Methodenartikel

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

DOI:

10.3791/53245

⸱

4 juli 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membraaneiwitten hebben belangrijke functies in cellen zoals nutriëntentransport, beweeglijkheid, signaaltransductie, overleven en virulentie, maar vormen slechts ongeveer 1% van de bekende structuren. Er zijn twee typen membraaneiwitten, α-helicale en β-vat. Terwijl α-helicale membraaneiwitten in bijna alle celmembranen kunnen worden gevonden, kunnen β-vat membraaneiwitten alleen worden gevonden in de buitenmembranen van mitochondriën, chloroplasten en Gram-negatieve bacteriën. Een veelvoorkomende bottleneck in structurele studies van membraaneiwitten in het algemeen is het verkrijgen van voldoende zuivere monsters voor analyse. In de hoop om degenen te helpen die geïnteresseerd zijn in het oplossen van de structuur van hun favoriete β-vat buitenmembraaneiwit (OMP), worden algemene protocollen gepresenteerd voor de productie van doel-β-vat OMP's op niveaus die nuttig zijn voor structuurbepaling door middel van röntgenkristallografie en/of NMR-spectroscopie. Hier schetsen we het ontwerp van constructen voor zowel native expressie als voor expressie in inclusielichamen, zuivering met behulp van een affiniteitstag en kristallisatie met behulp van detergent screening, bicelle en lipidische kubieke fase technieken. Deze protocollen zijn getest en bleken te werken voor de meeste OMP's van Gram-negatieve bacteriën; er zijn echter enkele doelen, met name voor mitochondriën en chloroplasten, die andere methoden voor expressie en zuivering kunnen vereisen. Als zodanig zouden de methoden hier toepasbaar moeten zijn voor de meeste projecten die OMP's van Gram-negatieve bacteriën omvatten, maar de expressieniveaus en hoeveelheid gezuiverd monster zullen variëren afhankelijk van het doel-OMP.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-barrel OMP's alleen worden gevonden in het buitenmembraan van mitochondria, chloroplasten, en Gram-negatieve bacteriën 1-3. Terwijl ze gelijkaardige rol dienen als α-helix eiwitten, ze hebben een heel andere plooi bestaande uit een centrale membraan ingebedde β-barrel domein variërend 8-26 antiparallelle β-strengen met elk onderdeel zijn nauw verbonden met de twee aangrenzende strengen (figuren 1 en 2). De eerste en laatste strengen van het β-barrel domein interageren dan met elkaar bijna uitsluitend in een anti-parallelle wijze (behalve mitochondriale VDAC), sluiten en afdichten van de β-barrel domein van de omringende membraan. Alle β-barrel OMP's zijn extracellulaire lussen van verschillende sequentie en lengte die een belangrijke rol ligand interacties en / of eiwit-eiwit contacten spelen met deze loops soms zijn zo groot als 75 resten, zoals in Neisseria transferrine bindende proTein A (TbpA) 4. β-barrel OMP kunnen ook N-terminale of C-terminale periplasmatische extensies, die als extra domeinen dienen voor het eiwit functioneel doel (bijv BAMA 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Hoewel vele soorten β-barrel OMP aanwezig 11 zijn twee van de meest voorkomende hierna beschreven als voorbeeld voor niet-ervaren het veld (1) TonB-afhankelijke transporters en (2) autotransporters.

TonB-afhankelijke transporters (bv, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) zijn essentieel voor voedingsstoffen import en bevatten een N-terminaal plug domein bestaande uit ~ 150 resten die gevonden is weggestopt in een C-terminaal 22-stranded β- barrel domein ingebed in de buitenste membraan 12 (figuur 3). Hoewel deze plug domein voorkomt substraat vrijelijk door het vat domein, substraatbinding induceert een conformationele verandering binnen het plug domein thbij leidt tot de vorming van poriën (hetzij door plug herschikking of door gedeeltelijke / volledige uitwerpen van de stop), die vervolgens substraat transport over de buitenste membraan kan faciliteren in het periplasma. TonB-afhankelijke transporteurs zijn vooral belangrijk voor de overleving van sommige pathogene stammen van Gram-negatieve bacteriën zoals Neisseria meningitidis die gespecialiseerde transporteurs die voedingsstoffen kapen zoals ijzer direct uit menselijke gastheer- 4,13,14 geëvolueerd.

