Methodenartikel

Detectie van intracellulaire genexpressie in levende cellen van muizen, de mens en Porcine Origin Met behulp van fluorescentie-gelabelde Nanodeeltjes

13.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53268

⸱

13 november 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een nieuwe techniek die de detectie van intracellulaire genexpressie mogelijk maakt na endocytose van fluorescentie-gelabelde nanodeeltjes direct in levende cellen. De methode vereist geen manipulatie van de cellen en is niet beperkt met betrekking tot het doelgen of de soort.

Samenvatting

De herprogrammering van somatische cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) is met succes uitgevoerd in verschillende zoogdiersoorten, waaronder muis, rat, mens, varken en anderen. De verificatie van iPS-klonen is voornamelijk gebaseerd op de detectie van de endogene expressie van verschillende pluripotentiegenen. Deze genen vertegenwoordigen meestal transcriptiefactoren die zich in de celkern bevinden. Traditioneel wordt het bewijs van hun endogene expressie geleverd door immunohistologische kleuring na fixatie van de cellen. Deze aanpak vereist repliceerbare culturen van elke kloon in dit vroege stadium om gevalideerde klonen te behouden voor verdere experimenten. Het huidige protocol beschrijft een aanpak met genspecifieke nanodeeltjes die de evaluatie van intracellulaire genexpressie direct in levende cellen mogelijk maken door middel van fluorescentie. De nanodeeltjes bestaan uit een centraal goudpartikel gekoppeld aan een captuurstreng die een sequentie draagt die complementair is aan het doel-mRNA, evenals een gekwelde verslaggeverstreng. Deze nanodeeltjes worden actief endocyteerd en het doel-mRNA verplaatst de verslaggeverstreng, die dan gaan fluoresceren. Daarom kan specifieke doelgenexpressie direct onder de microscoop worden gedetecteerd. Bovendien maakt de uitgestraalde fluorescentie de identificatie, isolatie en verrijking van cellen die een specifiek gen tot expressie brengen mogelijk door middel van flowcytometrie. Deze methode kan direct worden toegepast op levende cellen in cultuur zonder enige manipulatie van de doelcellen.

Inleiding

In 2006 werd een nieuwe benadering beschreven somatische cellen te herprogrammeren in een pluripotente toestand. Na prescreening een keus van herprogrammering factoren murine fibroblasten met succes kon worden omgezet in zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) door retrovirale transductie en overexpressie van vier transcriptiefactoren (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Vervolgens deze techniek effectief gereproduceerd met somatische cellen van verschillende zoogdiersoorten waaronder mensen 2, 3 apen, ratten 4, 5 honden, schapen en varkens 6 7. Bovendien, bewerkt protocollen weglaten of vervangen van de potentieel oncogene transcriptiefactor c-MYC gepubliceerd 8, 9.

Ongeacht de initiële herprogrammering benaderen ware pluripotentie van groeiende kolonies moet bevestigd, een moeizame en tijdrovende taak. Een belangrijk nadeelde meeste van deze analyses is dat ze niet kunnen worden uitgevoerd op levende cellen. Gevestigde pluripotentie factoren zoals OCT4, SOX2, NANOG of REX1 vertegenwoordigen transcriptiefactoren in de kern en de detectie vereist fixatie van de cellen voorafgaand aan immunohistochemie of cellysis voor RT-PCR analyse 10 -. 12 Daarna worden deze cellen verloren toekomst experimenten die vermenig- van elke kolonie.

Dus een technologie om pluripotentie analyseren levende cellen is zeer gewenst. Verschillende benaderingen kunnen inderdaad direct worden uitgevoerd op levende cellen met behulp van antilichamen gericht tegen membraan-gebaseerde antigenen (bv. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescente kleurstoffen gemeld aan alkalische fosfatase of 13 kleine moleculen die specifiek label embryonale stamcellen detecteren (ES) en iPS-cellen 14. Echter, kunnen de antilichamen wel negatieve invloed op de cellen en elke method beperkt tot één pluripotentie marker. Tenslotte fluorescerende moleculaire beacons, dual-antisense oligonucleotiden met haarspeldstructuren die levende kleuring van cellen mogelijk maken, zijn beschreven 15. Hoewel deze benadering kan worden toegepast op vele genen, de techniek vereist nucleofection van een celsuspensie, die niet van toepassing op groeiende iPS kolonies.

Een paar jaar geleden gen-specifieke nanodeeltjes zijn beschreven survivin expressie te analyseren in menselijke SKBR3 borstkankercellen 16. Dit manuscript beschrijft een nieuwe innovatieve aanpak van het opsporen van pluripotentie markers in levende ES en iPS-cellen door het gebruik van goud nanodeeltjes conjugaten. Deze nanodeeltjes bestaan ​​uit een centrale goud deeltje met een gekoppelde capture streng die de complementaire RNA-sequentie en een Cy3-gemerkte reporter streng. Het fluorescentiesignaal van de reporter streng wordt afgeschrikt door de centrale gouddeeltje. Daarnaast geschiktenanodeeltjes dienen als negatieve en positieve controles, respectievelijk (figuur 1). Voor een toepassing van de nanodeeltjes zijn gewoon toegevoegd aan het kweekmedium (figuur 2) en voer de cellen via endocytose (figuur 3). Als het doel RNA uitdrukte verdringt de verslaggever streng die vervolgens zendt een fluorescent signaal. Deze methode vereist geen manipulatie van de doelcel en de expressie van het doelwitgen kan optisch worden bewaakt onder een fluorescentiemicroscoop direct in levende cellen. Bovendien kan de technologie worden toegepast op elk gewenst doelgen alle species bij iPS cellen en kan dus worden toegepast op verschillende onderzoeksgebieden. Tot slot, flowcytometrische analyse laat de identificatie en de verrijking van Cy3 positieve cellen.

Protocol

1. Voorbereiding van de Media, reagentia en celkweekomstandigheden

  1. HEK 293 humane embryonale niercellen
    1. Culture HEK 293-cellen (CRL-1573, ATCC) in DMEM / Ham's F-12 medium aangevuld met 5% FCS, L-glutamine (2 mM) en penicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 ug / ml).
    2. Om de passage cellen, was cellen eenmaal met PBS, voeg 0,05% trypsine / EDTA en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% CO2. Overdracht cellen in een 15 ml buis, centrifugeer 5 min bij 1200 rpm (300 x g) en breng circa 5 5x10 cellen in een T25 kolf vers.
  2. Muizen embryonale fibroblasten (MEF)
    1. Voeg 1 ml van een 0,1% gelatine oplossing voor individuele 6-putjes en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur. Zuig vloeistof en bewaar bij kamertemperatuur tot gebruik.
    2. MEF cultuur in DMEM aangevuld met 10% FCS, L-glutamine (2 mM), L-glucose (4,5 g / l), natrium pyruvaat (1 mM) en penicilline (100 U /ml) / streptomycine (100 ug / ml) op met gelatine beklede platen met 6 putjes.
    3. Verdeel MEF in 6-well platen en laat ze groeien tot samenvloeiing. Voeg mitomycine (5 ug / ml) gedurende 2,5 uur om cellen te stoppen. Zuig medium, wassen cellen tweemaal met compleet MEF medium en voeg 3 ml MEF medium aan elk 6-well. Deze cellen dienen als een feeder-laag voor muizen en varkens iPS-cellen.
  3. Cultuur van muizen ES en iPS-cellen
    1. Om muizen ES kweekmedium bereiden, DMEM medium met 15% FCS, L-glutamine (2 mM), L-glucose (4,5 g / l), MEM niet-essentiële aminozuren (1X), β-mercaptoethanol (0,1 mM) en leukemie remmende factor (1,000 U / ml).
    2. Spoelen 6-wells met groei gearresteerd MEF eenmaal met serumvrij DMEM, voeg 2 ml muis ES medium en muizen iPS-cellen (20% van de cellen van een confluente gerecht). Elke dag wassen cellen eenmaal met serumvrij DMEM en voeg 2 ml vers muis ES medium.
    3. Om de passage cellen, was elk putje eenmaal met serumvrij DMEM, voeg 00,25% trypsine / EDTA en incubeer gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% CO2. Overdracht cellen in een 15 ml buis, centrifugeer 5 min bij 1200 rpm (300 x g), hersuspenderen cellen in 500 pi muizen ES medium en voeg 100 pl van de suspensie tot 2 ml muis ES medium in een verse 6 putjes met een MEF feeder-laag.
  4. Cultuur varken iPS-cellen
    1. Om pig iPS medium bereiden, DMEM / Ham's F-12 medium met 20% knockout serum, L-glutamine (2 mM), MEM niet-essentiële aminozuren (1X), β-mercaptoethanol (0,1 mM) en penicilline (100 U / ml) / streptomycine (100 ug / ml). Filtreer door een 0,22 uM filter en bewaar bij 4 ° C gedurende 2 tot 3 weken. Bij het eerste gebruik, voeg bFGF (10 ng / ml uiteindelijke concentratie).
    2. Spoel 6-wells met groei aangehouden MEF eenmaal met serumvrij DMEM / Ham's F-12 en voeg 1,5 ml medium iPS varkens en varkens iPS cellen (10% van de cellen een confluente schaal). Dagelijks wassen cellen eenmaal met serumvrij DMEM / Ham's F-12 en voeg 1,5 ml vers varkensvlees iPS medium.
    3. Ter voorbereiding dissociatie buffer voeg 2,5% trypsine, collagenase IV (10 mg / ml), knockout serum (20%) en CaCl2 (1 mM) om Ca2 + -vrij PBS. Was de cellen tweemaal met PBS en geïncubeerd met dissociatie buffer gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. Overdracht cellen in een 15 ml buis, centrifugeer 5 min bij 1200 rpm (300 x g).
    4. Resuspendeer varkens iPS-cellen in 500 pi vers varkensvlees iPS medium en voeg 50 ul van de schorsing tot 1,5 ml varken iPS medium in een frisse 6-well met een MEF feeder-laag. Elke dag wassen cellen eenmaal met serumvrij DMEM / Ham's F-12 en voeg 1,5 ml vers varkensvlees iPS medium.
  5. Feeder-vrije cultuur van menselijke iPS-cellen
    1. Ontdooi de oorspronkelijke flacon met basaalmembraan preparaat bij 4 ° C en verdund met ijskoude serumvrij DMEM / Ham's F-12 om 8 mg / ml, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C tot verder gebruik.
    2. Dooi een hoeveelheid van de basement membraanpreparaat bij 4 ° C en verdund met ijskoude serumvrij DMEM / Ham's F12 (90 ug / ml). Pipetteer 1 ml van deze oplossing in 3 cm kweekschalen en schud zachtjes zodat het gehele oppervlak beslaan. Seal gerechten met parafilm en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal een week. Voorafgaand aan het gebruik celkweek gerechten incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C of 3 uur bij KT om polymerisatie van het basale membraan wording.
    3. Zuig medium van schotels bekleed met het basale membraan preparaat en tweemaal wassen met serumvrij DMEM / Ham's F-12. Voeg 1,5 ml medium E8 de kweekschaal en menselijke iPS cellen (10% van de cellen een confluente schaal). Dagelijks wassen cellen eenmaal met serumvrij DMEM / Ham's F-12 en voeg 1,5 ml vers medium E8.
    4. Om de passage cellen spoelen schotels tweemaal met PBS en voeg 1 ml PBS / 0,5 mM EDTA. Incubeer de schotels gedurende 5 min bij RT. Bewaak de cellen onder een microscoop. Opmerking: Wanneer de kolonies beginnen te ronden en appear om gaten dat ze klaar zijn voor de overdracht te hebben.
    5. Zuig de vloeistof, voeg 1,5 ml E8 middelgrote en los cellen door zachtjes en neer te pipetteren. Overdracht cellen om een 15 ml buis, centrifugeer 5 min bij 1200 rpm (300 x g), resuspendeer in 500 ul E8 medium en voeg 50 ul van de suspensie tot 1,5 ml E8 medium in vers kweekschaal gecoat met de basale membraan preparaat .

2. Ontwerp van Target-sequenties Across Borders Species

  1. Selecteer referentie menselijk, muizen en varkens cDNA sequenties van het doel genen (GAPDH, NANOG, GdF3) en het uitvoeren van een CLUSTAL multi-sequence alignment analyse.
    Opmerking: Dit zal de sequenties die homoloog aangeven tussen soorten.
    1. Gebruik de volgende instellingen voor meerdere alignment: gap penalty (vast) 10, gap penalty (wisselende) 5, de overgang weging 0, gap scheiding penalty range 8% identiteit voor vertraging 40, maximum aantal iteraties uit te voeren 3.
  2. Submit gewenste doelsequenties aan de fabrikant (zie tabel van Materialen) voor de sonde ontwerp en fabricage.
    Opmerking: De fabrikant zal dan bevestigen dat de compatibiliteit van gewenste volgorde met de technologie. Indien gewenst volgorde is niet compatibel is, zal de fabrikant suggereren alternatieve sequenties.
    1. Controleer of homologe gebieden die kunnen worden gebruikt als potentiële capture streng sequenties hebben een lengte van 27 bp.
      Opmerking: Het is raadzaam om verscheidene nanodeeltjes met verschillende capture strengen bestelling voor een gekozen doelwit gen als alleen de werkelijke cellulaire experiment definitieve bewijs van de functionaliteit van een sequentie geven. Derhalve twee verschillende sequenties voor GAPDH en GdF3 geëvalueerd terwijl drie verschillende nanodeeltjes werden getest om NANOG uitdrukking uit. Hun locatie en de exacte sequenties zijn elders 17 gepubliceerd. De fabrikant commercieel produceert de nanopartikelen met gewenste sequenties en voorziet hen in gevriesdroogde vorm.

3. Reconstitutie van Nanodeeltjes en Toevoeging aan Cell Cultures

  1. WINKEL gevriesdroogde nanodeeltjes na ontvangst bij 4 ° C in het donker.
  2. Reconstitueer nanodeeltjes door toevoeging van 50 gl dubbel gedestilleerd water met een eindconcentratie van 100 nM geeft. Eenmaal opgelost winkel nanodeeltjes bij RT in het donker. Opmerking: Onder deze omstandigheid zij stabiel gedurende ten minste één jaar. Opslag van gereconstitueerde monsters bij 4 ° C kan de stabiliteit nadelig beïnvloeden.
  3. Pre-Verdun de nanodeeltjes stockoplossing met PBS tot een concentratie van 2 (HEK 293-cellen) of 8 nM (iPS en ES cellen) op de dag van toepassing. Opmerking: Deze concentratie is 20-voudig hoger dan de eindconcentratie in de kweekschaal. In ES-cellen en iPS cellen, 400 pM van nanodeeltjes induceerde een fluorescentiesignaal gemakkelijk te detecteren onder de microscoop. Voor HEK 293-cellen, aconcentration van 100 pM voldoende.
  4. Pipet 12,5 ul van voorverdund nanodeeltjes tot een 24-putje met 237,5 ul compleet celkweekmedium. Voor putjes van verschillende grootte, het volume aan te passen. Swirl de plaat zorgvuldig gelijke verdeling van de nanodeeltjes te zorgen. Incubeer de cellen gedurende de nacht (O / N) bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige atmosfeer.
  5. De volgende dag te analyseren celculturen voor genspecifieke Cy3 fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 546 nm (emissie 575 - 640 nm) onder een fluorescentiemicroscoop. Opmerking: De voor een voldoende sterke fluorescentie te verkrijgen kan afhangen van het celtype en de doelwitgen periode. In deze experimenten, werd dit waargenomen tussen 16 en 20 uur na toepassing van de probe.

4. Identificatie van Cy3 Positieve Cell Populaties door flowcytometrie

  1. Groeien HEK 293 of muizen ES-cellen met behulp van de voorwaarden vermeld in punt 1.1 of 1.3, respectively. Eén dag voor de FACS-analyse toe GAPDH-specifieke nanodeeltjes bij verschillende concentraties 293-cellen (zie figuur 6A) en 400 pM hek ES-cellen muizen. Incubeer de cellen O / N bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige atmosfeer.
  2. Analyseer celkweken voor genspecifieke Cy3-geïnduceerde fluorescentie onder een fluorescentiemicroscoop.
  3. Los HEK 293-cellen, zoals gespecificeerd in punt 1.1.2. Centrifuge, over in een 1,5 ml buis en resuspendeer in 200 ul ijskoude PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA (FACS-buffer). Houd cellen donker op ijs tot flowcytometrische analyse.
  4. Los muizen ES-cellen, zoals gespecificeerd in punt 1.3.3. Centrifuge, over in een 1,5 ml buis en resuspendeer in 200 ul ijskoude PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA. Houd cellen donker op ijs tot flowcytometrische analyse.
  5. Druk de cellen door een 30 uM filter om celaggregatie voorkomen en propidium iodide voeg (2 ug / ml eindconcentratie) 2 minvóór de FACS analyse om dode cellen uit te sluiten.
  6. Om Cy3-positieve cellen eerst hiërarchische gates op het FSC-A / SSC-A deelverzameling te analyseren, het FSC-H / FSC-W-subgroep en de SSC-H / SSC-W deelverzameling. Met de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing celresten en cellen die niet zijn verspreid uitgesloten. Uitsluiten dode cellen door hun propidiumjodide kleuring tonen van PE tegen PE-Texas Red. Voer de uiteindelijke sorteerpoort on Cy3-PE positieve cellen (figuur 4).

Resultaten

In een eerste poging om te verifiëren en vast de intracellulaire detectie van genexpressie in levende cellen met behulp van nanodeeltjes besloten pilot experimenten met een constitutief tot expressie huishoudgen gen (GAPDH) in humane HEK 293-cellen. De concentratie van nanodeeltjes gebruikt in deze experimenten werd gekozen overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. De toevoeging van een GAPDH-specifieke probe aan het kweekmedium in een 100 pM eindconcentratie induceerde een duidelijke Cy3-fluorescentie in deze cellen waarin na O / N incubatie (Figuur 5A) toegankelijk werd onder een fluorescentiemicroscoop. Twee controles werden opgenomen in deze experimenten om het resultaat te onderbouwen. Een controle bestaat uit een zogenaamd "scramble" nanodeeltje waarbij de melder streng geen overeenkomende sequentie in zoogdier of eukaryotische cellen. De "scramble" nanodeeltjes bepaalt de niet-specifieke achtergrond fluorescence vanwege mogelijke sonde degradatie of onvolledige uitdoving van de fluorescentie. De toevoeging van de scramble probe leverde een marginaal fluorescentiesignaal, dat verwaarloosbaar (Figuur 5B). Een permanent fluorescerende "opname" bedieningsmechanisme kan het vermogen van cellen om de nanodeeltjes door endocytose op te nemen die kunnen variëren tussen de verschillende celtypen te bepalen. Deze positieve controle deeltjes produceerde een helder fluorescerend signaal in HEK 293-cellen (Figuur 5C). Zo is de haalbaarheid van de technologie om een ​​specifiek fluorescentiesignaal van een intracellulair gen met een verwaarloosbare achtergrondsignaal opnemen bevestigd. Er moet worden opgemerkt dat het verschil tussen het achtergrondsignaal en de specifieke fluorescentie tijd afneemt. De achtergrond neemt toe als gevolg van degradatie of onvolledige blussen sonde terwijl de specifieke fluorescentie verdwijnt langzaam (Figuur 5D). Dezelfde GAPDH-specifieke nanodeeltjesgetest in primaire fibroblast culturen van muizen, varkens en schapen herkomst 17. Deze cellen produceren een veel hoger achtergrondsignaal dan HEK 293-cellen, terwijl de doelwitspecifieke fluorescentie vrij zwak, mogelijk als gevolg van de relatief lage proliferatieve capaciteit van deze culturen.

Deze proef experimenten bracht ons ertoe deze technologie voor de detectie van pluripotentie genexpressie in iPS afgeleid van verschillende species. Hiertoe NANOG en GdF3 geanalyseerd, die beide bekend is dat ze tot expressie worden gebracht in pluripotente cellen 18. Op het eerste iPS cellen afkomstig van de staart-tip fibroblasten van een Nkx2.5 cardiale enhancer transgene muis lijn 19 werden onderzocht. Voor beide genen een sterk fluorescentiesignaal werd verkregen (figuur 6A) en een verwaarloosbare Cy3-fluorescentie van de scramble controle (gegevens niet getoond). Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor mens en varken iPS cellen (figuur 6B en C). Belangrijk is dat het fluorescentiesignaal beperkt tot de iPS koloniën en niet fibroblasten als een voedingslaag voor muizen en varkens iPS (zie pijlen in figuur 6A en C) label. De analyse van NANOG genexpressie bleek ook dat niet elke reeks voorspeld in silico "goede" eindelijk is functioneel. Een van de drie ontwerpen van NANOG -specifieke nanodeeltjes veroorzaakte vrijwel geen fluorescentiesignaal vergelijkbaar met dat van de controle, ondanks een scramble 100% match sequentie in muizen iPS-cellen (figuur 6D). Een soortgelijk resultaat werd verkregen bij iPS cellen van mens en varken oorsprong met deze probe (data niet getoond). Aldus kunnen nanodeeltjes gebruikt worden om pluripotentie genexpressie te detecteren tussen soorten grenzen terwijl de functionaliteit van elke probe ontworpen moet vooraf worden geëvalueerd.

De veelbelovende resultaten van de in situlabeling van levende cellen in celcultuurschalen ons aanleiding om genexpressie kwantitatief geanalyseerd door flow cytometrie. Daartoe GAPDH-specifieke nanodeeltjes toegevoegd met gegradeerde concentraties monolagen HEK 293 teneinde de labelingsefficiëntie in de doelwitcelpopulatie vergelijken. Zoals vastgesteld door fluorescentie microscopie een versterkt Cy3-geïnduceerde fluorescentie werd waargenomen met de laagste concentratie in vergelijking met cellen die de nanodeeltjes ontving. Toenemende concentraties van de nanodeeltjes induceerde een duidelijke concentratie afhankelijke fluorescentie van HEK 293-cellen in situ (figuur 7A). Het onderwerpen van deze cellen een flowcytometrische analyse bevestigde de concentratie afhankelijke labelingsefficiëntie. De frequentie van Cy3 positieve cellen aanzienlijk verhoogd (meer dan zevenvoudige) bij de hoogste concentratie van nanodeeltjes werd toegepast (figuur 7B). In verdere experimenten ES-cellen van de Nkx2.5 cardialeenhancer transgene muizenlijn 19 werden gebruikt om de expressie van genen pluripotentie geanalyseerd door flowcytometrie. Pilot experimenten met 400 pM van de opname positieve controle gaf duidelijk Cy3 positieve levende ES kolonies onder de microscoop en flowcytometrie gedetecteerde bijna 40% van Cy3 positieve cellen (figuur 7C). In tegenstelling, vergelijkbaar met onbehandelde cellen ongeveer 0,1% van de cellen behandeld met de positieve scramble gekleurd (gegevens niet getoond). Evenzo toevoeging van nanodeeltjes specifiek voor GAPDH, Nanog en GdF3 veroorzaakte een duidelijk fluorescentiesignaal in individuele kolonies in de celkweek schotel. De frequentie van Cy3 positieve cellen voor GAPDH zoals bepaald met doorstroomcytometrie vergelijkbaar met die zowel pluripotentie genen (figuur 7C). Dit resultaat is te verwachten als Nanog en GdF3 wordt ook gedacht aan constitutief in pluripotente ES-cellen worden uitgedrukt. Dus, deze gegevens duidelijk indicate dat cellen die een bepaald gen kan worden geïdentificeerd door flowcytometrische analyse, kwalitatief en hun relatieve hoeveelheid.

figure-results-1
Figuur 1: Schematische weergave van de structuur van de nanodeeltjes. (A) Structuur van een gen-specifieke nanodeeltjes. (B) Scramble nanodeeltjes (negatieve controle). (C) Opname nanodeeltjes (positieve controle). Aangepast van Lahm et al. 17, met toestemming van Wiley.

figure-results-2
Figuur 2: Toepassing van nanodeeltjes celculturen Een goed verdunde oplossing van nanodeeltjes gepipetteerd eenvoudig in het kweekmedium.. Na O / N incubatie gen-specifieke fluorescerende cellen zijn zichtbaar onder af luorescent microscoop.

figure-results-3
Figuur 3:. Actieve opname van nanodeeltjes door cellen via Endocytosis (A) Cellen actief overspoelen de nanodeeltjes door endocytose (B) Target mRNA bindt aan de capture streng en verdringt de fluorescerende reporter..

figure-results-4
Figuur 4: Gating strategie voor flowcytometrie. (A) strategie voor HEK 293-cellen. (B) strategie voor muizen ES-cellen. De gegevens werden verkregen met behulp van inrichting 1 voor HEK 293-cellen of apparaat 2 voor muizen ES-cellen en werden vervolgens geanalyseerd door een software tool (zie tabel van Materialen).

/53268fig5.jpg "/>
Figuur 5:. Analyse van GAPDH -expressie in HEK 293 cellen een GAPDH-specifieke nanodeeltjes werd aan de cellen toegevoegd met 100 pM (eindconcentratie) en fluorescentie werd afgelezen na O / N incubatie (A) GAPDH-specifieke nanodeeltjes (B.. ) Scramble (negatieve controle). (C) Opname (positieve controle). (D) Kinetiek van scramble en opname controle. De fluorescentie werd bepaald op de aangegeven tijdstippen na toevoeging van GAPDH-specifieke nanodeeltjes. Schaalbalken vertegenwoordigen 50 uM.

figure-results-5
Figuur 6:. Analyse van Pluripotentie genexpressie in iPS cellen van verschillende soorten nanodeeltjes specifiek voor NANOG of GdF3 werden toegevoegd aan de cellen bij 400 pM (laatste concentration) en fluorescentie werd opgenomen na O / N incubatie. (A) Muizen iPS-cellen. (B) van de Mens iPS cellen. (C) Porcine iPS-cellen. Pijlen in (A) en (C) wijzen ongelabeld fibroblast feeder-layer-cellen. (D) Fluorescentie in muizen iPS cellen na toevoeging van NANOG-ontwerp SF3 nanodeeltjes. Schaalbalken vertegenwoordigen 50 uM.

figure-results-6
Figuur 7: nanodeeltjes gelabelde levende cellen kunnen worden geïdentificeerd door middel van flowcytometrie. (A) Microscopische weergave van Cy3 positieve HEK 293 cellen na toevoeging van verschillende concentraties van nanodeeltjes. (B) Frequentie van Cy3 positieve cellen bepaald met flowcytometrie. (C) Levende kleuring van muis ES cel kolonies en bepaling van de frequentie van Cy3 positieve cellen. Nanodeeltjes werdenbij een uiteindelijke concentratie van 400 pM. Schaalbalken vertegenwoordigen 50 uM.

