Dit protocol beschrijft het gebruik van uitgesneden darmweefselpreparaten of 'darmzakken' als een ex vivo model van de darmwandfunctie. Dit model kan worden gebruikt om de integriteit van zowel de epitheliale barrière als de slijmvlieglaag op specifieke darmlocaties in diermodellen van spijsverteringsziekten te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De epitheliale barrière de eerste aangeboren verdediging van het maagdarmkanaal en selectief regelt vervoer van het lumen aan het onderliggende weefsel compartimenten, beperkt het transport van kleine moleculen door het epitheel en bijna volledig verbod epitheliale macromoleculaire transport. Deze selectiviteit wordt bepaald door het slijmvlies gellaag, die het transport van lipofiele moleculen en zowel de apicale receptoren en strak junctional eiwitcomplexen van het epitheel beperkt. In vitro celcultuur modellen van het epitheel zijn handig, maar als voorbeeld, ze missen de complexiteit van de interacties tussen de microbiota, slijm-gel, epitheel en het immuunsysteem. Anderzijds kan in vivo evaluatie van intestinale absorptie of permeabiliteit worden uitgevoerd, maar deze assays meten totale gastrointestinale absorptie, zonder vermelding van plaatsgebondenheid. Ex vivo permeabiliteit assays met "intestinale sacs"; een snelle en gevoelige werkwijze voor het meten ofwel globaal intestinale integriteit of vergelijkende transport van een specifiek molecuul, met het extra voordeel van intestinale plaatsgebondenheid. Hier beschrijven we de bereiding van intestinale zakjes op doorlatendheid studies en de berekening van de schijnbare permeabiliteit (P app) van een molecuul in de darmwand. Deze techniek kan worden gebruikt als een methode voor de absorptie of regionale epitheliale barrière disfunctie in dierlijke modellen van gastro-intestinale aandoeningen te onderzoeken.
Inleiding
De intestinale epitheliale barrière van het maagdarmkanaal is een mucosaal oppervlak geraamd op 400 m 2 in de volwassen mens. Derhalve wordt voortdurend blootgesteld aan uitdaging van microben, opgenomen geneesmiddelen, nutriënten en bacteriële toxines. De host moet niet alleen onderscheid maken tussen het aanvaardbare commensale bacteriën en potentiële pathogenen, maar beletten dat deze soorten en hun uitgescheiden moleculen die de epitheliale barrière, terwijl tegelijkertijd waardoor opname van voedingsstoffen. Zo is de rol van het darmepitheel is om als een selectieve barrière voor het luminale inhoud 1. Dit gebeurt in hoofdzaak door de epitheliale aangeboren afweersysteem op het slijmvlies, die door een reagerend biologisch systeem bestaande uit constitutieve en induceerbare mechanismen 2 optreedt.
Verlies van epitheliale barrièrefunctie een pathologie die kenmerkend is voor een aantal gastro-intestinale ziekten. In vivoonderzoek van epitheliale barrièrefunctie kan worden beoordeeld door middel van orale sondevoeding van een tracer molecule en daaropvolgende serum analyse 3. Deze techniek geeft geen indicatie van de plaats van barrière disfunctie. In vitro en ex vivo bepaling van transepithele weerstand gebruik Transwell systemen 3 respectievelijk Ussing kamers 4,5, worden gewoonlijk gebruikt als surrogaat markers van epitheliale barrièrefunctie, maar missen de bijdragende ziekte fysiologie van diermodellen 6. In dit protocol beschrijven we een ex vivo model weefselbereiding die direct en gelokaliseerde evaluatie van intestinale integriteit en die kunnen worden gebruikt om mucosale barrièrefunctie beoordeeld op meerdere niveaus mogelijk maakt. Belangrijk is dat deze techniek worden toegepast op diermodellen voor de ziekte, of kan farmacologisch worden gemanipuleerd om grondig afvragen van mucosale barrière disfunctie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke werk op dit protocol wordt uitgevoerd met strikte naleving van de Universiteit van Newcastle Animal Ethics Committee goedgekeurde procedures.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur en Media Dishes
- Voorverwarmen Media 199 (TC199) of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) pers 37 ° C. Pre-oxygenaat het medium door doorborrelen met 95% O2 / 5% CO2. Controleer of het medium een uiteindelijke pH van 7,3.
- Bereid hechtdraad door het snijden van twee 5 cm secties voor elke zak. Loop de hechtingen in een ongesloten knoop.
2. Dissection en voorbereiding van het maagdarmkanaal
- Terugtrekken vast voedsel 12 uur voor euthanasie. Desgewenst plaatst dieren voedende gel supplementen gedurende deze tijd.
- Euthanaseren muizen door natriumpentobarbiton overdosering ([200 mg / kg], intraperitoneale injectie), gevolgd door cervicale dislocatie overeenkomstig institutionele ethische protocols en spuit 70% ethanol op de buik en borst.
- Met behulp van een schaar, maken een horizontale incisie in het midden van de buik en bloot het buikvlies.
- Ga verder te scheiden en het verwijderen van het maagdarmkanaal door het snijden van de bovenste dunne darm van de maag naar de pyloric sluitspier en het snijden van de dikke darm bij de anus. Gebruik een tang om verwijder voorzichtig het mesenterium. Plaats het darmkanaal in voorverwarmde, geoxygeneerd medium.
- Identificeer de sectie darm worden beoordeeld op doorlatendheid (figuur 1) en knip dit gedeelte los van de rest van het darmkanaal.
- Om de samenhang tussen de dieren te behouden, delen van de twaalfvingerige darm en jejunum opzichte meten aan de maag, en secties van de dikke darm en de dunne darm ten opzichte van te meten aan de blindedarm.
- Bij het selecteren weefselsegmenten, let op de aanwezigheid van mucosa geassocieerde lymfoïde weefsels zoals plaques van Peyer. Deze kunnen worden geïdentificeerd als klein knikjedules aan de serosale zijde van het lumen.
- Met behulp van een 1 ml injectiespuit voorzichtig spoelen van de luminale inhoud van de intestinale segment in een petrischaal met voorverwarmde PBS (37 ° C). Deze fecale inhoud kan worden weggegooid of opgeslagen bij -80 ° C voor verdere analyse zoals gewenst.
3. Bereiding van intestinale Sacs
- Bereid een 1 ml spuit met een 300 ui volume van de testverbinding of molecuul. Voor mucosale integriteit, een 1 mg / ml oplossing van FITC-Dextran M.Wt. 4400 kan worden gebruikt. Probes variërend van 4,400-70,000 Da in grootte kan worden gebruikt voor verhoogde gevoeligheid. Veilig te passen een klein dier vasculaire katheter op de injectiespuit.
- Maatregel 5 cm vanaf de opening van de intestinale segment en bind het segment stevig afgesloten met een hechting-loop op dit punt. Plaats voorzichtig een vooraf gebonden hechting-lus rond de opening van de darm en plaats de afgestompte katheter. Trek de strop gesloten om de intestinale segment beveiligenen laat de 300 ui volume van de spuit in de darm die op de oplossing wordt geïnjecteerd.
- Verwijder voorzichtig de catheter tegelijkertijd trekt de hechtdraad strop om de sluiting van de intestinale zak te beveiligen. Snijd de intestinale zak los van de darm en plaats in een 50 ml conische buis gevuld met 20 ml van geoxygeneerd medium, voorverwarmd tot 37 ° C.
4. Meting van de doordringbaarheid
- Plaats conische buisjes met de intestinale zakjes in een verwarmd waterbad ingesteld op 37 ° C. Op 0, 30, 60, 90 en 120 min tijdstippen raadpleeg 100 pi monster van de conische buis overgebracht in een plaat met 96 putjes, het volume 100 ul vers medium telkens vervangen.
- Na het eindmonster genomen opengesneden zakken op de plaats van hechting en de lengte van het segment, het blootstellen van het slijmvliesoppervlak.
- Meet de lengte en breedte van elk darmsegment. Als desirood, snap bevriezen de segmenten en bewaar bij -80 ° C voor het eiwit of biochemische analyse, of als alternatief, op te slaan in RNA stabilisatie oplossing voor moleculaire testen.
- Construct een standaard curve van log verdunningen FITC-gemerkte moleculen van 1 tot 1 x 10 -6.
- Meet monsters en standaarden voor FITC op een fluorescerende plaat lezer, FITC excitatie / emissie: 495 nm / 519 nm.
5. Berekening van de schijnbare permeabiliteit voor elk individu Intestinal Sac
- Omzetten tijdseenheden naar sec.
- Voor elk tijdstip, bereken de cumulatieve concentratie Q
Q t = (C t * r V) + (Qt som * Vs) Waar:
Q t = Cumulatieve concentratie op tijdstip t
Ct = concentratie op tijdstip t
Vr = Volume aan ontvangerzijde
Q t som = som van alle voorgaande Q t
Vs =Volume bemonsterd - Plot Q versus tijd (T) en het berekenen van de helling: AQ / At
- Bereken de schijnbare permeabiliteit (P app)
P app = (AQ / AT) / (A * Co), Waar:
A = Oppervlak van weefsel
C 0 = Beginconcentratie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol kan worden gebruikt om de regionale veranderingen in de intestinale barrièrefunctie in diermodellen van gastro-intestinale aandoeningen te onderzoeken. Door meting van de flux van een paracellulaire probe over het mucosale oppervlak op verschillende gebieden van het maagdarmkanaal 7, kan de integriteit van de epitheliale tight junctions worden beoordeeld. Bovendien, door het variëren van de aard van de paracellulaire probe op grootte (figuur 2) of...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier hebben we de isolatie en bereiding van intestinale zakjes gedetailleerde mucosale barrièrefunctie ex vivo te beoordelen. Intestinale sac voorbereidingen zijn in de eerste plaats zijn gebruikt in het farmaceutisch onderzoek, onderzoek naar de absorptie van kandidaat medicijnen over de darm. Echter, deze test even goed geschikt voor de studie van darmziekten. Darmdoorlaatbaarheid kan sterk verschillen per regio en site-specifieke beoordeling van de permeabiliteit zorgt voor een beter begrip van het regionale...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 en een Hunter Medical Research Institute-subsidie gesponsord door Sparke Helmore/NBN Triathlon en de Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | Geen fenolrode kleurstof omdat deze interfereert met fluorescentie |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | Geen fenolrode kleurstof omdat deze interfereert met fluorescentie |
| N-acetylcysteïne | Sigma Aldrich | Gebruik bij 10 mM in media | |
| Vasculair katheter voor kleine dieren: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4.400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20.000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70.000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
Referenties
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272(2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