Autovrachtwagens behoren tot het type V secretiesysteem van Gram-negatieve bacteriën en zijn P-barrel OMP's die bestaan ​​uit een β-barrel domein (typisch 12-strengen als met ESTA en ESPP) en een passagier domein dat ofwel wordt uitgescheiden en gepresenteerd op de oppervlak van de cel 15,16 (figuur 3). De β-barrel OMP's dienen vaak een belangrijke rol in celoverleving en virulentie bij de passagier domein dienen ofwel als een protease, adhesine, en / of andere effector die bemiddelt pathogenese.

Structurele werkwijzen zoals röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie en elektronenmicroscopie (EM) laten modellen bepalen de OMP's bij atomaire resolutie die weer gebruikt kan worden om te ontcijferen hoe ze functioneren in het buitenmembraan. Deze waardevolle informatie kan dan worden gebruikt voor het geneesmiddel en vaccinontwikkeling, indien van toepassing. Bijvoorbeeld, transferrine bindend eiwit A (TbpA) gevonden op het oppervlak van Neisseria en is vereist voor pathogenese omdat het direct bindt humaan transferrine en vervolgens extraheert en invoert ijzer tot zijn eigen overleving. Zonder TbpA, kan Neisseria niet vangen ijzer uit de menselijke gastheer en zijn gemaakt van niet-pathogene. Na de kristalstructuur van humaan transferrine gebonden aan TbpA 4 opgelost, het veel duidelijker hoe de twee eiwitten geassocieerd werden, welke gebieden van TbpA gemedieerde interactie, welke residuen belangrijk ijzer extractie waren door TbpA enhoe men zou kunnen ontwikkelen therapieën tegen Neisseria targeting TbpA. Daarom, gezien het belang van β-barrel OMP's in Gram-negatieve bacteriën om te overleven en pathogenese, en in mitochondria en chloroplasten functie en de behoefte aan aanvullende structurele informatie over deze unieke klasse van membraaneiwitten en de systemen waarin ze functioneren , algemene protocollen worden met de algemene doelstelling van het uitdrukken en zuiveren doel OMP op een hoog niveau voor de karakterisering door structurele methoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonen en expressie

Opmerking: Om structurele studies schakelen, moet voldoende hoeveelheden zeer zuivere eiwit worden bereid, en dit begint meestal met de klonering en overexpressie van het beoogde β-barrel buitenmembraan proteïne (OMP) in E. coli (Figuur 4). Tot op heden alle β-barrel OMP structuren, waaronder die voor mitochondriale structuren VDAC zijn afgeleid van bacterieel tot expressie gebrachte eiwit 11. Hier worden de algemene protocollen gepresenteerd voor het kloneren en het uiten van β-barrel OMP voor (1) inheemse expressie rechtstreeks in bacteriële membranen en (2) expressie in insluitsels lichamen voor in vitro hervouwen 17.