Discussie

Het huidige werk beschrijft het gebruik van fluorescentie-gelabelde nanodeeltjes die de betrouwbare evaluatie van intracellulaire genexpressie mogelijk maken direct in levende cellen van andere zoogdierspecies met diverse histogenetic oorsprong onder een fluorescentiemicroscoop. Deze benadering heeft een aantal voordelen vergeleken met andere gepubliceerde methoden. Allereerst de onderzoeker niet beperkt met betrekking tot zowel het doelgen of celtype. Alle antilichamen gebaseerde detectiemethoden worden beperkt tot een enkele epitoop. Hoewel fluorescerende moleculaire beacons kunnen ook worden ontworpen voor een breed spectrum van genen vereist deze werkwijze de dissociatie van de cellen en latere nucleofection 15. In tegenstelling, is de toepassing van gen-specifieke nanodeeltjes geen manipulatie van het doel cel die de nanodeeltjes overspoelt actief door endocytose nodig. Tijdens de daarop volgende passage gouddeeltjes geleidelijk laat de cellen en de cultuur kan worden gebruikt in downstream experimenten.

Toch is de technologie ook nog enige beperkingen. Enkele markers zijn uiteraard niet detecteerbaar door hun aard koolhydraat zoals SSEA-1 en TRA-1-81 20. Momenteel wordt een groot scala aan nanodeeltjes in de handel verkrijgbaar. Deze deeltjes werden vooraf getest op hun functionaliteit in cellulaire experimenten. Het doel van dit werk was om aangepaste probes die kunnen worden gebruikt in soorten grenzen te ontwerpen. Bij het ​​volgen van een dergelijke aanpak of bij het ​​ontwerpen van een sonde voor een nieuw target-gen moet men er rekening mee dat de functionaliteit van een in silico voorspelde sonde moet grondig worden geëvalueerd in vitro. De NANOG-SF3 sonde, die een 100% homologie bleek de sequentiehomologie werkte niet helemaal terwijl NANOG-SF1 met een niet passende basis in de muizen en varkens sequentie produceerde een mooie fluorescentie signaal. Een andere vraag heeft betrekking op de efficiënte opname van de nanodeeltjes. De deeltjes in te voerende cellen door endocytose, een proces dat wordt beïnvloed door de grootte van de nanodeeltjes 21, het celtype en de differentiatiestatus 22 en het cellulaire vermogen om phago- voeren en macropinocytose 23. De optimale concentratie van een bevredigende fluorescentiesignaal verkregen worden getest voor elke toepassing of cellijn. Daartoe moet het eerste experiment altijd de toepassing van de opname controle op de verenigbaarheid van de sondes in de cel typen en cultuur te evalueren alvorens over te gaan richten op specifieke detectie van genexpressie zijn.

Een kritisch punt om betrouwbare resultaten te verkrijgen bij toepassing van dit protocol op een nieuwe cellijn of celpopulatie is de opname van passende controles. De steeds fluorescerende opname besturing een hint waar de concentraties van nanodeeltjes voldoende fluorescerend signaal in de doelcel populatie induceert verschaffen. De fluorescentie moeten evaluerend de volgende dag als het signaal zal vervagen met de tijd 17. Tegelijkertijd de scramble controle zonder tegenhanger in het eukaryote genoom aangebracht in dezelfde concentratie verwaarloosbaar achtergrondsignaal moeten induceren. Als derde controle is het raadzaam om een nanodeeltje specifiek voor een huishoud-gen (bijv GAPDH, β-actine) gebruikt. Deze nanodeeltjes dienen als een positieve controle die de benadering kan worden gebruikt om genexpressie te detecteren in het gekozen doelwitcelpopulatie. Als deze controles blijken bevredigende men kan verwachten om betrouwbare specifieke fluorescente signalen te krijgen met behulp van nanodeeltjes die specifiek zijn voor andere doelgroepen genen. De concentratie van de toegepaste nanodeeltjes kunnen eveneens kritisch omdat zij bleken down-reguleren van de doelsequentie 24. Dit effect vergt veel hogere concentraties (5 nM) dan de concentraties die in de experimenten here (400 pM) voorgesteld. Bij deze concentratie verschafte de nanoflares hebben geen invloed doelwit-gen mRNA of eiwit niveau en de concentraties zo hoog als 2 nM hebben de proliferatie van HEK293 en muizen ES-cellen 17 niet aantasten. Bovendien heeft een hele genoom expressie analyse geen significante veranderingen in genexpressie 25 onthullen. Daarom, bij concentraties tot 1 nM de nanoflares mag geen Negatieve effecten vertonen.

