Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de decellularisatie van Sprague Dawley rattennieren door antegrade perfusie van detergenten door het vaatstelsel, waardoor acellulaire nier extracellulaire matrices ontstaan die dienen als sjablonen voor herbevolking met menselijke nier epitheliale cellen. Recellularisatie en het gebruik van de resazurin perfusie assay om groei te monitoren wordt uitgevoerd binnen speciaal ontworpen perfusie bioreactoren.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de productie van acellulaire, maar biofunctionele, renale extracellulaire matrix (ECM) scaffolds die bruikbaar zijn als schaalmodel substraten voor orgaan- schaal weefselvorming zijn. Sprague Dawley ratten nieren gecannuleerd door het inbrengen van een katheter in de nierslagader en geperfuseerd met een reeks van lage-concentratie detergentia (Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat (SDS)) gedurende 26 uur aan intacte, hele nier scaffolds met intacte ontlenen perfusable vaatstelsel, glomeruli, en nierbuisjes. Na decellularisatie wordt de renale steiger geplaatst in een speciaal ontworpen perfusie bioreactor vat en de katheter nierslagader is verbonden met een perfusie circuit bestaat uit: een peristaltische pomp; buizen; en optionele sondes voor pH, opgeloste zuurstof en druk. Na het steriliseren het schavot met perazijnzuur en ethanol, en het balanceren van de pH (7,4), wordt de nier steiger voorbereid voor het zaaien via perfusie van kweekmedium binnen een large-vermogen incubator gehandhaafd bij 37 ° C en 5% CO _2. Veertig miljoen renale corticale tubulaire epitheel (RCTE) cellen worden geïnjecteerd door de nierslagader en snel geperfuseerd via scaffold onder hoge stroming (25 ml / min) en druk (~ 230 mmHg) gedurende 15 min voor het reduceren van de stroom naar een fysiologische tempo (4 ml / min). RCTE cellen vooral bevolken de buisvormige ECM niche binnen de renale cortex, vermenigvuldigen en vormen tubulaire epitheliale structuren meer dan zeven dagen van perfusie cultuur. Een 44 uM resazurin oplossing in kweekmedium wordt doorbloed door de nieren gedurende 1 uur tijdens medium beurzen een fluorometrische, redox-gebaseerde metabole beoordeling van de levensvatbaarheid en de proliferatie cel bieden tijdens tubulogenesis. De nier perfusiebioreactor maakt niet-invasieve bemonstering van medium voor biochemische evaluatie, en meerdere inlaatpoorten mogelijk alternatief retrograde zaaien door middel van de renale ader of urineleider. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om nier scaffolds met recellularizeverscheidenheid van celtypen, met inbegrip van vasculaire endotheliale, tubulaire epitheliale en stromale fibroblasten, voor een snelle evaluatie binnen dit systeem.

Inleiding

Aangezien het aantal patiënten met eindstadium nierfalen blijft toenemen, is er een ernstig en toenemend tekort in het aantal donornieren voor transplantatie beschikbaar. Het onvermogen om de vraag van een steeds toenemende aantal kandidaten voldoen wachten-vermeld voor niertransplantatie heeft onderzoek in de nier orgel techniek gevraagd met het uiteindelijke doel van het ontwikkelen van op maat gemaakte, implanteerbare nier enten op aanvraag ^1,2. Capaciteit opzetten nierweefsel uit eigen cellen van de patiënt zou de noodzaak van levenslang immunosuppressie elimineren, de hoeveelheid tijd die patiënten besteden dialyse wachten op een niertransplantatie verminderen en verlengt levensreddende transplantatie meer patiënten met chronische nierziekte.

De eerste stap naar een bioengineeringtechnieken nierweefsel behulp patiënt afgeleide cellen is een scaffold dat dient als een ondersteunend substraat voor renaal parenchym ontwikkelen (bijvoorbeeld buisvormig epitheLial), stroma fibroblasten en vasculaire celgroei. Biomaterialen afkomstig van natuurlijke orgel extracellulaire matrix (ECM) hebben een aantal kenmerken die hen wenselijk zijn voor gebruik in de tissue engineering, met inbegrip van hun natuurlijke biologische samenstelling maken; juiste macro- en microstructuur om fysiologische functie te voorzien; en cellulaire biocompatibiliteit, bevorderen celhechting, migratie en constructieve tissue remodeling ^3. Een veelbelovende werkwijze voor scaffolds voor renaal weefselregeneratie te produceren is door middel van cellen ontdoen van allogene of xenogene nieren dat veel van de complexe natuurlijke eiwitsamenstelling van de nier ECM ⁴ behouden, behouden de inherente architecturale complexiteit van het orgaan, en het overwinnen van de problemen in verband met bodem- up engineering van dikke cellularized weefsels door middel van een vasculaire levering aan de ontwikkeling van cellen na scaffold hercellularisatie ^5.