  1. Het ontwerpen van een Expression Construct
    1. Verkrijgen of de aankoop van de codon geoptimaliseerde doel OMP-gen.
    2. Aankoop of verkrijgen van een T7 expressievector (i) die een periplasmatische localisatie signaalsequentie, een N-terminaal 6x-histidine tag,en een TEV protease plaats 4,18,19 in vivo expressie de membraan of (ii) zonder periplasmatische localisatie signaalsequentie voor expressie insluitingslichamen in vitro opnieuw vouwen.
      Opmerking: Een N-terminale protease splitsbare 6x of 10x-histidine tag zou een eenvoudige methode voor zuivering. Zoals met oplosbare eiwitten, variëren de keuze van affiniteitsmerker (Histidine, Strep, GST, etc.), de positie van de affiniteit tag, en het opnemen van een proteaseplaats (TEV, enterokinase, thrombine, etc.) voor daaropvolgende tag verwijderen .
    3. PCR amplificeren van de doelsequentie met geschikte primers en subkloon in de expressievector. Gebruik ligatie onafhankelijke klonen (LIC) 20,21 of conventionele kloontechnieken (restrictie-enzymen / ligatie) te subkloneren. Echter, LIC hoge doorvoer te vergemakkelijken, waardoor een groot aantal verschillende constructen (afknottingen, verschillende markeringen, verschillende promoters) te kloneren parallel moregemakkelijk.
  2. In vivo Membraan-gerichte Expression
    1. Met sequentieanalyse om de doelstelling β-barrel OMP gekloneerd stroomafwaarts en in frame met een signaalsequentie controleren (bijv pelB, OmpA) in het expressieconstruct.
      Opmerking: De signaalsequentie stuurt de ontluikende keten de Sec translocon voor uitscheiding naar het periplasma en de daaropvolgende constructie in de buitenmembraan.
    2. Transformeer de construct in een expressievector bacteriestam voor expressie door pipetteren 1,0 pl plasmide in 50 pl BL21 (DE3) chemisch competente cellen en meng voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer op ijs gedurende 30 min.
    3. Warmte puls op 42 ° C voor 30 sec met een waterbad en vervolgens terugplaatsen op ijs gedurende 1 minuut.
    4. Voeg 1 ml voorverwarmde SOC media en schud bij 37 ° C gedurende 1 uur bij 1000 rpm met een benchtop schudder incubator.
    5. Plaat 100 ul van cellen op LB-agarplaten met een geschikt Antibiotic en incubeer overnacht bij 37 ºC omgekeerd.
    6. Het uitvoeren van kleinschalige expressie testen door het enten van een 5 ml LB + antibioticum cultuur met een enkele kolonie. Herhaal dit voor 5-10 kolonies.
      Opmerking: vanwege de mogelijke toxiciteit van een β-barrel OMP en de afhankelijkheid van basale expressieniveaus wordt kolonie naar kolonie variabiliteit soms waargenomen. Daarom screening meerdere kolonies wordt aanbevolen voor elk construct getest. Voor kleinschalige expressie testen, in plaats van de conventionele 5 ml culturen, groeit 25 ml culturen in 125 ml verbijsterd erlenmeyers wordt gesuggereerd. Deze voorwaarden zijn vaak beter weer te geven wat er zal gebeuren in een grootschalige groei. Daarnaast is het een goed idee om ook screenen verschillende soorten kweekmedia (TB, LB, 2xYT, M9, enz.), Aangezien wisselend succes gemeld afhankelijk van het doeleiwit.
      1. Groeien bij 37 ° C onder schudden tot een OD 600 van ~ 0,6.
      2. Induceren expressie van het doel OMP door adding 5 ui 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan elke kweekbuis en laat nog eens 1-2 uur groeien.
      3. Vergelijk expressieniveaus van alle kolonies door centrifugeren 1 ml van elke kweek (OD 600 van ~ 0,6) gedurende 1 min bij 15.000 xg behulp van een microcentrifuge.
