Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van uitgesneden darmweefselpreparaten of 'darmzakken' als een ex vivo model van de darmwandfunctie. Dit model kan worden gebruikt om de integriteit van zowel de epitheliale barrière als de slijmvlieglaag op specifieke darmlocaties in diermodellen van spijsverteringsziekten te beoordelen.

Samenvatting

De epitheliale barrière de eerste aangeboren verdediging van het maagdarmkanaal en selectief regelt vervoer van het lumen aan het onderliggende weefsel compartimenten, beperkt het transport van kleine moleculen door het epitheel en bijna volledig verbod epitheliale macromoleculaire transport. Deze selectiviteit wordt bepaald door het slijmvlies gellaag, die het transport van lipofiele moleculen en zowel de apicale receptoren en strak junctional eiwitcomplexen van het epitheel beperkt. In vitro celcultuur modellen van het epitheel zijn handig, maar als voorbeeld, ze missen de complexiteit van de interacties tussen de microbiota, slijm-gel, epitheel en het immuunsysteem. Anderzijds kan in vivo evaluatie van intestinale absorptie of permeabiliteit worden uitgevoerd, maar deze assays meten totale gastrointestinale absorptie, zonder vermelding van plaatsgebondenheid. Ex vivo permeabiliteit assays met "intestinale sacs"; een snelle en gevoelige werkwijze voor het meten ofwel globaal intestinale integriteit of vergelijkende transport van een specifiek molecuul, met het extra voordeel van intestinale plaatsgebondenheid. Hier beschrijven we de bereiding van intestinale zakjes op doorlatendheid studies en de berekening van de schijnbare permeabiliteit (P _app) van een molecuul in de darmwand. Deze techniek kan worden gebruikt als een methode voor de absorptie of regionale epitheliale barrière disfunctie in dierlijke modellen van gastro-intestinale aandoeningen te onderzoeken.

Inleiding

De intestinale epitheliale barrière van het maagdarmkanaal is een mucosaal oppervlak geraamd op 400 m ² in de volwassen mens. Derhalve wordt voortdurend blootgesteld aan uitdaging van microben, opgenomen geneesmiddelen, nutriënten en bacteriële toxines. De host moet niet alleen onderscheid maken tussen het aanvaardbare commensale bacteriën en potentiële pathogenen, maar beletten dat deze soorten en hun uitgescheiden moleculen die de epitheliale barrière, terwijl tegelijkertijd waardoor opname van voedingsstoffen. Zo is de rol van het darmepitheel is om als een selectieve barrière voor het luminale inhoud ^1. Dit gebeurt in hoofdzaak door de epith....

Protocol

Alle dierlijke werk op dit protocol wordt uitgevoerd met strikte naleving van de Universiteit van Newcastle Animal Ethics Committee goedgekeurde procedures.

1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur en Media Dishes

1. Voorverwarmen Media 199 (TC199) of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) pers 37 ° C. Pre-oxygenaat het medium door doorborrelen met _95% O2 / 5% _CO2. Controleer of het medium een ​​uiteindelijke pH van 7,3.
2. Bereid hechtdraad door het snijden van twee 5 cm secties voor elke zak. Loop de hechtingen in een ongesloten knoop.

2. Dissec....

Resultaten

Dit protocol kan worden gebruikt om de regionale veranderingen in de intestinale barrièrefunctie in diermodellen van gastro-intestinale aandoeningen te onderzoeken. Door meting van de flux van een paracellulaire probe over het mucosale oppervlak op verschillende gebieden van het maagdarmkanaal ^7, kan de integriteit van de epitheliale tight junctions worden beoordeeld. Bovendien, door het variëren van de aard van de paracellulaire probe op grootte (figuur 2) of.......

Discussie

Hier hebben we de isolatie en bereiding van intestinale zakjes gedetailleerde mucosale barrièrefunctie ex vivo te beoordelen. Intestinale sac voorbereidingen zijn in de eerste plaats zijn gebruikt in het farmaceutisch onderzoek, onderzoek naar de absorptie van kandidaat medicijnen over de darm. Echter, deze test even goed geschikt voor de studie van darmziekten. Darmdoorlaatbaarheid kan sterk verschillen per regio en site-specifieke beoordeling van de permeabiliteit zorgt voor een beter begrip van het regionale.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dekantel  Non-absorbable Silk suture	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)	Life Technologies	11043-023	Geen fenolrode kleurstof omdat deze interfereert met fluorescentie
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	21063-045	Geen fenolrode kleurstof omdat deze interfereert met fluorescentie
N-acetylcysteïne	Sigma Aldrich		Gebruik bij 10 mM in media
Vasculair katheter voor kleine dieren: Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-Dextran 4.400 MW	Sigma Aldrich	FD-4
FITC-Dextran 20.000 MW	Sigma Aldrich	FD-20
FITC-Dextran 70.000 MW	Sigma Aldrich	FD-70