van de effecten van gemanipuleerde-quorum blussen lactonases van Geobacillus kaustophilus (GKL) ¹³ op bacteriële biofilmvorming, met behulp van kristalviolet kleuring en confocale laser scanning microscopie (CLSM). Deze studie is de eerste succesvolle demonstratie van biofilm verstoring in een klinisch relevante A. baumannii S1 stam met behulp van quorum-blussen enzymen. De werkwijzen beschrevenin deze studie zijn bruikbaar voor het beoordelen van de werkzaamheid van andere quorum quenching enzymen in latere therapeutische ontwikkelingsinspanningen tegen pathogene Gram-negatieve bacteriën.

Protocol

1. Crystal Violet kwantificering van Biofilm Formation in A. baumannii S1

1. Groeien een cultuur 5 ml van A. baumannii S1 lysogenie bouillon (LB) (trypton 10 g / l, gistextract 5 g / l) bij 30 ° C in een schudincubator (220 rpm) gedurende 16 uur.
2. Pas de cultuur van A. baumannii S1 een gewenste OD ₆₀₀ van 0,8. Met behulp van een 96-wells plaat, beënt de bacteriecultuur (1: 100 verdunning) in vers LB dat 10 ui gezuiverd GKL enzym (40 mg / ml); uiteindelijke volume van de nieuwe cultuur is 100 pl.
3. Bereid een controle cultuur als goed; Deze ontvangt geen enzymen bevatten. Herhaal vergelijkbare omstandigheden om het gewenste aantal herhalingen opleveren.
4. Bedek de plaat met een deksel en plaats het in een afgesloten 10 L kunststoffles. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 3 uur voordat voorzichtig verwijderen van de media.
5. Voeg nog 100 ul vers LB-medium tot het putje en incubeer de plaat gedurende 21 uur bij 30 ° C.
6. Na de tweede periode van incubatie, verwijder voorzichtig alle media. Was de planktonische bacteriën cel met 200 pi steriel water. Zorg ervoor dat er slechts een minimale verstoring van de cellen tijdens het wassen.
7. Voeg 100 ul van 1% kristalviolet oplossing in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de kristalvioletoplossing door het behandelde goed met 200 ul steriel water. Herhaal het wassen voor nog twee keer.
8. Voeg 100 ui 33% azijnzuur aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten onder zacht schudden; Dit zal de kleurstof oplossen.
9. Kwantificeren van de hoeveelheid biofilm gevormd door de absorptie van kristalviolet bij 600 nm. De hoeveelheid kristalviolet evenredig met de hoeveelheid biofilm gevormd.

2. confocale laser scanning microscopie van A. baumannii S1 Biofilm

1. Groeien een cultuur 5 ml van A. baumannii S1 in LB bij 30 ° C in een schudincubator (220 rpm) gedurende 16 uur.
2. Advertentiealleen de cultuur van A. baumannii S1 een gewenste OD ₆₀₀ van 0,8. Met behulp van een 35 mm glazen bodem μ-schotel, te enten van de bacteriën cultuur (1: 100 verdunning) in de frisse LB met 30 ul van gezuiverd GKL enzym (40 mg / ml); uiteindelijke volume van de nieuwe cultuur is 1 ml.
3. Bedek de μ-schotel met een deksel en plaats het in een afgesloten 10 L plastic container. Incubeer de μ-schotel bij 30 ° C gedurende 3 uur voordat voorzichtig verwijderen van de media. Voeg 30 ul van gezuiverd GKL enzym en vers medium, waardoor deze tot een totaal volume van 1 ml. Incubeer nog eens 21 uur bij 30 ° C.
4. Herhaal stap 2,3 en incubeer de μ-schotel nog eens 24 uur bij 30 ° C. Verwijder vervolgens de media voorzichtig.
5. Voeg 500 ul van 5 ug / ml Alex Fluor 488-geconjugeerd tarwekiem agglutinine (WGA) opgelost in Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) aan de μ-schotel en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min; Dit zal het gevormde biofilm vlek. Verwijder de kleuroplossing en wassen thij u-schotel met 2 ml HBSS. Herhaal de wasstap nog een keer.
6. Voeg 500 ul van 3,7% formaldehyde opgelost in HBSS en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min; dit zal de biofilm op de μ-Dish lossen. Was de μ-schotel eenmaal met 2 ml HBSS en volledig verwijder de oplossing. De μ-schotel met biofilm vastgesteld kan worden bewaard in het donker bij 4 ° C voorafgaand aan CLSM beeldvorming.
7. Voor CLSM beeldvorming en analyse gebruikt 63 keer vergroot tot 97 stapels per beeld te genereren met een interval van 0,21 micrometer per stapel.

Resultaten

In het kristal violet kwantificering experiment werden twee quorum-blussen enzymen die worden gebruikt om de haalbaarheid aan te tonen in het verstoren van biofilmvorming: wild-type GKL en een verbeterde GKL dubbele mutant (E101G / R230C). Beide enzymen bleken lactonase-activiteit vertonen tegen 3-hydroxy-decanoyl-L-homoserinelacton (3-OH-C ₁₀ -HSL), grote quorum molecuul gebruikt door A. baumannii S1 ^14. Voor geldige beoordeling van de biofilm verstoring, ...

Discussie

In beide reeksen experiment A. baumannii S1 werd gekweekt in LB-medium zonder NaCl als een hoge zoutconcentratie kan de hoeveelheid biofilm gevormd door de bacteriën ¹⁵ te verminderen. De aanwezigheid van dergelijke artefact zou de hoeveelheid biofilm gevormd, evenals de effecten van quorum quenching enzymen in verschillende behandelingsomstandigheden onderschat. Het gebruik van een katalytisch inactieve enzym belangrijk als een negatieve controle de mogelijke effecten enzym sekwestratie elimineren. ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Let op: Ontvlambaar
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Let op: Corrosief
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus