Een geoptimaliseerde werkwijze voor het isoleren en Expanding Invariant Natural Killer T-cellen van Mouse Spleen

Samenvatting

Hier presenteren we een aangepast protocol dat kan worden gebruikt om een groot aantal muisinvariante natuurlijke killer-T-cellen uit de muizenmilt te genereren. Het protocol schetst een benadering waarmee splenkachtige iNKT-cellen kunnen worden verrijkt, geïsoleerd en in vitro uitgebreid met behulp van een beperkt aantal dieren en reagentia.

Samenvatting

De mogelijkheid om snel cytokinen na stimulatie is een functioneel kenmerk van invariante natuurlijke killercellen (iNKT) cellijn. iNKT cellen worden ook gekenmerkt als een aangeboren T-cel populatie kan activeren en sturen adaptieve immuunreacties. De ontwikkeling van verbeterde technieken voor het kweken van murine en uitbreiding iNKT cellen vergemakkelijkt de studie van iNKT celbiologie in in vitro en in vivo modelsystemen. Hier beschrijven we een optimale procedure voor de isolatie en expansie van muizen milt iNKT cellen.

Milt van C57BL / 6 muizen worden verwijderd en ontleed gespannen en de resulterende celsuspensie wordt gelaagd over dichtheidsgradiënt media. Na centrifugatie worden de milt mononucleaire cellen (MNC's) verzameld en CD5-positieve (CD5 ⁺⁾ lymfocyten worden verrijkt via magnetische partikels. iNKT cellen in de CD5 ⁺ fractie worden vervolgens gekleurd met ^5, GalCer-geladen CD1d tetrameer en gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). FACS gesorteerd iNKT cellen worden vervolgens aanvankelijk gekweekt in vitro onder toepassing van een combinatie van recombinant muriene cytokines en plaat-gebonden T-celreceptor (TCR) stimuli voordat uitgebreid in de aanwezigheid van recombinant murine IL-7. Met deze techniek ongeveer 10 ⁸ iNKT cellen kunnen worden gegenereerd binnen 18-20 dagen kweek, waarna ze kunnen worden gebruikt voor functionele assays in vitro of in vivo overdracht experimenten bij muizen.

Inleiding

Muizen onveranderlijke natural killer T (iNKT) cellen zijn een afzonderlijke populatie van aangeboren T-lymfocyten geselecteerd in de thymus door-CD1d uiten corticale thymocyten ^1,2. iNKT cellen brengen een T cel receptor (TCR) bestaande uit een invariant Vα14 Jα18 TCR-keten gecombineerd met ofwel Vβ8, Vβ7 of Vβ2 TCR ^3, dat in staat is te herkennen endogene en buitenlandse lipide antigenen in de context van CD1d. Bijvoorbeeld, muizen iNKT cellen herkennen en worden geactiveerd door een endogene lipiden antigen isoglobotrihexosylceramide (iGb3) ^4, en α-galactosylceramide (αGalCer) ^5,6, een glycolipide geïsoleerd uit mariene sponzen. TCR-activatie van iNKT cellen bevordert priming van adaptieve immuunreacties, en als gevolg daarvan zijn iNKT cellen aangetoond functioneel betrokken bij de verbetering of ontwikkeling van verschillende ziekten waaronder reumatische ziekten en kanker ^{7 8. Momenteel, synthetische iNKT cellen liganden vormen veelbelovende vaccin adjuvantia die kunnen reguleren meerdere immuunpathologische aandoeningen kunnen zijn.}

Er is eerder aangetoond dat iNKT cellen kunnen worden gegenereerd in vitro na isolering uit muizen weefsel echter; veel van deze studies met het gebruik van primaire antigeen presenterende cellen (APC's) en / of cellijnen ^9, Vα14 TCR transgene (Tg) muizen ¹⁰ of thymomen voor het genereren van iNKT cellen afgeleide hybridomen ^11,12. Bovendien, grote aantallen muizen, grote hoeveelheden reagentia zoals αGalCer geladen CD1d dimeren en langdurige cultuur tijden maken een aantal gepubliceerde protocollen minder ethisch en economisch aantrekkelijk ^9,13.

In dit rapport beschrijven we een aangepaste methode voor de isolatie en in vitro expansie van iNKT cellen uit muizen milt. Meer specifiek protocol beschrijft een werkwijzevoor het verrijken van iNKT cellen uit muizen milt waar de muizen, reagentia en tijd vereist voor FACS-celsortering vermindert, en stelt een geoptimaliseerde aanpak voor het uitbreiden gesorteerde milt iNKT cellen in vitro.

Protocol

In deze studie werden volwassen (6-8 weken) vrouwelijke C57BL / 6-muizen gebruikt. Muizen werden gehuisvest en gefokt volgens de richtlijnen van de Universiteit Gent terrarium. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en de ethische commissie.