      4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 ui 1 x SDS-PAGE laadbuffer. Verhitting tot 100 ° C gedurende 5 minuten en centrifugeer weer bij 15.000 g gedurende 5 min.
      5. Analyseer de monsters met behulp van SDS-PAGE pipetteren 20 pl in elk putje van een 10% gel. Voer de gel gedurende 35 min bij een constante 200 V.
        Opmerking: Het zou goed op dit punt te kunnen bepalen of het eiwittarget goed wordt gevouwen of niet. Dit kan vaak worden bereikt door het doen van kleinschalige zuiveringen of door te testen op warmte aanpasbaarheid.
    7. Selecteer de kolonie met de beste uitdrukking en het uitvoeren van grootschalige expressie met behulp van 12-24 L van medium.
      Opmerking: Gebruikelijke werkwijzen typisch groeien de kweken bij 37 ° C onder schudden tot een OD 600 van ~ 0.6 en vervolgens te induceren met een geschikte inducer (dat wil zeggen, 0,1-1 mm voor IPTG of ~ 0,2% voor arabinose) voor een extra 2-4 hr . Indien gewenst, voorafgaand aan de inductie, verlagen de temperatuur zo laag als 20 ° C en verlengen de inductietijd.
      1. Voor lekkende expressie methode, groeien een 25 ml te enten cultuur bij 37 ° C in LB medium dat het juiste antibioticum (s) tot OD 600 bereikt ~ 0,6. Voeg vervolgens 1 ml inoculum twaalf 1 L flessen TB medium met antibioticum (en) en groeit bij 20 ° C tot verzadiging (~ 3 dagen).
    8. Oogst de cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min.
    9. Ga verder met zuiveringsstap paragraaf 2.1 of bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -80 ºC.
  3. Uitdrukking Inclusion Bodies voor in vitro Refolding
    1. Met sequentieanalyse om het expressieconstruct verifiëren niet een signaalsequentie bevat. De afwezigheid van een signaalsequentie zal het doeleiwit rechtstreeks te accumuleren in het cytosol als inclusielichamen.
    2. Transformeer de expressie construct in een uitdrukking bacteriestam voor expressie. Voor opname lichaam expressie, is het het beste om expressie door middel van inductie (dat wil zeggen, IPTG, arabinose, etc.) controleren om mogelijke toxiciteit te minimaliseren.
    3. Plaat 100 ul van getransformeerde cellen op LB agarplaten met een geschikt antibioticum en incubeer overnacht bij 37 ° C omgekeerd.
    4. Het uitvoeren van kleinschalige expressie testen door het enten van een 5 ml LB + antibioticum cultuur met een enkele kolonie.
    5. Herhaal stap 1.3.4 2-4 extra kolonies.
    6. Groeien bij 37 ° C onder schudden tot een OD 600 van ~ 0,6.
    7. Induceren met een geschikte inducer voor 1-2 uur.
    8. Vergelijk expressie niveaus voor alle tHij kolonies door analyse met behulp van SDS-PAGE (zie stap 1.2.6). Selecteer de kolonie met de beste uitdrukking en het uitvoeren van grootschalige expressie met behulp van 12-24 L van medium.
      1. Groeien de cellen bij 37 ° C tot een OD600 van 0,6-0,8 en induceren bij 37 ° C gedurende 3-5 uur. Terwijl expressie insluitingslichamen is robuuster dan andere vormen van expressie, zoals met alle eiwitexpressie experimenten kan expressie worden verbeterd door het variëren van groeimedium, inductiefase, temperatuur van inductie, en concentratie van het inducerende middel.
    9. Oogst de cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min.
    10. Ga verder met zuiveringsstap paragraaf 2.2 of bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -80 ºC.

2. Zuivering

  1. Isolatie van membraanfracties
    Opmerking: In tegenstelling tot oplosbare eiwitten, integrale membraaneiwitten zijn ingebed in de lipide bilaag en duseisen detergentia uitpakken voor verdere zuivering en analyse (figuur 5). Na expressie, de eerste stap bij de zuivering van een β-barrel OMP is extractie van de membraanfractie.
    1. Resuspendeer cellen in lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I) in een verhouding van 5 ml / g celpasta.
    2. Lyse van de cellen met behulp van een Franse pers of cel homogenisator. Spin de gelyseerde cellen bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om niet-gelyseerde cellen en celresten te verwijderen.
    3. Breng de supernatant naar een schone buis en centrifugeer weer met hoge snelheid (200.000 x g) gedurende 1 uur bij 4 ° C. De resulterende pellet is de membraanfractie die het gewenste eiwit bevat.
    4. Met behulp van een Dounce homogenisator resuspendeer de membraanfractie eerst overbrengen van de membranen en vervolgens het toevoegen oplosbuffer (50 mM KH 2PO 4 pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM imidazool, PH 8,0) (50 ml per 20 g cellen) en 2x concentratie zonder detergens.
    5. Giet de geresuspendeerde membranen in een klein bekerglas en wasmiddel (bijvoorbeeld n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), lauryldimethylamine-N-oxide (LDAO), n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG), Triton X-100, etc.) langzaam tot een uiteindelijke concentratie van ~ 10x kritische micel concentratie (CMC).
    6. Vul met water tot een uiteindelijke concentratie van 1x Oplossen buffer. Roer gedurende 0,5-16 uur bij 4 ° C, afhankelijk van het gemak waarmee het doeleiwit wordt gewonnen uit de membranen.
      Noot: Detergent wordt gebruikt om langzaam oplosbaar de membranen om het doeleiwit te extraheren. Er zijn 3 soorten wasmiddelen die hier kunnen worden gebruikt: ionische (SDS, deoxycholinezuur), niet-ionische (Elugent, TWEEN, Triton X-100, OG, DDM), en zwitterionische (LDAO, CHAPS). Een eiwit-detergens complex dat stabiel en monodispers is tijdens de zuiveringsstap wordt sterk helpen bij het succes membraaneiwit krision. Meer informatie over detergentia, hun eigenschappen, CMC informatie en hun gebruik bij de zuivering van membraaneiwitten en andere toepassingen zijn te vinden op commerciële leveranciers websites.
    7. Centrifugeer de opgeloste monster bij 300.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Het supernatant bevat nu de detergens gesolubiliseerde doel β-barrel OMP.
    8. Ga verder met paragraaf 2.3 zoals hieronder beschreven.
  2. Hervouwing uit Inclusion Bodies
    Opmerking: Voor in vitro opnieuw vouwen, het doel β-barrel OMP wordt rechtstreeks uitgedrukt in inclusielichamen. Een voordeel is dat deze eiwitten kunnen worden geproduceerd hoog. Maar het nadeel is dat het opnieuw vouwen vaak inefficiënt en verschilt van hervouwing experiment naar de volgende. Toch zijn er veel voorbeelden van eiwitten die met succes hervouwen voor structurele studies. Na expressie in inclusielichamen moet men nu de inclusielichamen voor hervouwing experiment isolerens.
    1. Resuspendeer cellen in lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I, 4 mM 2-mercaptoethanol (BME)) (5 ml per g celpasta). Lyse behulp van een Franse pers, sonificatie of cel homogenisator.
    2. Pellet de inclusielichamen met een lage snelheid centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    3. Was de inclusielichamen door resuspenderen in 25 ml van 1,0 M ureum met een dounce homogenisator. Pellet opnieuw met een lage snelheid centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    4. Herhaal stap 2.2.3 nodig.
    5. Resuspendeer de gewassen inclusielichamen tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml middels buffer bevattende 8,0 M ureum (of 6,0 M guanidine hydrochloride (GdCl)) plus detergens (bijv DDM of LDAO) en 2x CMC of hoger.
      Opmerking: Indien gewenst, membraaneiwit targets die een histidine tag, kan geïmmobiliseerde metaal affiniteitschromatografie (IMAC) zuivering worden uitgevoerd met behulp denaturerende conditions (in 8,0 M ureum of 6,0 M GdCl) als een eerste stap vergelijkbaar met die hieronder beschreven in paragraaf 2.3.
    6. Voer de hervouwingsreactie door langzaam (gedurende de nacht) het verwijderen van het denaturerende door dialyse in buffer zonder het denatureringsmiddel.
      Opmerking: het kan een aantal wijzigingen van de dialyse buffer te nemen om dit te bereiken. Een defect inclusielichamen eerst worden gebonden aan een IMAC kolom, kan de hervouwingsreactie doen terwijl aan de kolom gebonden door langzaam wisselen buffers aan het denatureringsmiddel te verwijderen. In beide gevallen geldt dat dit een membraaneiwit moeten daarom detergens om het doel te stabiliseren. Ook als het afwasmiddel gebruikt wordt gedialyseerd, moet worden aan de dialyse buffer (fen) toegevoegd.
    7. Draai het hervouwen monsters bij 200.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Het supernatant bevat het hervouwen detergens gesolubiliseerde doel β-barrel OMP.
    8. Ga verder met paragraaf 2.3 zoals hieronder beschreven.
  3. Zuivering met behulp van IMAC, Ion-Exchange en Gel Filtration
    Opmerking: Uitgaande van het eiwit is ontworpen met een histidine tag, of native uitgedrukt of hervouwen toepassing van in vitro werkwijzen, vervolgens geïmmobiliseerd metaal affiniteitschromatografie (IMAC) wordt uitgevoerd voor het zuiveren net als voor histidine tag oplosbare eiwitten, behalve detergens worden bewaard alle volgende buffers om de doelstelling β-barrel OMP oplosbaar en stabiel.
    1. Bereid een ml IMAC kolom 1-5 of gebruik een voorverpakte kolom. Opeenvolgende chromatografiestappen bij 4 ° C. Spoelen met water om alle sporen van conserveringsmiddelen verwijderen. Bij gebruik van een geautomatiseerd zuiveringssysteem, installeert de kolom volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Bereid 500 ml van IMAC buffer A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) en 250 ml van IMAC buffer B (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM en 1,0 M imidazool).
      Opmerking: andere detergenten die ik kan worden gebruiktnclude cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%) en LDAO (0,05%).
    3. Equilibreren de IMAC kolom met 10 kolomvolumes buffer A. IMAC
    4. imidazool toevoegen eiwitmonster tot een eindconcentratie van 25 mM en meng. Plaats het monster op de geëquilibreerde IMAC kolom bij 2 ml / min. Verzamel de doorstroming.
    5. Was de kolom IMAC met 5 kolomvolumes elk van toenemende concentraties imidazool gebruik buffer B (bijvoorbeeld 25 mM, 50 mM, 100 mM). Verzamel de wassingen in 2 ml fracties.
    6. Elueer het monster met een eindconcentratie van 250 mM voor 5 kolomvolumes. Verzamel de geëlueerde monster in 2 ml fracties.
    7. Analyseer door middel van de stroom, het wassen fracties en de elutie fracties middels SDS-PAGE-analyse (zie stap 1.2.6) op basis van hun absorptie bij 280 nm. Verzamel de fracties die het doelwit β-barrel OMP bevestigd door SDS-PAGE-analyse.
    8. Verwijder de 6x-histidine tag door het toevoegen van TEV protease aan de samengevoegde monster (volgenshet protocol van de fabrikant) en incubatie overnacht bij 4 ° C met zachte wiegen.
    9. Laad het monster / protease-oplossing op een IMAC kolom weer om de doelstelling β-barrel OMP scheiden (doorstroming) van de gesplitste labels en eventuele ongesplitste monster. De stroming door de gesplitst monster ontbreekt de tag bevatten.
      Opmerking: Dit zou ook eventuele protease te verwijderen, zoals TEV-His, die ook een niet-splitsbaar 6x-histidine tag zelf. Anders zullen andere werkwijzen nodig om de protease na digestie verwijderen.
    10. Eventueel voeren ionenuitwisseling chromatografie om het monster verder te zuiveren. De instructies van de fabrikant voor de kolom te gebruiken, waarbij u detergens omvatten alle buffers.
    11. Ter voorbereiding van kristallisatie, laadt het monster op een gelfiltratiekolom in een buffer die het detergens te gebruiken voor kristallisatie, zoals 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1% OG.
    12. Verzamel 1 ml fracties en USI analyserenng SDS-PAGE-analyse (zie Stap 1.2.6) op basis van hun absorptie bij 280 nm. Zwembad fracties met absorpties bij 280 nm en ze bevatten het doeleiwit. Concentreer tot ~ 10 mg / ml.
      Opmerking: Desgewenst kan juiste vouwing worden beoordeeld met behulp van een warmte aanpasbaarheid test zoals hieronder beschreven.
  4. Heat aanpasbaarheid Assay
    Opmerking: Een methode om juiste vouwing van gezuiverd β-barrel OMP is om warmte aanpasbaarheid assays onder toepassing van een semi-natieve SDS-PAGE 22 voeren bewaken. Hier vindt onverwarmde monsters die goed zijn gevouwen meestal migreren anders degenen die warmte zijn gedenatureerd. Deze eigenschap is uniek voor P-barrel OMP en op grote schaal gebruikt om deze familie van membraaneiwitten te bestuderen.
    1. Voorafgaand aan de voorbereiding van monsters, de montage van de gel apparaat. Om te beginnen, plaats de buffertank in een ijsemmer en omringen volledig met ijs. Plaats een intern gegoten of commerciële natieve gradient gel in de houder en plaats in de tank. Vul tHij tank volledig met koud 1x MES loopbuffer (50 mM 2- [N-morfolino] ethaansulfonzuur, 50 mM Tris base, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,3).
    2. Pipetteer 0,25 ul van het monster (10 mg / ml) in twee 1,5 ml microcentrifugebuizen. Label een als "gekookte" en de andere als "RT".
    3. Voeg 9,75 ul van het monster buffer aan elke en meng door pipetteren. Om beide monsters, voeg 10 ul 2x SDS-laadbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% broomfenol blauw en 20% glycerol) en meng voorzichtig door pipetteren.
    4. Kook de 'gekookte' monster bij 95 ° C gedurende 5 minuten terwijl het monster 'RT' bij RT. Draai de 'gekookte' sample kort.
    5. Belasting 20 pi van beide monsters op de voorgemonteerde inheemse gel. Looptijd van 60 minuten bij 150 V constant Verwijder de gel en geniet in kleuroplossing om de resultaten te visualiseren.

3. Kristallisatie

Opmerking: Voor de kristallisatie van beideoplosbaar en membraan eiwit targets, is het standaard protocol om sample zuiverheid en stabiliteit (dat wil zeggen, beste wasmiddel, liganden, co-factoren, etc.) te maximaliseren. Huidige methoden voor het kristalliseren membraaneiwit targets algemeen omvat drie belangrijke benaderingen die voldoen aan de amfifiele eisen van bilaag ingebedde eiwitten: (1) detergens, (2) Bicelle, en (3) lipide kubische fase (LCP) (figuur 6) 23. Toepassing van een nanoliter kristallisatie robot wordt sterk aanbevolen indien mogelijk om het aantal aandoeningen die kunnen worden gescreend op een gegeven monstervolume, evenals gebruikmaking recente vooruitgang in instrumenten ter beschikking waarmee struktuurbepaling (figuur 7) helpen verhogen.

  1. Kristallisatie met behulp van Wasmiddelen
    1. Verkrijgen van een detergens gesolubiliseerde eiwit monster dat bij ~ 10 mg / ml concentratie. Eventueel deze direct het additief 1,2,3-heptanetriol het monster tot een eindconcentratie van 3% te verlagen producent micel grootte.
    2. Filter het monster met behulp van een 0,22 pm centrifugaal filter om deeltjes en neerslag te verwijderen.
    3. Met behulp van een kristallisatie robot, voert brede matrix kristallisatie screening met in de handel verkrijgbaar 96 en schermen door een hangende of zittend druppel verdamping methode met druppels bestaat uit ~ 200 nl eiwit monster en ~ 200 nl kristallisatie buffer.
    4. Incubeer de platen bij kristallisatie ~ 21 ° C. Inspecteer de platen per week gedurende kristalgroei met behulp van een stereomicroscoop.
    5. Optimaliseren leads kristallisatie door het variëren van de componenten kristallisatie toestand op systematische wijze (verhogen / verlagen zout of neerslagmiddel concentratie, pH, incubatietemperatuur en / of eiwitconcentratie).
  2. Met behulp van kristallisatie Bicelles
    Opmerking: Een meer gedetailleerde demonstratie van Bicelle technieken is eerder beschreven door Ujwal Abramson en 24.
    1. Bereid of aankoop van een 35% Bicelle mengsel bestaande uit DMPC: CHAPSO in een verhouding van 2,8: 1 volgens gepubliceerde protocollen 25. Andere concentraties kunnen worden bepaald, evenals andere lipiden en detergenten, indien nodig.
    2. Verkrijgen van een detergens gesolubiliseerde eiwit monster dat bij ~ 10 mg / ml concentratie.
    3. Voeg de Bicelle mengsel op ijs bij een beginnend verhouding van 4: 1 v / v (eiwit: Bicelle) (bijvoorbeeld, voeg 10 pl Bicelle mengsel 40 pl proteïne en meng snel door pipetteren).
    4. Incubeer op ijs 30-60 min.
      Opmerking: Het eiwit: Bicelle oplossing moet vooral helder blijven, maar kan blijken vaak enigszins ondoorzichtig. Indien het eiwit: Bicelle omslaat melkwit, precipitatie aangeeft, dan kunnen andere variabelen worden getest (bijv detergens, buffer, etc.). Voor nieuwe monsters, het doen van kleine schaal testen (8 ul-eiwit en 2 pl bicelles) wordt aanbevolen om de stabiliteit te controleren voorafgaand aan de opschaling naar onnodige monster verlies te voorkomen.
    5. Met behulp van een kristallisatie robot, voert brede matrix kristallisatie screening met in de handel verkrijgbaar 96 en schermen door een hangende of zittend druppel verdamping methode met druppels bestaat uit ~ 200 nl eiwit monster en ~ 200 nl kristallisatie buffer.
    6. Incubeer de platen bij kristallisatie ~ 21 ° C. Inspecteer de platen per week gedurende kristalgroei met behulp van een stereomicroscoop.
    7. Optimaliseren leads kristallisatie door het variëren van de componenten kristallisatie toestand op systematische wijze (verhogen / verlagen zout of neerslagmiddel concentratie, pH, incubatietemperatuur en / of eiwitconcentratie).
  3. Met behulp van kristallisatie lipidische Cubic Phase (LCP)
    Opmerking: Een meer gedetailleerde demonstratie van LCP technieken is eerder beschreven door Liu en Cherezov 26,27.
    1. Verkrijgen van een detergens gesolubiliseerde eiwit monster dat bij ~ 20 mg / ml concentratie.
    2. Pre-warm de monooleïne tot ~ 40 ºC. Laden60 ul-oleïne in een gasdichte 100 ul spuit en 40 ul eiwit monster in een andere.
    3. Met behulp van een mengen koppeling, sluit de spuiten, dat evenwel niet tot de lucht te introduceren.
    4. Meng voorzichtig door het toepassen afwisselend druk op de spuit plunjers duwen het mengsel van de ene spuit naar de andere volledig totdat het monster doorschijnend en homogeen.
    5. Met behulp van een kristallisatie robot ontworpen voor LCP methoden uit te voeren brede matrix kristallisatie screening met in de handel verkrijgbaar 96 en schermen met sandwich-stijl kristallisatie platen (0,1 mm en dikte) met druppels bestaat uit 100 nl eiwit monster en 750 nl kristallisatie buffer.
      Opmerking: Drop-verhoudingen kan worden aangepast indien nodig. Ook vaste dekking (dwz, glas of dikke plastic) aanbevolen waarbij de druppels mooi dan dunne films, die de neiging om de druppels te bewegen de en de platen worden afgehandeld ondersteunen.
    6. Incubeer de kristallisatie plates bij ~ 21 ° C. Inspecteer de platen per week gedurende kristalgroei met behulp van een stereomicroscoop.
    7. Optimaliseren leads kristallisatie door het variëren van de componenten kristallisatie toestand op systematische wijze (verhogen / verlagen zout of neerslagmiddel concentratie, pH, incubatietemperatuur en / of eiwitconcentratie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YiuR een TonB afhankelijk ijzer transporter die een vermeende vaccin doelgroep tegen Yersinia pestis. Het werd oorspronkelijk geïdentificeerd met behulp van een microarray analyse. Hier zijn de stappen die werden genomen om de structuur van YiuR bepalen met X-ray kristallografie worden geschetst (Figuur 9). Voor klonering van de DNA-sequentie YiuR (minus het N-eindstandige signaalsequentie) werd PCR geamplificeerd uit genomisch DNA en gesubkloneerd in een vector...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-barrel OMP dienen een essentiële rol in Gram-negatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten en zijn belangrijke doelen voor structurele analyse die een schat aan informatie over wezenlijke moleculaire mechanismen die aan de buitenste membranen van deze respectieve organellen bieden. Echter produceert genoeg monster voor structurele analyse is niet altijd eenvoudig en daarom wordt een algemene pijpleiding gepresenteerd voor de productie van voldoende hoeveelheden doelwit β-barrel OMP's voor structuurbepaling, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Herve Celia van de CNRS bedanken voor het verstrekken van de UV-beelden en Chris Dettmar en Garth Simpson in het Department of Chemistry aan de Purdue University voor het verstrekken van de SONICC-beelden. We willen de financiering erkennen van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases en het Intramural Research Program bij de National Institutes of Health. Daarnaast willen we extra financiering erkennen van het National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. en C.J.), het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), en het Department of Biological Sciences aan de Purdue University (N.N.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Crystallization RobotTTP Labtech, Art Robbins-Elk wat zou hier moeten werken, behalve LCP-kristallisatie
PCR thermocyclerEppendorf, BioRad-
Media ShakerNew Brunswick, Infors HT-
UV-vis spectrometerEppendorf-
SDS-PAGE apparaatBioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE en native gelsBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGE Healthcare-
AkTA PurifierGE Healthcare-
MicrocentrifugeEppendorf-
Centrifuge (lage-middelhoge snelheid)Beckman-Coulter-
Ultracentrifuge (hoge snelheid)Beckman-Coulter-
SS34 rotorSorvall-
Type 45 Ti rotorBeckman-Coulter-
Type 70 Ti rotorBeckman-Coulter-
Dounce homogenisatorFisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-
DialysebuisSigmaD9652
LCP gereedschappenHamilton, TTP Labtech-
VDX 24 wel plaatjesHampton ResearchHR3-172
Sandwich plaatjesHampton Research, Molecular DimensionsHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Kristallisatie vellenGrace Bio-Labs875238
HiPrep S300 HR kolomGE Healthcare17-1167-01
Q-Sepharose kolomGE Healthcare17-0510-01
Kristallisatie schermenHampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions-
Gas-tight spuit (100 ml)Hamilton 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383(2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000(2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377(2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510(2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

B ta barrel buitenmembraaneiwittenOMP expressie en zuiveringT7 expressievectorBL21 DE3 transformatieIPTG inductieSDS PAGE analyseIMAC zuiveringTEV protease splitsinggelfiltratiechromatografiekristallisatieproeven

Gerelateerde artikelen