Een veelbelovende toepassing van deze technologie is de mogelijkheid om een ​​bepaalde celpopulatie die wordt gekenmerkt door een specifiek gen label. Recent zijn genspecifieke nanodeeltjes succes gebruikt om selectief vlek levende hartspiercellen 26, subpopulaties van melanoomcellen 27, monocyten 28 en cerebellaire celculturen 29. Dergelijke fluorescentie gemarkeerde celpopulaties kunnen worden gesorteerd en gezuiverd met flowcytometrie als levende cellen. Op het gebied van oncologie is het denkbaar om levende uitgezaaide tumorcellen in diermodellen isolerenop basis van hun expressie van CEA, waardevolste zoekterm mogelijke metastase bevorderen genen of doelstructuren. We hebben onlangs aangetoond dat werkelijk geprogrammeerd muizen iPS kolonies kunnen worden geïdentificeerd in situ met Nanog -specifieke nanodeeltjes op basis van de gedetecteerde fluorescentie-intensiteit 17. Derhalve kan de identificatie van waarlijk geherprogrammeerd iPS kolonies worden uitgevoerd op hoge doorvoer platforms, die robotachtige fluorescentiedetectie plukken en apparaten om de meest veelbelovende kolonies te identificeren. Deze techniek lijkt geschikt te zijn in veel onderzoeksgebieden specifieke cellulaire subpopulaties selecteren en lijkt het mogelijk om de nanodeeltjes passen in high throughput platformen. Tot slot, dit protocol staat voor een nieuwe benadering met behulp van fluorescentie gelabelde nanodeeltjes die in levende cellen de detectie van intracellulaire genexpressie mogelijk maakt direct. Deze technologie kan een waardevol instrument om te zuiveren, uit te breiden en verder karakterize zeldzame cellulaire subpopulaties in veel onderzoeksgebieden.

Openbaarmakingen

HL is de nanodeeltjes van EMD Millipore Corporation gratis ontvangen. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Lynette Henkel voor haar uitstekende ondersteuning bij het uitvoeren van de flowcytometrische analyse. We danken Dr. Don Weldon en Dr. Victor Koong (Temecula, CA) voor het kritische lezen van het manuscript en de nuttige opmerkingen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft, KR-3770-7/1 en KR-3770-9/1 (M. K.), de Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Onderzoekssubsidie 2014 van de Deutsche Stiftung für Herzforschung en Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefäßchirurgie (M.-A. D.), en het Deutsche Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A en DZHK B 14-013SE (M. K.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamineBiochrome GmbHFG4815
Fetal calf serumLife TechnologiesSV30160.03
Penicillin/Streptomycin (100x)MilliporeA2213
Sodium pyruvate (100x)Life Technologies11360-039
DMEM high glucose with stable glutamineBiochrome GmbHFG0435
Mitomycin CRoche10 107 409 001voorkomt celdeling van MEF's
MEM niet-essentiële aminozuren (107 U/ml)Life Technologies11140-050
b-MercaptoethanolSigmaM3148
Leukemie-remmende factor (107 U/ml)MilliporeESG1107groeifactor voor murine ES- en iPS-cellen, voorkomt differentiatie
0,25% Trypsin/EDTA (1x)Life Technologies25200-056loslaat hechtende celculturen
Knockout serumInvitrogen10828-028supplement voor humane en porcine iPS-celcultuur
bFGFPeprotech100-18Bgroeifactor voor humane en porcine iPS-cellen
Collageenase IVWorthingtonLS004188dissociatie van varkens iPS-cellen
MatrigelCorning354277effectieve oppervlakte voor feeder-vrije cultuur van humane iPS-cellen, aangeduid als basement-voorbereidingsmembraan in het manuscript
E8 mediumStem Cell Technologies05940gedefinieerd medium voor feeder-vrije cultuur van humane iPS-cellen op Matrigel
EDTA 0,5 MInvitrogen15575-038
SmartFlare ProbesEMD Millipore Corporationaangepast itemdetectie van intracellulaire genexpressie in levende cellen, aangeduid als nanodeeltjes in het manuscript
FluorescentiemicroscoopZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 IncubatorThermo Scientific51026282
Gelatine (van varkenshuid)SigmaG6144verbetert de hechting van MEF's aan het oppervlak
Propidiumjodide (1 mg/ml)SigmaP4864labelt dode cellen in flowcytometrische analyses
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544aangeduid als apparaat 1 in Figuur 4
NaviosBeckman Coulter775213aangeduid als apparaat 2 in Figuur 4
FloJo vX 10.0.7r2Treestarsoftware voor analyse van flowcytometriegegevens

Referenties

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
  4. Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
  5. Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
  6. Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
  7. Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
  9. Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
  10. Marti, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  11. Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
  12. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  13. Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
  14. Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
  15. Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
  16. Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
  17. Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
  18. Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
  19. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  21. Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
  22. Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
  23. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).
  24. Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
  25. Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
  26. Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
  27. Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
  28. Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
  29. Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van genexpressiefluorescente nanodeeltjesanalyse van levende cellenflowcytometriefluorescentiemicroscopiesynthese van nanodeeltjesdetectie van doel mRNApluripotentiemarkersincubatie van celculturenfluorescentiekwantificering

Gerelateerde artikelen