1. Bereiding van mononucleaire cellen (MNC) van Mouse Spleen

1. Offer de muis door cervicale dislocatie.
2. Plaats de muis terug naar beneden op het ontleden bord en bevestig de achterpoten en de voorpoten met pinnen.
3. Steriliseer de huid oppervlak met 70% (vol / vol) ethanol / _H2O
4. Snijd de huid langs de buik middellijn op de thorax en de milt bloot met steriele chirurgische instrumenten.
5. Na het trimmen het omringende vetweefsel, plaatst de milt in een 24 wells plaat met 1 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur.
6. Ontleden de milt met een steriele scalpel en de overdracht van de stukken in een 70 um nylon filter geplaatst in een 50 ml bade.
7. Met behulp van een 2 ml zuiger voorzichtig mash de milt stukken door de cel zeef en was met 5 ml 1x PBS.
8. Voeg 3 ml Ficoll-Paque een 15 ml buis en bedekken de dichtheidsgradiënt medium met 5 ml celsuspensie.
9. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur zonder rem.
10. Breng de interfase een verse 15 ml buis, voeg 10 ml koud 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
11. Resuspendeer de cellen in 2 ml 1 x PBS bevattende 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (FACS-buffer). Breng 10 pl van de celsuspensie aan een buisje, meng met 10 gl 0,4%

2. Verrijking, Detectie en Zuivering van Mouse iNKT Cells

1. Verrijking van muis milt CD5positive (CD5 ⁺⁾ lymfocyten.
   1. (Optioneel) Stain 10 ⁵ cellen met FITC-geconjugeerd anti-CD5 (4 pl van 1:30 verdunning / 10 ⁶ cellen)gedurende 30 min bij 4 ° C in het donker, wassen met 200 pi FACS-buffer en resuspendeer in 500 pi FACS-buffer. Bereid een 20 pM werkende oplossing van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 1x PBS, voeg 1 pl daarvan 10 ⁵ cellen in FACS-buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwerven 10 ⁴ pre-verrijkte cellen op de flowcytometer.
      1. Met behulp van FCS-H en FCS-W, elektronisch hek op FSC-W ^lo cellen naar cel wambuizen en aggregaten (figuur 1A) uit te sluiten. Vervolgens elektronisch hek uit DAPI ⁺ (dode) cellen in het FSC-W ^lo populatie (Figuur 1B), en het gebruik van SSC-A en FCS-A elektronisch selecteer de lymfocytenpopulatie door grootte (figuur 1C).
      2. Met behulp van cellen binnen de lymfocytpoort, plot SSC-A versus CD5 en elektronisch gate CD5 ⁺ lymfocyten zoals getoond in figuur 1D. Het verwerven van de rest van de pre-verrijkte monster op de flowcytometer.
   2. Pas cel tellingen 10 ⁷ cellen per 90 ul in FACS buffer en voeg 10 ul anti-CD5 microbolletjes.
   3. Incubeer bij 4 * C gedurende 15 min, eenmaal wassen met 4 ml FACS buffer en resuspendeer in 500 ul koude FACS-buffer. Verrijken CD5 ⁺ lymfocyten met behulp van magnetische celscheiding (MACS) kolommen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
   4. Optioneel) Stain 10 ⁵ cellen met FITC-geconjugeerd anti-CD5 (4 pl 1:30 verdunning / 10 ⁶ cellen) en DAPI zoals in 2.1.1. Verwerven 10 ⁴ verrijkt lymfocyten op de flowcytometer en controleer of de elektronische poorten die in 2.1.1. selecteert CD5 ⁺ lymfocyten in de verrijkte cellulaire fractie. Verwerven 10 ⁵ cellen op de flowcytometer en analyseren percentage CD5 ⁺ lymfocyten in de verrijkte fractie aanwezig zoals getoond in figuur 1E - H.
2. Detectie en isolatie van de muis iNKT cells door FACS.
   1. Resuspendeer verrijkt CD5 ⁺ lymfocyten bij een concentratie van ongeveer 10 ⁶ cellen per 20 ul in FACS-buffer bevattende anti-CD16 / CD32 (4 pl 1:50 verdunning / 10 ⁶ cellen) en PE-geconjugeerd αGalCer / CD1d tetrameer (1 ug / 10 ⁶ cellen).
   2. Incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
   3. Verdun muis antilichamen (mAbs) tegen CD3e V500 (4 pl 1:20 verdunning / 10 ⁶ cellen), anti-CD19 E450 (4 pl 1:50 verdunning / 10 ⁶ cellen) en anti-CD8a E450 (4 pl 1:50 verdunning / 10 ⁶ cellen) in FACS buffer, toevoegen CD5 ⁺ lymfocyten en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker.
   4. Was de cellen met 1 ml FACS buffer door centrifugeren bij 300 g gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in 4 ml FACS-buffer bij een uiteindelijke concentratie van 10 ⁷ cellen / ml.
   5. Filter de cellen door een 30 um cel zeef en zet de cellen op ijs.
   6. Kalibreer de flowcytometer voor celsortering volgens de aanbevelingen van de fabrikant ^14,15.
      Opmerking: kalibratie van een flowcytometer voor celsortering vereist training en kan worden uitgevoerd door een ervaren operator, of een vakman.
   7. Voeg 10 pi van een 20 pM oplossing van werkende DAPI per 10 ⁶ cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwerven ongeveer 10 ⁴ verrijkt CD5 ⁺ lymfocyten op de flowcytometer. Elektronisch hek op FSC-W ^lo cellen naar cel wambuizen en aggregaten (figuur 2A) uit te sluiten. Vervolgens elektronisch gate uit DAPI ⁺ CD8 ⁺ CD19 ⁺ cellen (dump kanaal) binnen de FSC-W ^lo populatie (Figuur 2B), en gebruik SSC-A en FCS-A elektronisch selecteren lymfocyten (figuur 2C) zoals beschreven in 2.1.1.1 .
      1. Perceel αGalCer / CD1d tetrameer door CD3e en elektronisch hek αGalCer / CD1dtetrameer ⁺ CD3e ⁺ iNKT cellen zoals getoond in figuur 2D. Verwerven niet meer dan 2 x 10 ⁵ CD5 ⁺ verrijkte lymfocyten om het percentage te bepalen αGalCer / CD1d tetrameer ⁺ CD3e ⁺ iNKT cellen aanwezig in de verrijkte cellulaire fractie.
   8. De elektronische poorten die in 2.2.7., FACS sorteren αGalCer / CD1d tetrameer ⁺ CD3e ⁺ iNKT cellen op de flowcytometer bij 70 psi onder toepassing van een 70 urn mondstuk met een stroomsnelheid van '1,5'. Verzamel gesorteerde iNKT cellen in een FACS buis met 1 ml 100% FCS. Vervolgens reinigen gesorteerd iNKT cellen van de kant van de FACS buis met behulp van 10 ml RMPI 1640 medium en centrifugeer de cellen bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
   9. Resuspendeer gesorteerd iNKT cellen in 1 ml RPMI 1640 medium en 40 ul verwerven daarvan op een flowcytometer de zuiverheid van de gesorteerde iNKT cellen te beoordelen. Selecteer FSC-W ^lo DAPI ^- lymfocyts zoals beschreven in 2.2.7. (Figuur 2E - G) en elektronisch gate αGalCer / CD1d tetrameer ⁺ CD3e ⁺ iNKT cellen zoals getoond in figuur 2H.

3. Cultuur en uitbreiding van de Muis iNKT Cells

Dag 0

1. Coat een vlakke bodem 96 wells plaat met gezuiverde anti-CD3e (3 ug / ml) per putje gedurende 1 uur bij KT. Tweemaal wassen met 200 pl 1x PBS en een keer met 200 ul compleet RPMI 1640 medium (10% vol / vol FCS, 100 U / ml penicilline-streptomycine, 5,5 uM β-mercaptoethanol).
2. Tel het aantal levensvatbare gesorteerd iNKT cellen (stap 2.2.8) met behulp van een hemocytometer 0,4% zoals in 1,11. Gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in 5 x 10 ⁵ cellen / ml in compleet RPMI 1640 medium met recombinant Muis IL-2 (10 ng / ml), recombinant Muis IL-12 (1 ng / ml) en oplosbaar anti-muis CD28 (5 ug / ml). Plaat sorted iNKT cellen op 10 ⁵ cellen / putje anti-CD3e beklede platen en incubeer bij 37 ° C in een _CO2 incubator gedurende 2 dagen.

Dag 2

3. Overdracht van de cellen om een nieuwe onbeklede vlakke bodem 96 wells plaat en de cellen te kweken onder rusttoestand in volledig RPMI 1640 medium bij 37 ° C in een _CO2 incubator gedurende 2 dagen.

Dag 4

4. Los van de cellen van de plaat door voorzichtig pipetteren en breng de cellen een nieuwe 15 ml buis. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, hersuspenderen in 5 x 10 ⁵ cellen / ml in compleet RPMI 1640 medium met recombinant Muis IL-7 (5 ng / ml), en plaat 10 ⁵ cellen / putje in platte bodem 96 wells plaat gedurende 4 dagen bij 37 ° C in een _CO2 incubator.

Dag 8

5. Verzamel de cellen in een nieuwe buis, centrifuge bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in 5 x 10 ⁵ cellen / ml in compleet RPMI 1640 medium dat oplosbaar anti-CD28 (5 ug / ml).
6. Coat een platte bodem 96-well plaat met gezuiverd anti-CD3e (3 ug / ml) per putje en was als in 3.1. Plate 10 ⁵ cellen / putje anti-CD3e beklede platen en incubeer bij 37 ° C in een CO _2-incubator tot 11 dagen.

Dag 11-18

7. Herhaal de stappen 3,4-3,6.

Dag 19-20

8. Overdracht van de cellen om een nieuwe 15 ml buis centrifugeer bij 300 xg en resuspendeer in 5 x 10 ⁵ cellen / ml in compleet RPMI 1640 medium.
9. Plaat cellen op 10 ⁵ cellen / putje in vlakke-bodem 96 wells plaat en laat de cellen te rusten voor 2 dagen bij 37 ° C in een _CO2 incubator voorafgaand aan gebruik bij een experiment.

4. Cytokine productie door Mouse iNKT cellen met behulp van een CD1d Plate-gebonden Assay

1. Coat een vlakke bodem met 96 putjes plaat met 100 gl recombinant Muis CD1d (10 ug / ml in 1 x PBS) per putje en incubeer 1 uur bij 37 ° C.
2. Was vier keer met 200 pl 1x PBS, voeg 200 ul van 2% FCS in 1x PBS (blokkerende oplossing) per putje en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
3. Verwijder de blokkerende oplossing, voeg 200 pl αGalCer (5 ng / ul) per putje en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 uur. [Voor de bereiding van de αGalCer oplossing, voeg 1.085 μ 1x PBS tot 55 ug αGalCer opgelost in vehikel bevattende 96 mg / ml sucrose, 10 mg / ml natriumdeoxycholaat en 5 mg / ml Tween 20].
4. Na incubatie, gooi de αGalCer oplossing en was het goed tweemaal met 200 ul 1x PBS, gevolgd door 200 ul volledig RPMI 1640 medium.
5. Verzamel de in vitro geëxpandeerde iNKT cellen op dag 21, centrifuge de cellen bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer in volledige RPMI 1640 medium bij een concentratie van 0,5 x 10 ⁶ cellen / ml.
6. Voeg 200 ul van de iNKT cellen resuspensie per putje en incubeer 72 uur bij 37 ° C in een _CO2 incubator.
7. Verzamel de bovenstaande vloeistof en meet cytokines plaats door enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) volgens het protocol van de fabrikant.

Resultaten

Isolatie van milt mononucléaire cellen met behulp van een dichtheidsgradiënt duurt ongeveer 1 uur en elimineert het gebruik van de reagentia nodig om rode bloedcellen (RBCs) te lyseren. Een hoge opbrengst van levensvatbare cellen wordt zo verkregen en puin ontstaat tijdens het uitpersen van het orgaan verwijderd. Typisch, de frequentie van iNKT cellen in de milt lymfocyten pool varieert tussen 1 en 5% van de totale T-lymfocyten maar dit kan variëren afhankelijk van de leeftijd, het geslacht en de gezondheid van de diere...

Discussie

Kritische stappen in het huidige protocol omvat de isolatie en de daaropvolgende verrijking van CD5 ⁺ lymfocyten (deel 1 & 2), FACS sorteren (deel 3) en de eerste beplating van iNKT cellen (hoofdstuk 4). Van de stappen in paragraaf 1, vergeet niet om zorgvuldig lagen de milt cellulaire schorsing over de dichtheid gradiënt medium zodanig dat een duidelijke cellulaire tussenfase wordt gegenereerd na centrifugeren. De daaropvolgende verrijking voor CD5 ⁺ lymfocyten door magnetische cel scheiding (...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaal
recombinant murine IL-2	eBiosciences	14-8021
recombinant murine IL-12	eBiosciences	39-8122-65
recombinant murine IL-7	eBiosciences	14-8071
gezuiverd anti-muis CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
gezuiverd anti-muis CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-geconjugeerd anti-muis CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-geconjugeerd anti-muis CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
FITC-geconjugeerd anti-muis CD5 (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-geconjugeerd anti-muis CD3ε (500A2)	BD biosciences	560771
anti-muis CD5 (Ly-1) microbeads	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
gezuiverd anti-muis CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blauw, 0,4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 medium	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - vrij]
Fetaal kalfs serum	Gibco	10270
L-Glutamine	Gibco	25030-123
Penicilline-streptomycine	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Rund serum albumine	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethyleendiaminetetraazijnzuur	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Uitrusting
96-well plaat F-bodem	Greiner-bio one	657-160
24-well plaat	Greiner-bio one	665-180
6-well plaat	Greiner-bio one	655-180
15 ml falconbuis	Greiner-bio one	188-271
50 ml falconbuis	Greiner-bio one	227-261
70 μm filter	Greiner-bio one	542-070
30 μm filter	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separator	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Watermantel CO2 incubator	VWR
Hemocytometer	VWR
Dissectie Kit	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences