Spatiotemporele Mapping van Motiliteit in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Bereidingen van de darmen

Samenvatting

Recent beschikbare video-opname- en ruimtelijk-temporele kaarttechnieken (STmap) maken het mogelijk om zowel voortplantende als mengpatronen van darmmotiliteit te visualiseren en te kwantificeren. Het doel van dit protocol is om de generatie en analyse van STmaps te verklaren met behulp van het GastroIntestinaal Motiliteitsbewakingssysteem (GIMM).

Samenvatting

Meerdere benaderingen zijn voor het vastleggen en evalueren maagdarmmotiliteit inclusief: opname veranderingen in spierspanning, intraluminale druk en membraanpotentiaal. Al deze benaderingen afhankelijk meting van activiteit op een of meerdere locaties langs de darm tegelijkertijd die vervolgens worden geïnterpreteerd om een ​​gevoel van algemeen motiliteitspatronen verschaffen. Onlangs heeft de ontwikkeling van video-opname en tijdruimtelijke mapping (stmap) technieken hebben het mogelijk gemaakt om te observeren en complexe patronen in ex vivo gehele segmenten van dikke darm en analyseren. Eenmaal opgenomen en gedigitaliseerd, kunnen video-opnamen worden omgezet naar STmaps waarin de luminale diameter wordt omgezet in grijswaarden of kleur [genaamd diameter kaarten (Dmaps)]. STmaps kunnen gegevens motiliteit richting (dat wil zeggen stationair, peristaltische, antiperistaltische), snelheid, duur, frequentie en sterkte van contractiele motiliteitspatronen verschaffen. Voordelen van deze aanpak zijn: analysis interactie kan gelijktijdige ontwikkeling van verschillende motiliteitspatronen in verschillende gebieden van hetzelfde segment, visualisatie van motiliteit patroonveranderingen tijd, en analyse van de activiteit in een regio invloeden activiteit in een andere regio. Video-opnames kunnen worden afgespeeld met verschillende termijnen en analyse parameters, zodat afzonderlijke STmaps en beweeglijkheid patronen in meer detail kan worden geanalyseerd. Dit protocol specifiek worden de effecten van intraluminale vocht uitzetting en intraluminale prikkels die beweeglijkheid generatie beïnvloeden. Het gebruik van luminale receptor agonisten en antagonisten verschaft mechanistische informatie over specifieke patronen worden geïnitieerd en hoe men patroon kan worden omgezet in een ander patroon. De techniek wordt beperkt door het vermogen om enige veranderingen in motiliteit die luminale diameter veroorzaakt, zonder dat gegevens intraluminale drukveranderingen of spierspanning en door het genereren van artefacten gebaseerd op experimentele opstelling meten; hoewel analysis methoden kan goed zijn voor deze kwesties. In vergelijking met eerdere technieken van de video-opname en stmap aanpak zorgt voor een meer uitgebreide kennis van maagdarmmotiliteit.

Inleiding

Verschillende methoden voor het registreren en analyseren van darmmotiliteit zijn ontwikkeld de afgelopen 150 jaar ^1. Deze variëren van het initiële in vivo observaties en beschrijvingen van William Beaumont en Walter Cannon de recentere meetmethodes en interpretatie van multisite registratie van spierspanning, intraluminale druk en / of membraanpotentiaal (dwz junctionele potentialen) ^{2 - 6.} Deze laatste benaderingen een momentopname van de totale motiliteitspatronen, maar zijn beperkt door het aantal locaties van registratie en de geldigheid van interpolatie van de gegevens op gebieden tussen de opname sites.

De recente ontwikkeling van de video-opname en spatiotemporele mapping (stmap) technieken hebben het mogelijk gemaakt om te observeren en analyseren van complexe beweeglijkheid patronen in ex vivo hele segmenten van de dikke darm en de darm. Aanvankelijke aanpak, voor het eerst beschreven voor Intestinal segmenten in de late jaren 1990 ^7,8, afhankelijk van de onderzoeker ontworpen software om video-opname te analyseren; verschillende groepen zijn nu aangemaakt of gewijzigd software voor dit doel ^{2,8 - 12.} Terwijl vele groepen hun eigen software of plug-ins hebben gegenereerd, ze allemaal te analyseren diameters van een weefsel segment en om te zetten die verschillende diameters tot grijstinten representatie. Een commercieel beschikbare registratie en analyse systeem genaamd de maagdarmmotiliteit Monitoring systeem (Gimm) biedt een turnkey aanpak die het mogelijk maakt voor de analyse van zowel propulsieve beweeglijkheid via fecale pellet snelheid bepaling in de cavia distale colon ^13, evenals de analyse van propulsieve en het mengen van de beweeglijkheid patronen met een vloeistof stimulus in intacte darmsegmenten ^{4,5,14 - 19.} Deze laatste benadering is afhankelijk van het genereren en analyseren van STmaps en wordt beschreven in dit document. Het doel van deze methode is om t te vergrotenHij vermogen om kwalitatief en kwantitatief analyseren van verschillende motiliteitspatronen in de darm. Terwijl andere groepen het stmap voor beweeglijkheid analyse hebben gebruikt door hun eigen software, is dit de eerste beschrijving van hoe de Gimm gebruiken om beweeglijkheid te analyseren door de generatie van STmaps. In het onderhavige document, bieden we uitvoerige stap-voor-stap instructies voor: het bereiden van darmweefsels voor video-opnames, juiste instelling van video opnameparameters het vermogen om veranderingen in het weefsel diameter detecteren, het creëren van STmaps maximaliseren en de interpretatie en analyse van de STmaps met het gimm systeem en ImageJ software.

De hier beschreven methode is specifiek voor de analyse van het luminale perfusie van vloeistoffen of halfvaste stoffen bevattende verbindingen die darmmotiliteit patronen beïnvloeden. Een werkwijze voor de analyse van fecale pellet voortstuwing wordt beschreven in een artikel van Mawe en collega ^13. De algemene methode beschreven kan zijntoegepast op andere buisvormige gladde spieren organen voorzien: de dunne darm, bloedvaten, urethra, ureters, etc. Hoewel deze methode op zich geen gegevens over veranderingen in druk of spierspanning kan worden gekoppeld met het gebruik van de druk transducers, krachtopnemers of elektrofysiologische metingen om een meer volledig beeld van de beweeglijkheid patronen als sommige andere groepen hebben aangetoond ^2,15,20,21.

Protocol

Institutional Animal Care en gebruik Comite van Virginia Commonwealth University (IACUC) goedgekeurd alle dieren en euthanasie procedures die in dit protocol.

1. Voorbereiding van de Solutions

1. Bereid 4 L Krebs buffer (bestaande uit [mm]: 118 NaCl, 4,75 KCl, 1,19 KH _{2PO 4,} 1,2 MgSO _4, 2,54 _CaCl2, 25 NaHCO _3, 11 glucose). Weeg de geschikte hoeveelheden van elke vaste chemische, in de geschikte hoeveelheid gedeïoniseerd water gebracht en meng met een vortex totdat de oplossing helder is.
2. Vervolgens werd de oplossing met beluchten carboxygen _(95% O2, 5% _CO2) gedurende 30 minuten onder verwarmen tot 37 ° C.
3. Bepaal de pH van de oplossing, terwijl bij 37 ° C (dezelfde temperatuur als in het orgaanbad) en op pH 7,4 indien nodig met HCl. Houd de Krebs buffer continu carboxygenated en bij 37 ° C gedurende de duur van het experiment.
4. Zettende in- en uitstroom buizen uit de peristaltische pompen in het bufferreservoir en de afslag op de peristaltische pompen perfusie van de buffer te beginnen gedurende de slangen en orgel bad-systeem.
   OPMERKING: Buffer kunnen in eerste instantie worden gepompt terug in de oorspronkelijke verpakking totdat de toevoeging van ofwel weefsel in het orgel baden of chemicaliën in de perfusie buffer. Dit vermindert de totale hoeveelheid buffer nodig is voor experimenten. Dan moet de uitgaande buffer perfusie lijnen in een lege container worden geplaatst, zodat de ingaande en uitgaande buffers gaan niet samen.
5. Kalibreer de temperatuur van de verwarming van het bad circulatiepomp zodat de buffer binnen de orgaanbaden wordt en blijft 37,0 ± 0,5 ° C gedurende de duur van het experiment. Bevestigen en te passen als nodig, de pH van de Krebs buffer ten minste één keer alvorens weefselsegmenten in het bad in stap 2,8.

2. Voorbereiding van de Weefsels

1. Euthanasereneen cavia door het gebruik van kooldioxide inademing / stikken in een afgesloten kamer of een andere euthanasie methode door de lokale dierlijke zorg en gebruik commissie goedgekeurd.
2. Na bevestiging euthanasie van het dier, opengesneden de buikwand langsrichting met dissectie scharen en zoek de darmen. Snijd het mesenterium bevestigd aan de dunne darm om de blindedarm bloot.
   OPMERKING: Om te bevestigen euthanasie uitvoeren van een secundaire procedure zoals bilaterale thoracotomie zoals goedgekeurd door een dier zorg en gebruik Comite.
3. Zoek het distale uiteinde van de blindedarm en doorsnijden de proximale colon net distaal van de verbinding met de blindedarm. Doorsnijden dan het proximale colon weer ~ 8 cm distaal van de eerste doorsnijding.
4. Plaats de dikke darm weefsel in verwarmde en carboxygenated Krebs-oplossing (in hoofdstuk 1) voor verdere dissectie. Speld de dikke darm in de dissectie bad en gebruik een kleinere set van de schaar om zoveel mesenterium en vet te verwijderen mogelijk.
5. In het heated dissectie lade, verwijder alle intraluminale inhoud door zachtjes perfusie van Krebs buffer door het lumen met behulp van een injectiespuit gekoppeld aan een stomp uiteinde katheter (om perforatie van het weefsel te voorkomen). Vermijd over-uitzetting van het segment tijdens deze perfusie proces.
6. Verkrijgen twee-fire gepolijste glazen buis katheters (3 mm diameter) en plaats een kort stuk polyethyleen buis (~ 3 mm lang en ~ 3 mm diameter) rond het gedeelte van de glazen buis die het weefsel lumen.
   Opmerking: Dit zal de hechting rond het weefsel en glazen buis te worden geplaatst om veilig blijven en niet glijden als het preparaat wordt geplaatst in het orgaanbad en tijdens veranderingen in de lengte van het weefsel.
7. Steek een katheter in de mondelinge einde van het weefsel voorbereiding en bind een hechting rond het kleine stuk slang rond de katheter met knoop van een chirurg. Voorzichtig proberen de katheter terug te trekken om ervoor te zorgen de knoop strak. Voer vervolgens dezelfde actie aan de andere katheter invoeren thij aboral einde van het weefsel.
8. Zodra de katheters zijn bevestigd, beweegt het gehele preparaat (tissue plus katheters) vanaf de dissectie lade in een van de orgaanbaden. Plaats het preparaat in het bad met het orale einde afgekeerd van de gebruiker.
9. Volgende mount / zet de glasbuis catheters het orgaanbad met één van de twee voorgestelde methodes.
   OPMERKING: Bevestiging van de glazen buizen voorkomen weefselsegment het veranderen lengte tijdens het experiment en die boven het maaiveld van de Krebs-buffer in het bad.
   1. Optie A: Bevestig het bovenste gedeelte van de glazen buis aan de bovenzijde van de zijde van de plastic orgaanbad met behulp van klei molder of een plastic clip.
   2. Optie B: Zet de glazen buizen aan de metalen palen die de camera's boven het orgel bad voorbereiding te houden door het gebruik van plastic clips.
10. Zodra de katheters zijn bevestigd aan het bad sluit een 5-cm stuk slang aan het open einde van iedere katheter. Voor de orale katheter, hechten deze slang aan een 10-ml injectiespuit, die zal worden gebruikt om buffer injecteren in het lumen van de proximale colon segment. Voor de aboral catheter, dit stuk slang kan de luminale uitstroom wordt gericht naar een verzamelhouder (50 ml bekerglas, reservoir, enz.).
11. Met behulp van de injectiespuit bevestigd aan de mondelinge einde, langzaam opgewarmd flush Krebs buffer door het weefsel lumen dat vloeistof door het weefsel stromen te garanderen. Flow wordt bevestigd door vloeistof verlaten van de aboral katheter. Kalibreren van de video-opname-systeem (protocol deel 3), terwijl het weefsel in evenwicht gedurende 30 min.

3. kalibratie van de video-opname-systeem

1. Kalibreren van de camera hoogte plaatsing, video-instellingen voor helderheid en contrast en horizontale afstand met behulp van de software.
   OPMERKING: De beste instellingen voor intraluminale perfusie opstellingen zijn anders dan de instellingen die worden gebruikt om de snelheid van pellet voortstuwing ¹³ te bepalen.
2. Click op het tabblad experiment voor de camera te kalibreren. Vervolgens in het menu 'Bestand' klik 'Calibrate.'
3. Zodra de video wordt weergegeven in het venster 'kalibreren werkplek', zet de camera op een hoogte waar het beeld omvat de uiteinden van de katheters ingebracht in het colon lumen.
4. Vervolgens kalibreren van de horizontale afstand gezien in het beeld met behulp van de doorschijnende heerser sticker op elk bad.
   LET OP: Deze kalibratie is cruciaal om later software berekeningen van de luminale diameter en snelheid van contractiele golven.
5. In hetzelfde venster 'kalibreren werkplek', stelt de rode verticale richtlijnen, zodat ze zijn 10 mm van elkaar volgens de heerser in het camerabeeld. Vervolgens typt u de juiste afstand (10 mm) in het venster 'afstand cursors' en klik op de knop 'CAL'.
6. Vervolgens passen de winst, helderheid, en sluiter schuiven in het venster 'kalibreren werkstation' het imago van de camera, zodat wijzigenhet weefselsegment verschijnt als een donkere silhouet op een lichte achtergrond.
   OPMERKING: Figuur 4 toont goede en slechte voorbeelden van deze kalibratieprocedure.
7. Goed aan te passen het beeld, ook de focus en diafragma knoppen op de camera zelf aan te passen.
8. Kalibratie is nu voltooid. Klik op 'Opslaan' en klik op 'OK' in het pop-up, en tenslotte klikt u op de 'EXIT' knop.

4. Algemene experimentele procedures

1. Na camera procedures kalibratie en 30 min weefsel verevening zijn voltooid, de naam van de proeven in elke experimentele protocol. Trial namen kunnen worden op basis van de naam en de concentratie van de verbinding en het volume van vloeibare intraluminaal geperfundeerd in het weefselsegment gedurende dat gedeelte van het experiment.
2. Vervolgens afsluiten van de buis uitsteekt uit het aboral katheter door middel van een slangklem.
   NB: Dit voorkomt luminale vloeistof uit het verlaten van het aboral einde tijdens further experimenten, die het gebruik van bepaalde delen in het lumen om verschillende niveaus van distensie veroorzaken (figuur 1).
3. Injecteren ongeveer 0,7 ml Krebs buffer in de proximale colon lumen genoeg uitzetting naar voortstuwende contracties te starten in de cavia ex vivo preparaat.
   Opmerking: Dit volume kan enigszins afwijken (0,1 - 0,2 ml) afhankelijk van de totale lengte van het intacte segment en de hoeveelheid rek aangebracht op het segment in het orgaanbad.
4. Zodra het segment is opgezwollen door luminale vloeistof, zet de camera aan en dan noteer de beweeglijkheid voor een vooraf bepaalde periode (bijvoorbeeld 10 min).
   1. Specifiek, dubbelklikt u op de toepasselijke naam proef om de experimentele camera te openen en klik vervolgens op de schakelaar naar de "ON" positie om het veld camera bekijken. Klik vervolgens op de opnameknop om de opname te starten (opnameknop wordt rood blijven terwijl de camera is opname) eennd klikt u nogmaals op de opnameknop om de opname te stoppen.
5. Aan het einde van deze eerste controle uitzetting proces, los / verwijder de klem afsluiten aboral de katheter om het weefsel segment naar de distending vloeibare stuwen van het lumen.
6. Na 10 min re-equilibratie periode Herhaal deze procedure met elk van een verscheidenheid aan voedingsstoffen, biologisch actieve middelen, drugs of agonisten / antagonisten in de luminale vloeistof naar de propulsieve beweeglijkheid van het segment (bijvoorbeeld korte keten vetzuren of decaanzuur wijzigen zuur) ^10,18.
   1. Om gauge helpen wanneer de nieuwe experimentele fluïdum de colon segment laat een luchtbel nabij de haven van de spuit zodat na perfusie van de nieuwe oplossing in het colon lumen de voortgang van de bel kan de gebruiker weten wanneer de experimentele vloeistof heeft het lumen bereikt.
   2. Doorgaan intraluminale perfusie met de aboral katheter open tot de luchtbel volledig is geduwd door deluminale perfusie-systeem (kan vereisen 2-3 ml perfusaat). Vervolgens kan de weefselsegment te verdrijven vloeistof door de open aboral catheter tot 5 min.
      Opmerking: Na deze procedure wordt het lumen een verwaarloosbare hoeveelheid vloeistof bevatten, waarbij perfusie van een bekend volume van vloeistof in het lumen.
7. Opnieuw afsluiten aboral de luminale katheterbuis met een slangklem (zoals in stap 4,3) injecteer dezelfde hoeveelheid distending fluïdum als in de standaard toestand via de injectiespuit. Noteer de motiliteitspatronen gedurende de experimentele periode voor latere analyse en vergelijking met de controle Krebs aandoening (zoals in stap 4,5).
8. Herhaal secties 4,4 - 4,7 van het protocol met verschillende luminale verbindingen of verschillende concentraties van dezelfde luminale verbinding.

5. Bouw van Maps Spatiotemporal (STmaps)

1. Na afloop van het opnemen van het experiment, dubbelklikt u op de naam van een specifiek proces voor de analyse wind openenow voor de bouw van een stmap.
2. Binnen het afspelen van video gebied, het contrast en de helderheid schuifregelaars in de analyse-venster om het beeld geschikt voor analyse te maken (zwart weefsel silhouet op lichte achtergrond; figuur 4).
   Opmerking: Als de camera kalibratie niet juist is uitgevoerd voor het begin van het experiment wordt de afbeelding kan alleen worden gewijzigd in mindere mate op dit punt.
3. Eenmaal op het beeld in contrast, stel de horizontale en verticale rode richtlijnen binnen het beeld videovenster het weefselgebied te isoleren voor analyse en verwijder gebieden met artefacten. Selecteer ook het juiste moment segment van de registratie door het bepalen van de start- en stoptijd punten voor analyse.
   1. Specifiek, selecteert u het begin- en eindpunt in de video met behulp van de groene gele 'B' knoppen 'A' en binnen de analyse software. Stel de schuifregelaar voor tijd tot aan het begin van de video-segment te analyseren en den klik op de groene 'A' knop. Stel vervolgens de schuifbalk naar het einde van het segment te analyseren en klik op de "B" knop geel.
4. Vervolgens klikt u op het tabblad 'motor analyse' om het venster stmap openen en klik op de 'stopwatch' knop. Na het klikken op de stopwatch, naast klikt u op het vizier cursor binnen de zwarte silhouet van het weefsel binnen de opgenomen film te stmap generatie beginnen.
5. Na het klikken op het vizier in het weefsel silhouet, genereert de software en geeft de stmap voor dat gebied van video.
   NB: Dit kan een paar minuten, afhankelijk van de lengte van de video geselecteerd voor analyse te nemen.
6. Klik op 'zoom' om een ​​vergrote afbeelding van het stmap en controles te bekijken om het beeld aan te passen.
   1. Klik op de 'kleur' ​​optie in het nieuw gecreëerde venster om de stmap zien als kleur in plaats van grijstinten. Klik ook op de optie 'Inschakelen' in staat zijn om een ​​cursor op specifieke pixels te plaatsen binnen de kaart en view een tracering van de wijziging in luminale diameter die bepaald weefselgebied. Klik op 'Exit' als u klaar bent.
7. Een stmap voor gebruik exporteren in kranten of presentaties of om verder te analyseren in ImageJ door het selecteren in het menu 'Bestand', gevolgd door 'Export Data' te selecteren en vervolgens 'Meta File'. Noem dan de stmap, die zal worden opgeslagen als een EMF-bestand en klik op de knop 'Opslaan'.
8. Afwisselend beelden van de stmap redden door het vastleggen van een screenshot. Dit is nodig om pseudo-kleur versies van de stmap slaan.

6. Analyse van contractiele golfsnelheid in STmaps

1. Om de snelheid van contractie propagatie of krimp duur analyseren eerst het stmap .emf bestand te converteren naar .tiff, .gif, .jpg of .bmp formaten die aanvaardbaar is voor ImageJ door middel van een bestand conversie programma naar keuze zijn.
   OPMERKING: ImageJ niet de .emf formaat output van de STmaps van de software te openen.
   1. AlternativEly, gebruik screenshot capture software om een ​​foto van een stmap op het scherm te nemen en op te slaan in een geschikt bestandsformaat.
2. Open dan de re-geformatteerde stmap in ImageJ en open de GIMMProcessor plugin door het openen van de "" menu en het selecteren van 'Plugins GIMMProcessor GIMMProcessor' en 'Metingen Table' ramen '. Dit zal zowel open'.
3. Klik op de 'rechthoekige selectie gereedschap' in het venster ImageJ en vervolgens gebruiken om te schetsen door te klikken en het gehele gebied van de schaalaanduiding slepen in de rechterbovenhoek van het stmap. Na die regio is geselecteerd, klikt u op de 'set kalibratie' knop in de plugin. Tot slot plaatst u de juiste afstand (mm) en tijd (sec) in het vak kalibratie volgens de waarden van de schaalaanduiding en klik op 'OK'.
4. Klik vervolgens op de lijntekening instrument in het venster ImageJ. Teken een lijn op het stmap door het midden van een voortplantende krimp langs de hoek van de helling door te klikken en te slepen op het stmap. Afwisselend, trek een verticale lijn door een band van niet-voortplantende contractie contractie duur te bepalen.
5. Na de regel op de juiste wijze wordt getrokken (slechts één lijn kan tegelijk worden getrokken), klikt u op de knop 'nemen de meting in de plugin om een ​​uitlezing van de horizontale afstand, verticale afstand, en de helling van de lijn te genereren; die overeenkomen met respectievelijk de lengte (mm) (sec) en snelheid (mm / sec). Deze gegevens worden weergegeven in het venster 'Metingen Table'.
6. Herhaal de lijntekening en analyse stappen meerdere keren binnen een bepaalde stmap en opslaan van de gegevens als een .gmd bestand. Klik op de knop 'Opslaan' in de plugin en de naam van het bestand. Klik vervolgens op 'Opslaan' opnieuw om het proces te voltooien. Deze gegevens kunnen later worden vergeleken met andere onderzoeksgegevens of gebruikt worden om lijnen tekenen opnieuw op stmap.

Resultaten

Inzicht Maps Spatiotemporal (STmaps) als Diameter Maps (Dmaps)

Terwijl de kaart die door deze techniek spatiotemporele, veranderingen in de luminale diameter van het weefsel is de parameter specifiek zowel afstand en tijd zichtbaar. De stmap beeldt horizontale afstand langs de weefselsegment op de x-as (mm) en de tijd op de y-as (in sec) de starttijd bovenaan eindtijd onderaan. In de rechterbovenhoek is een legende, die minimale en maximale luminale diameter toont alsmede schalen voor zowel de x- en y-assen (figuren 1-4). Zo verschillende pixel tinten binnen de grijswaardenafbeelding corresponderen met verschillende luminale diameters. Donkere pixels corresponderen met grotere diameters en lichter pixels corresponderen met kleinere diameters. Zo zal contractiele golven van de kringspier verschijnen gebieden van lichtere pixelation gevolg van de vermindering van luminale diameter ( Figuur 1 zwarte pijlen). Daarentegen zal luminale uitzetting vanwege cirkelvormige spierontspanning of een grote bolus fluïdum een verhoging van luminale diameter en donkere pixels in het stmap / DMAP (figuur 1C witte pijlen) veroorzaken. Een verdere bespreking van de vorming en betekenis van STmaps te vinden in een artikel van Lammers groep ^11.

Luminal Uitzetting-Induced teelt- Weeën

In figuur 1 is guinea pig colon opgezwollen met 0,5, 1,0, 1,5 en 2,0 ml Krebs buffer gedurende 5 minuten bij elk volume. Teeltmateriaal contracties werden opgewekt door alle volumes ≥1.0 ml en verschijnen als dunne witte banden in de stmap (figuur 1). Uitzetting van het darmlumen zorgt ervoor dat de opening van teeltmateriaal contracties. Zoals getoond in figuur 1, de diameter van het lumen neemt toe met een grotere intraluminale volumes en de pixels in de stmapdie overeenkomt met de diameter donkerder maken van een algemeen donkere achtergrond. Op een bepaald niveau van uitzetting van de peristaltische reflex geactiveerd (1,0 ml; Figuur 1), die propulsieve golven van contractie tijdens de mondelinge opdat de diameter van het lumen te verminderen en de richting van de anale einde van het segment initieert (getoond als een witte banden in figuren 1 en 4). De witte band vertegenwoordigt krimp wordt vaak voorafgegaan door een donkere band, die de aboral ontspanning voorsprong op de peristaltische golf (figuur 1C witte pijlen) vertegenwoordigt. Deze witte en donkere pixels komen overeen met de stijgende contractie en dalende ontspanning componenten van de peristaltische reflex, respectievelijk ^22,23. In de stmap in figuur 1 paneel A, zijn er 0 voortstuwende golven op 0,0 ml, 0 voortstuwende golven op 0,5 ml buik, 3 voortstuwende golven op 1,0 ml buik, 6 voortstuwende golven op 1,5 ml buik, en 5 voortstuwende golven eent 2,0 ml uitzetting.

Nutriënt-afhankelijke Stationair / Mixing Weeën

Golven van teeltmateriaal contractie Niet alleen beweeglijkheid patroon dat kan worden gevisualiseerd door STmaps. Het mengen patronen motiliteit zoals segmentatie kan ook worden gezien in STmaps en de bijbehorende beeld (Figuur 2A). Dit patroon is anders dan het uitdragen van weeën. Tijdens mengpatronen vele kleine, stationaire contracties optreden in verschillende gebieden tegelijk (gevisualiseerd als meerdere kleine witte vierkantjes in dezelfde horizontale lijn, maar elkaar niet raken). Hoewel elke segmentele samentrekking stationair en niet beweegt in de orale anale wijze als beschreven voor het vermeerderen contracties, het vermogen van de STmaps complexe contractiele patronen illustreren gedurende lange tijdsperioden maakt visualisatie van de langzame progressie van contracties anaal tijd (Figuur 2A zwarte pijl). De duur vanelke afzonderlijke contractie kan ook worden bepaald door het tekenen van een verticale lijn door de witte contractie vierkant behulp ImageJ en de bijbehorende plug (Figuur 2A). In dit specifieke stmap gegenereerd door intra-colon perfusie van korte keten vetzuren, de gemiddelde stationaire krimp tijdsduur ~ 2 sec (bereik: 1,9 om 2,1 sec). Terwijl mesenterium nog op een tissue segment artefacten in de analyse kan veroorzaken, kan de verticale lijn artefacten gegenereerd door mesenterium (figuren 1B, 2B) worden gebruikt om longitudinale spierbewegingen te bepalen. In figuren 1B en 2B de horizontale beweging van de zwarte verticale lijn gevolg van samentrekking en ontspanning van longitudinale spier. Deze zijdelingse beweging longitudinale spier kan worden gevisualiseerd op STmaps horizontale bewegingen van de verticale banden die door mesenterium artefacten (figuren 1B, 2B).

ImageJ en Plugin Analyse van STmaps

Zowel de snelheid van een zich voortplantende golf (figuur 3) en de duur van de samentrekking (figuur 2) kan worden bepaald met behulp ImageJ en GIMMProcessor plugin. In figuur 3 is de voortplantingssnelheid van zowel orthograde en retrograde golven was ~ 0,25 mm / sec (bereik: 0,21-0,35 mm / sec). Zoals te zien is in het videobeeld boven de kaart ST, werd de analyse lijnen (rode lijnen vormen van een doos op het videobeeld) precies rondom een ​​rand van het weefsel segment in plaats van rond het gehele segment. Dit is een belangrijke toepassing van de richtlijnen in de software. Nauwkeurige instelling van deze richtlijnen is van cruciaal belang voor een goede analyse van de video als verder geanalyseerd in de sectie discussie. Dit maakt het genereren van een stmap die myogene contracties rimpel ²⁴ visualiseert. Deze contracties myogene oorsprong en veranderen niet luminale diameter sterk. Ook verschillende dirreflecties van de vermeerdering (orthograde of retrograde), die gebruikelijk rimpelingen, kunnen worden geanalyseerd met deze techniek (figuur 3). Zoals getoond in figuur 2 de duur van krimp kan variëren in verschillende gebieden van het weefselsegment.

Goede analyse van STmaps

Een potentieel probleem met de creatie van STmaps mogelijk artefact generatie als gevolg van de experimentele methodologie. Zo zal mesenterium links op de buitenkant van het weefsel de diameter toenemen leest voor dat segment van het weefsel tot een verticale zwarte lijn op de stmap (figuren 1, 2B). De aanwezigheid van mesenterium ook kunstmatig vergroot het grijstinten kaart door meer breedste luminale meten, hetgeen een afstomping van het contrast metingen van de schaal. Daarom is het beter om het mesenterium zo volledig mogelijk uit het segment te verwijderen zonder perforeren van het weefsel. Een andere mogelijke stmap artefact is een witte verticale lijn als gevolg van belletjes in de luminale vloeistof die niet staat in contrast tot zwart (Figuur 4B). Deze bellen kunnen maken van de luminale diameter kleiner lijken de analyse software of overlay witte / lichte gebieden op de beweeglijkheid patronen in de stmap. Derhalve opstelling van de weefselsegment en correcte contrasterende van de video-opname voor de analyse zijn van doorslaggevend belang voor het succes bij het ​​construeren STmaps (figuur 4). Een juiste en onjuiste contrasterende opstellingen worden getoond in figuur 4. Het is belangrijk op te merken dat video aanpassing zowel de pre-experiment camerakalibratie en post-experiment analysevenster zijn essentieel voor juiste stmap genereren en analyseren. Onjuiste afbeelding kalibratie kan leiden tot STmaps met onbruikbare gegevens (Figuur 4A).

700 "/>
Figuur 1. teelt- Golven in de proximale Colon. (A) A distensie-respons curve (uitgevoerd in cavia proximale colon) werd gebruikt om de juiste intraluminale vloeistofvolume vast te leiden voortplantende golven in dit segment (witte horizontale banden). Zwarte pijlen illustreren voorbeelden van full-length voortplantende golven. Witte pijlen geven de lijn artefact veroorzaakt door incomplete mesenterium verwijderen. (B) Een beter zicht van teeltmateriaal contracties bereikt stmap genereren van een experiment vergelijkbaar Paneel A, maar een video van kortere duur. Het is makkelijker om op te merken dat de weeën vooruitgang in de orale anale richting en de voorgaande aboral ontspanning voorgesteld als een donkere omgeving voorsprong op de witte band in vergelijking met het paneel A. Deze kaart biedt ook een ander uitzicht op mesenterium artefacten te identificeren. Het rode vak geeft de regio van deze stmap uitgebreid in paneel C. (C) Dit paneel toont een nog beter zicht of dezelfde video en kaart als in paneel B. Witte pijlen label 'Fluid Uitzetting' point tot donkere pixels dat als gevolg van uitzetting intraluminaal door vloeistof aboral aan de voortplantende golf zijn. Dit zijn gebieden waar cirkelvormige ontspanning van de spieren optreedt aboral circulaire spiersamentrekking. Merk op dat het teeltmateriaal samentrekkingen eruit volledig horizontale lijnen in panel A als gevolg van de lange termijn van de kaart. In panels B en C de tijdschalen zijn steeds korter, zodat de contractie golf heeft een helling die kan worden gemeten en gerapporteerd als de snelheid van de golfbeweging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Bepaling van krimp Duur door stmap. (A) Cavia proximale colon shows een meng / motiliteit segmentaal patroon in reactie op intraluminale perfusie van korte keten vetzuren (butyraat). Verticale rode lijnen zijn getrokken door de periodes van krimp naar krimp duur te bepalen met behulp van Image J en de GIMMProcessor plugin. De zwarte pijl geeft de aboral richting van de voortplanting van de stationaire weeën. (B) Het uitdragen van contracties in de muis ileum vertonen vaak gebieden van aanhoudende krimp. Verticale pijlen getekend op deze kaart zien dat meer orale regio bleef gecontracteerd voor een langere duur. In deze bereiding, het anale uiteinde van het preparaat werd gesloten fluïdum verhinderen verlaten het gesloten systeem in weefsel weeën. De afbeelding boven het paneel toont nu de volledige orale uiteinde van het weefsel wordt aangegaan (wit op stmap), terwijl het gehele anale einde opgezwollen door fluïdum (zwarte op stmap). De horizontale / zijwaartse beweging van de verticale zwart in het midden van het Panel B stmap toont beweging van delongitudinale spierlaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Bi-directionele Motility Patterns. Uitdragen golven kunnen bewegen in beide orthograde (mondeling anaal) en retrograde (anale orale) richtingen. Effen zwarte pijlen geven de normale orthograde vermeerdering en gestippelde zwarte pijlen tonen retrograde voortplanting. De voortplantingssnelheid van zowel orthograde en retrograde contracties in deze stmap werden bepaald door ImageJ analyse en waren ~ 0,25 mm / sec. Beeldanalyse lijnen (rode lijnen vormen van een doos op het videobeeld boven de stmap) werden dicht bij een rand van het weefsel rimpel myogene contracties die lage amplitude, ondiepe weeën vaak georiënteerd orthograde visualiseren, retrograde, of beide richtingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. belang van een goede beeldcontrast voor stmap Generation. (A) toont een onjuist contrast imago en stmap, terwijl paneel B geeft een goed contrast imago en stmap. In (A) de horizontale witte banden gegenereerd uit de goed contrast afbeelding (B) zijn niet zo duidelijk en er zijn meerdere artefacten (witte schaduw) als gevolg van de eerste afbeelding wordt in grijstinten. In de stmap gegenereerd uit de goed contrast afbeelding (B) de witte shading artefacten van de grijstinten verdwijnen en de voortplantende golven zijn meer uitgesproken. Ook de zwarte schaduw die ontspanning ahead van de contractiele voortplantende golf kan worden gezien in het anale einde van de stmap met elke ronde van contractie. In panel B de witte pijlen illustreren een stmap artefact gegenereerd door een gebied van het beeld die niet goed kon worden afgezet. Dit type artefact is vooral te wijten aan intraluminale bellen die zich soms voordoen bij de voorbereiding in de loop van de experimentele protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Darmmotiliteit is bekeken en beschreven vanuit een aantal gezichtspunten op basis van de aard van de parameters opgenomen. Video-opname en spatiotemporele mapping heeft bewezen een waardevol instrument dat de analyse van de totale beweging en / of voortstuwing over lange segmenten van de darm, evenals de analyse van de activiteit maakt op specifieke punten langs het segment. De aanpak van video-opname en tijdruimtelijke mapping kan tweeledig en weerspiegelt de onderzochte regio en de aard van de luminale inhoud. In intestinale segmenten waarin luminale inhoud vloeiender en in proximale colon wanneer inhoud meer halfvast activiteit wordt geïnduceerd door intraluminale invoeren van fluïdum door bolus of infusie. Spatiotemporele kaarten uit deze video-opnamen zijn ontworpen om de beweging vertegenwoordigt van het gehele segment zoals hierboven beschreven. In tegenstelling, in het midden van de distale colon, waar de inhoud zijn meer solide, activiteit wordt geïnitieerd door het inbrengen van een fecale pellet (epoxy natuurlijke of kunstmatige pellet pellet) en tijdruimtelijke kaarten zijn ontworpen om de beweging van de pellet weerspiegelen door de dikke darm zoals in de JOVE artikel van Hoffman et al. ^13. Dus de opzet van het experiment en analyses zijn cruciaal en afhankelijk van het type stimulus en de regio bestudeerd. Daarom is de kritische stappen voor het genereren en analyseren van spatiotemporele kaarten van vloeistof geïnduceerde intestinale motiliteit zijn: 1) correcte verwijdering van het mesenterium van ontleed weefsel; 2) de juiste image kalibratie voordat de opname; 3) de juiste verwijdering van artefacten tijdens stmap generatie en analyse; 4) de goede setup van de analyse-systeem; en 5) het verkrijgen van de handvaardigheid te katheteriseren en hechten de segmenten zonder ze te beschadigen.

Hoewel het gebruik van STmaps luminale diameter van het vermogen om te visualiseren en analyseren volledige motiliteitspatronen over een gebied van darmen zijn verbeterd, is de techniek best gebruikt wanneer gekoppeld aanfunctionele metingen van druk of spiersamentrekking ^2,15,20. Bijvoorbeeld, terwijl sommige spiercontracties luminale diameter die iets kunnen veranderen en zichtbaar op sommige STmaps (dwz myogene ribbels) kunnen zij niet daadwerkelijk veroorzaken geen voortstuwing of vermenging van darminhoud ^25. Dit kan niet worden gekend zonder koppeling van deze techniek om andere functionele metingen. Ook de aard van veel weefselpreparaten in dit type systeem (dat wil zeggen een gesloten stelsel of luminale constant luminale perfusie door een pompsysteem) tot artefacten in STmaps. Zo moet de gebruiker weten hoe hun specifiek orgaan bereiding experimenteren kan leiden tot artefacten in de data en manieren om te voorkomen of uit te sluiten deze artefacten in gegevensanalyse (bijv-mesenterium geïnduceerde verticale lijnen of donkere korrelig te zijn doordat het weefsel te verdrijven vloeistof uit het systeem in een gesloten luminale preparaat). Er zijn meerdere werkwijzen voor het luminale perfusie van een intact intestinale segment naast een gesloten systeem. Een methode is om in plaats daarvan een open systeem een constante intraluminale / tegendruk handhaaft door toepassing van een verhoogde buis en / of eenrichtingsklep op het anale uiteinde van het preparaat ^8-10,30. Hierdoor kan de vloeistof in propulsieve contracties van het preparaat te bewegen.

Aangezien het systeem setup vooral veranderingen in luminale diameter detecteren, die weeën of motiliteitspatronen die geen grote invloed hebben luminale diameter vaak moeilijk te visualiseren dit protocol. Aangezien veranderingen in de pixel shading binnen de stmap zijn gebaseerd op veranderingen in de luminale diameter, motiliteitspatronen die niet leiden tot grote veranderingen in diameter worden niet goed zichtbaar in deze methode als sterke contracties aanwezig binnen dezelfde opname. Zoals beschreven voor de visualisatie en analyse van rimpel-type contractie (figuur 3), wat de analyse lijnen in de video-opname dichterbij to het weefsel muur kan dit probleem ondervangen. Dit reduceert de maximale diameter op de binnenkant van de stmap, zodat samentrekkingen dat slechts minimaal wijzigen weefsel diameter kan worden gevisualiseerd. Een andere mogelijkheid om dit probleem op te lossen verandert de duur van het videosegment geanalyseerd contracties die sterk beïnvloeden luminale diameter, waardoor kleinere contracties gemakkelijker worden gevisualiseerd sluiten. Dit leidt tot het mogelijke probleem van motiliteit die minimaal veranderd luminale diameter zoek vergelijkbaar met een aparte stmap waarbij contracties sterk veranderd luminale diameter. Dit is omdat de bepaling van de witte pixels op de kaart is gebaseerd op de kleinste diameter in een gegeven video. Als er weinig variatie in diameter in de video (weinig of geen samentrekking van de kringspier) zeer kleine samentrekkingen die de diameter van het preparaat niet veranderen kan sterk vergelijkbaar met peristaltische contracties van andere video kijken. Daarom is het belangrijk om de figuur te overwegenlegende in de rechterbovenhoek van de kaart. Als het verschil tussen de maximale en minimale diameters klein is belangrijk om de stmap vergelijken met de video werd gegenereerd van de geldigheid van de pixel schaduw verandering zoals weergegeven in de stmap bepalen. Aldus onderzoek van de schaalbalk in combinatie met de eigenlijke opname is kritisch voor de interpretatie van de map te corrigeren.

Video-opname en spatiotemporele in kaart brengen van de darm en dikke segmenten zijn toegepast op een verscheidenheid van soorten, waaronder ²⁶ zebravis, muis ^{25,27 - 30,} rat ^{7,9,30 - 33,} cavia ^{5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35,} brushtail possum ^12,36, konijn ^{2,30,37,38, 39} kippen, varkens ^40,41 en menselijke ^42. De meest bestudeerde soort is de cavia. Dit is niet verwonderlijk, omdat de cavia enterisch zenuwstelsel hals het meest volledig gekarakteriseerd en historisch heeft de meest bestudeerde vitro ten aanzien propulsieve motiliteit van de darmen ⁴³ geweest. Tijdruimtelijk mapping is vooral toegepast op buisvormige segmenten van de darm van kleine dieren; Echter, studies bij konijnen en varkens met behulp van aangepaste systemen tonen de toepassing van deze methode op grotere dieren. Bij het ​​konijn, de benadering identiek aan die van kleinere dieren, behalve dat grotere segmenten en orgaanbaden gebruikt ^30. De aanpak die in het varken was om een ​​geëxterioriseerde lus van darm te gebruiken van een verdoofde varkens in plaats van onderdompeling van een ontleed weefsel segment in een orgaan bad. Ook werden STmaps gegenereerd door kruiscorrelatie plaats van transilluminatie methode die in de meeste studies ^40. De geïsoleerde, vasculair geperfundeerd loop voorbereiding video-opname en tijdruimtelijke mapping is ook toegepast op kleinere soorten zoals ratten ^{33. Een recente studie van Kuizenga et al. is het eerste gebruik van STmaps van video opgenomen beweeglijkheid patronen in ex vivo segmenten van de menselijke darm 42; hoewel STmapping benaderingen zijn toegepast op de analyse van manometrische (druk) opnamen bij mensen in vivo 3,44. De opgenomen motiliteitspatronen in menselijk weefsel vergelijkbaar met de reeds in diermodellen opgenomen met soortgelijke technieken en valideert de uitbreiding van deze benadering van menselijke weefsels. Het is opmerkelijk dat deze studie gecombineerd STmaps afgeleid van video-opnames met het meten van spiercontractie geregistreerd door krachtopnemers. Meting van intraluminale druk door een vezeloptische manometrische katheter ingebracht in de ex vivo segment werd omgezet in een stmap, die de veelzijdigheid van de stmap meer dan veranderingen in luminale diameter visualiseren. Deze gecombineerde aanpak correleren spierspanning, intraluminale druk en de muur beweging maakteen meer diepgaande functionele analyse van de gegenereerde uit de video opname STmaps.}

Studies van STmaps gegenereerd uit de muur bewegingen en veranderingen in de luminale diameter (ook wel Dmaps) toestemming hebben gedetailleerde beschrijvingen van de beweeglijkheid patronen zoals voortstuwende peristaltische golven en gelokaliseerde segmentale weeën. Hoewel deze patronen werden geïdentificeerd door eerdere experimentele methoden, de huidige aanpak maakt een meer verfijnde definitie van gelokaliseerde contractiele bewegingen zoals rimpels en nieuwe anti-peristaltische contracties ^{9,24,25,30,31,42.} De constructie van STmaps en analyse van veranderingen in motiliteit patroon zijn toegepast op belangrijke vragen in het maag motiliteit van de darmen en colon. Deze omvatten: differentiatie van neurogene en myogene contracties en het definiëren van de rol van de interstitiële cellen van Cajal ^{6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42,} het begrijpen van de complexewisselwerkingen tussen de cirkelvormige en longitudinale spierlagen ^{2,7,8,11,12,32,39,40,} onderzoeken van de effecten van intraluminale voedingsstoffen ^10,18,19, microbiële stammen ³⁴ en viscositeiten ^12,36 op verschillende motiliteitspatronen, en begrijpen van de rol van verschillende endogene en exogene neuro-hormonale middelen farmacologische middelen ^{2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40} bij het ​​genereren en wijzigen van motiliteit. De toekomst van deze techniek gaat koppelen met andere metingen zoals druk, elektrofysiologie en spanning / contractiliteit. Recente studies hebben vaak opgenomen één of meer van deze metingen in combinatie met de video-opname en tijdruimtelijke mapping aanvullende gegevens correlatieve ^2,42 verschaffen. Bovendien kan het systeem worden gebruikt om motiliteit meten andere buisvormige en niet-buisvormige organen. Zo zijn pogingen ondernomen het meten gastrische motiliteit viaeen dergelijk systeem maar de techniek en software nodig verfijning motiliteit beter kwantificeren dergelijke niet-buisvormig orgaan ^45. Er is geen twijfel dat de toepassing van tijdruimtelijk karteringstechnieken alleen en in combinatie met meer traditionele analysemethoden leidt tot een meer diepgaande en uitgebreide kennis van gastrointestinale motiliteit in de toekomst.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Natriumchloride (NaCl)	Fisher	BP358	Voor Krebs buffer.
Kaliumchloride (KCl)	Fisher	BP366	Voor Krebs buffer.
Kaliumfosfaat (KH2PO4)	Fisher	P285	Voor Krebs buffer.
Magnesiumsulfaat (MgSO4)	Sigma	M2643	Voor Krebs buffer.
Calciumchloride (CaCl2)	Sigma	C7902	Voor Krebs buffer.
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)	Fisher	BP328	Voor Krebs buffer.
Glucose	Sigma	G7021	Voor Krebs buffer.
Carbogen (95% O2/5% CO2)
Dissectiepennen
Dissectiebakken/schotels
Dunkin Hartley Guinee-varkens	Charles River	Strain 051
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/	Gratis online beschikbaar.
GastroIntestinaal Motiliteits Monitor (GIMM)	Catamount Inc., St. Albans, Vermont		Bevat onderstaande onderdelen.
Peristaltiekpompen			Inbegrepen bij GIMM.
Badcamera's			Inbegrepen bij GIMM.
TransIlluminatie Achtergrondverlichting voor bad			Inbegrepen bij GIMM.
Orgaanbaden			Inbegrepen bij GIMM.
Achtergrondverlichting Intensiteitsregeling			Inbegrepen bij GIMM.
GIMM Processor ImageJ Plugin			Inbegrepen bij GIMM.
Polyethyleen Slangen			Inbegrepen bij GIMM.
Slangverbindingen			Inbegrepen bij GIMM.
Masterflex slang voor Peristaltische Pompen			Inbegrepen bij GIMM.
Verwarmingsbad/Watercirculator			Inbegrepen bij GIMM.