Perfusie decellularisatie is een procesdie detergentia, enzymen, of andere cellen verstoren oplossingen gelijkmatig afgegeven door het vasculaire netwerk van het orgaan ^6. Deze strategie is vastgesteld als een efficiënt proces een cellulaire-orgaan gebaseerde ECM scaffolds afgeleid driedimensionale (3D), biologische templates voor volle-organen ^6-8 techniek, zoals blijkt uit de ontwikkeling van acellulaire renale templates uit afgedankte menselijke nieren ⁹ en xenogene nieren afkomstig van grote dieren (bijvoorbeeld ¹⁰ varken, geit ¹¹⁾ en knaagdieren bronnen ^12. Met name het gebruik van kleine diermodellen zoals knaagdieren vergt minder cellen en kweekmedia, wat vooral nuttig voor orgel hercellularisatie studies waarin celaantallen meestal beperkt, zoals het geval is met stamcellen afgeleide weefsels. Het doel van de beschreven decellularisatie protocol is een acellulair nier ECM die kunnen worden gebruikt als een 3D steiger voor de regeneratie van nieren structur producerenes, waaronder nefron tubuli die herbevolkt dit voorbeeld menselijke renale corticale tubulaire epitheel (RCTE) cellen. We eerder beschreven onze strenge evaluatie van een optimale, detergens gebaseerde rat kidney ontcelling protocol ^7, die sneller (ongeveer een dag) dan andere methoden eerder beschreven (Ross et al .- 5 dagen ^12, Song et al .- 4,5 dagen ^13), en onthult het orgel in aanzienlijk lagere concentratie (0,1%) van het denaturerende natriumdodecylsulfaat (SDS) in cellen ontdoen dan eerdere rapporten ^12-15.

Een beperkt aantal studies hebben het gebruik van knaagdieren nieren voor decellularisatie en het daaropvolgende gebruik als een 3D scaffold voor cellulaire herbevolking beschreven ^12-16 (elders beoordeeld ^1). In dit protocol bieden wij een gedetailleerde beschrijving van onze eerder vastgestelde optimale strategie voor het produceren van cellen ontdoen acellulair nier scaffoldsvan Sprague Dawley rat nieren ^7. Met behulp van speciaal ontworpen perfusie bioreactoren staat dual zaaien en onderhoud perfusie cultuur ^17, recellularize we de acellulaire nieren steigers met menselijke RCTE cellen, die consequent de buisvormige component opnieuw te bevolken in deze gedecellulariseerde matrices, vermenigvuldigen en overleven in perfusie cultuur voor meer dan een week. We gebruik van de Resazurin perfusie assay tonen verder - een goedkope, niet-cytotoxisch en niet-invasieve metabole assessment vroeger voor cytotoxiciteit studies ¹⁷ - een indicatie van cellevensvatbaarheid en proliferatie in de recellularized nieren verschaffen tijd ^7.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Northwestern University goedgekeurd.

1. Nier Decellularisatie

1. Bereid decellularisatie oplossingen. Bereid de volgende hoeveelheden reagentia voor elke nier te ontceld, plus een extra volume (bijvoorbeeld voor 4 nieren, bereiden 5000 ml Triton X-100 voor stap 1.1.3.):
   1. Bereid 500 ml omgekeerde osmose water (ROH ₂ O). Opmerking: Als alternatief kan gedeïoniseerd water worden gebruikt in de stappen waar de ROH ₂ O wordt aangegeven.
   2. Bereid 1.000 ml Triton X-100, 1% (v / v) in ROH ₂ O. Langzaam voeg 10 ml Triton X-100-990 ml water in een grote beker onder snel roeren op een roer plaat. Laat het reagens volledig oplost vóór gebruik (minimaal 10 min).
   3. Bereid 1.000 ml Triton X-100, 1% (v / v) in ROH ₂ O (septemberderlijke volume).
   4. Bereid 1.000 ml natriumdodecylsulfaat (SDS), 0,1% (v / v) in ROH ₂ O. Voeg langzaam 5 ml SDS (20% voorraad-oplossing) tot 995 ml water in een grote beker onder snel roeren op een roer plaat. Laat het reagens gelijkmatig mengen vóór gebruik (minimaal 10 min).
   5. Bereid 500 ml ROH ₂ O (apart volume).
2. Bereid je nieren voor decellularisatie.
   1. Haal een nier van een mannelijke Sprague Dawley ratten (250-300 g) zoals eerder beschreven ^7.
      1. Verdoven de rat door intraperitoneale injectie van pentobarbital (50 mg / kg lichaamsgewicht). Vaak onderzoekt de diepte van de anesthesie (elke 10-15 min) door het toezicht op de respiratoire functie, hartslag en teen knijpen respons tijdens de operatie. Als het dier heeft een verhoogde ademfrequentie of positieve pedaal reflex, beheren een aanvullende dosis (met 1/3 tot 1/4 van de initiële dosis) van pentobarbital.
      2. Voer een longitudinale middellijn abdominal incisie naar de nieren, abdominale aorta en de inferior vena cava bloot te leggen.
      3. Injecteer 2000 USP eenheden heparine / kg lichaamsgewicht in de penis ader.
      4. Mobiliseer beide nieren door zachte dissectie. Zorgvuldig scheiden de nieren van de perirenaal vet, terwijl de renale capsule rond de nieren intact. Perfuseren de nieren met koude zoutoplossing (10 ml) door middel van infra-renale abdominale aorta.
   2. Plaats een 24 gauge katheter in de nierslagader, strak ligeren de katheter naar de slagader, en (met een injectiespuit) voorzichtig perfuseren van de nier met 10 ml koude fosfaat- gebufferde zoutoplossing (PBS) tot volledig duidelijk het orgaan bloed.
   3. Dompel nier in 25 ml PBS in een petrischaal en in een -20 ° C diepvriezer geleidelijk invriezen orgaan (waardoor induceren cellysis) voor opslag tot ontcelling.
      Opmerking: Indien gewenst, kan de ureter en / of renale ader worden van een canule voor retrograde zaaien, maar niet in thi omschrevens-protocol.
   4. Volledig ontdooien van de bevroren nieren (equilibriate bij kamertemperatuur (RT)), en voorzichtig perfuseren met 10 ml PBS aan het geligeerde nierslagader lekkage controleren. Als er lekkage of significante weerstand worden waargenomen, re-katheteriseren de nierslagader.
3. Bereid uitrusting voor decellularisatie. Monteer het van cellen ontdoen perfusie-systeem zoals weergegeven in Figuur 1B.
   1. Sluit een 8 "lengte van de peristaltische pomp buis (figuur 1D, f) tot twee voldoende lengtes (> 36" aanbevolen) van 1/16 "binnendiameter (ID) siliconenrubber buis (figuur 1D, h). Gebruik twee mannelijke Luer lock 1/8 "prikkeldraad adapters vergezeld door een vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer-adapter aan segmenten van de buis (figuur 1D, j) te sluiten. Plaats een extra male Luer lock op 1/8 "barbed adapter (figuur 1D, c) in het stroomafwaartse einde van de perfusie lijn voor bevestiging aan de renaleader katheter.
   2. Sluit elke peristaltische pomp slang segment van de 4-roller pompkop met behulp van een grote pomp cartridge.
   3. Na het plaatsen van het stroomopwaartse einde van siliconen rubber slangen in de eerste oplossing reservoir (ROH ₂ O), houdt u de "Prime" knop volledig prime elke perfusiecircuit met de oplossing. KRITISCHE: Controleer of er geen luchtbellen ingesloten blijft in de slang en het stroomopwaartse einde van het silicone rubber slang (opengelaten om vloeistof te trekken) onder de vloeistof-lucht grensvlak van het reagensreservoir bevestigd, zoals weergegeven in figuur 1B.
4. Voer de decellularisatie protocol bij RT ^7.
   1. Sluit de renale arterie katheter van elk ontdooid nier aan het einde van de perfusie circuitslang stroomafwaarts van de pomp, zodat er geen luchtbellen worden ingesloten in de catheter. Laat de nieren langs de binnenwand van een lege 5 L bekerglas (perfusaat verzamelreservoir geschorst, zie Figure 1B), zodat de nierslagader niet geknikt of opgerold.
   2. Stel de pomp rijden naar 5 ml / min, en druk op de knop "Start". Bevestig dat iedere nier perfusie door het observeren oplossingen druppelen uit de onderzijde van het orgaan.
   3. Perfuseren elke nier met de volgende reagentia op de in figuur 1A
      1. Perfuseren met 500 ml ROH ₂ O in 5 ml / min gedurende 1 uur, 40 min.
      2. Perfuseren met 1000 ml 1% Triton X-100 bij 5 ml / min gedurende 3 uur, 20 min.
      3. Perfuseren met 1000 ml 1% Triton X-100 in 1 ml / min gedurende 16 uur, 40 min.
      4. Perfuseren met 1000 ml 0,1% SDS bij 5 ml / min gedurende 3 uur, 20 min.
      5. Perfuseren met 500 ml ROH ₂ O in 5 ml / min gedurende 1 uur, 40 min.
         Opmerking: Elke cellen ontdane nier kan worden opgeslagen in PBS (zonder additieven) in een 50 ml conische buis bij 4 ° C gedurende ten hoogste twee weken vóór gebruik.

2. Perfusion Bioreactor Assembly, Nier Sterilisatie en Voorbereiding voor hercellularisatie

1. Bioreactor vaartuigen bereiden.
   1. Was de glazen bioreactor reservoirs (body component) en bioreactor hoofden met warme, verdunnen afwasmiddel oplossingen (bijv. 1% afwasmiddel oplossing in leidingwater) en goed naspoelen met leidingwater en daarna ROH ₂ O. Laat componenten volledig drogen.
   2. Breng een klein volume (~ 5 ml) siliconiseerproces reagens naar de bodem van elk reservoir. Zorg ervoor dat reagens bevochtigt de gehele onderkant gedurende enkele seconden, daarna uitlekken overtollige vloeistof.
   3. Laat de reservoirs te drogen in een zuurkast bij RT O / N. Alternatief kan reservoirs in een oven gedroogd bij 100 ° C gedurende 30 min te drogen versnellen en verbeteren de duurzaamheid van de coating, die bestemd is om hechting van cellen te voorkomen aan de bodem van het glazen reservoir bioreactor.
2. Bereid perfusiecircuit componenten voor sterilisatie (Figuur1D).
   1. Snijd de volgende stukken buis (per bioreactor):
      1. Knip twee 25 "lengtes van 1/16" ID siliconenrubber buis (figuur 1D, h).
      2. Snijd een 8 "lengte van de peristaltische pomp buis (figuur 1D, f).
      3. Snijd een 4.25 "lengte van 1/16" ID siliconen rubber slangen.
      4. Snijd twee 1 "stukken dikwandige 1/16" ID silicone rubber buis (figuur 1D, g).
      5. Snijd een 2 "lengte van 1/4" ID x 0.5 "buitendiameter (OD) siliconenrubber buis (figuur 1D, e).
   2. Bereid de volgende Luer adapters (voor elke bioreactor):
      1. Bereid 10 mannelijke Luer lock tot 1/8 'prikkeldraad adapters (figuur 1D, c)
      2. Bereid 2 mannelijke Luer stekkers (figuur 1D, a)
      3. Bereid 2 vrouwelijke Luer caps (figuur 1D, b)
      4. Bereid 5 vrouwelijke Luerx vrouwelijke Luer adapters (x5, figuur 1D, d)
   3. Was alle slangen en Luer adapters met warme, verdunnen afwasmiddel oplossingen, grondig spoelen in leidingwater en vervolgens ROH ₂ O, en laat ze drogen.
3. Monteer perfusie circuits.
   1. Slip 1 "lengte van dikwandige 1/16 'ID siliconen rubber slangen dan inlaat Luer acceptor verbonden aan de kop van de bioreactor. Plaats mannelijke Luer lock 1/8 "ID weerhaak adapter in open einde van de slang. Herhaal dit voor de andere inlaat Luer acceptor, en sluit een vrouwelijke Luer cap af te sluiten poort (bedoeld voor ureteral of veneuze zaaien technieken niet beschreven in dit protocol).
   2. Sluit elke 25 "segment van 1/16" ID siliconen rubber slang aan op de "segment van pompslangen met mannelijke Luer lock 8 tot 1/8" ID weerhaak en vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer adapters (figuur 1D, j).
   3. Sluit een open einde van siliconenrubber Tubing om de media perfusaat uitgang van de buitenkant van de bioreactor weg. Verbind de 4.25 "lengte van 1/16" ID slang aan de tegenoverliggende (binnenzijde) zijde van de media perfusaat uitlaat aan de binnenkant van de bioreactor weg.
   4. Sluit een mannelijke Luer lock aan 1/8 "ID weerhaken aan op het overblijvende open einde van de perfusie circuitslang. Sluit een vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer-adapter om de mannelijke Luer lock. Sluit de vrouwelijke luer x female luer adapter naar de open mannelijke Luer lock leidt naar de inlaat Luer acceptor op de bioreactor. Dit zal dienen als de media perfusaat inlaat leidt direct in de gecatheteriseerde nierslagader.
   5. Zorg dat er geen poorten op de bioreactor deksel open worden gelaten of worden blootgesteld. Nauw sluit de vacuümklep op bioreactor lichaam.
   6. Breng de bioreactor boven het reservoirlichaam, met een O-ring ingeklemd tussen de identieke groeven langs elke component. Plaats een metalen klem op de interface met de twee componenten bij elkaar te houden.
   7. Breng de vent-poort op de bioreactor hoofd met een 0,2 micron vent filter, het aansluiten van de twee onderdelen met behulp van een 2 "lengte van 1/4" ID x 0.5 "OD siliconenrubber buis (figuur 1D, e). Open de ontluchtingsklep.
   8. Iets draai de rode schroefdop op de bioreactor hoofd.
   9. Leg de resterende Luer adapters en 6 "gekartelde specimen tang in een autoclaaf zakje en afdichting.
4. Autoclaaf de samengestelde bioreactoren en mannelijke Luer pluggen.
5. Bereid de volgende reagentia voor steiger sterilisatie en middelgrote perfusie voor het zaaien (volumes worden vermeld per gedecellulariseerde nier):
   1. Binnen een zuurkast, voor te bereiden een 50 ml 0,1% perazijnzuur, 4% ethanol-oplossing door het toevoegen van 2,56 ml perazijnzuur-oplossing (39% voorraad concentratie) en 40 ml 200 proof ethanol tot ~ 957 ml ROH ₂ O in een 1 liter fles. Meng goed door herhaaldelijk omkeren fles, en plaats in biologische veiligheidskabinet.
   2. BereidenEen 150 ml 1x PBS oplossing, vooraf gesteriliseerd door autoclaveren.
   3. Bereid 50 ml DMEM / F12 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen-Strep).
6. Verzamel de resterende punten voor perfusiebioreactor montage. Plaats alle items in een biologisch veiligheidskabinet. KRITISCHE: Zorg ervoor dat de biologische veiligheid kabinet is uitgerust met het werken stopcontacten om de digitale pomp rijden de macht. Als alternatief gebruik maken van een verlengsnoer om de pomp rijden naar externe elektrische aansluitingen verbinden buiten de kast.
   1. Verzamel gedecellulariseerde nieren.
   2. Verzamel geautoclaveerd bioreactoren met aangehechte perfusie circuits.
   3. Verzamel geautoclaveerd zakje met Luer adapters en tang.
   4. Verzamel digitale pomp rijden met aangebouwde 4-roller hoofd en grote pomp cartridges (1 per perfusiecircuit).
7. Vul het perfusie circuit zoals beschreven in figuur 1C onder steriele caarden binnen een biologische veiligheid kabinet.
   1. Sluit een 3-weg kraan (figuur 1D, i) tussen het mannelijke Luer lock tot 1/8 "ID weerhaak adapter in de buurt van de media perfusaat inlaat en de vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer-adapter. Laat alle drie poorten op de kraan open is.
   2. Verwijder de rode schroefdop op de bioreactor kop en pipetteer 50 ml van de 0,1% perazijnzuur, 4% ethanol oplossing in het medium reservoir door de opening.
   3. Sluit de peristaltische pomp buissegment aan de pomp hoofd met behulp van een grote pomp cartridge. Stel het debiet tot 5 ml / min, druk op "Start", en laat het circuit aan premier.
      1. Als de vloeistof vult de perfusie lijn en de resterende open poort van de drie-weg kraan bereikt, sluit de poort met een mannelijke Luer plug (figuur 1D, a).
      2. Laat het circuit volledig prime totdat er geen lucht wordt waargenomen in het perfusiecircuit slang of op de binnenkant van de inlaat Luer acceptor. DIEN NODIGry, verhoging van het debiet tijdelijk luchtbellen te verdrijven uit de perfusie lijn. Wanneer deze volledig gevuld, stop de pomp drive.
   4. Sluit voorzichtig de vrouwelijke Luer einde van de renale arterie katheter in de mannelijke Luer inlaat acceptor op het binnenoppervlak van de bioreactor kop met een gesteriliseerde 6 "forceps. Zorg ervoor dat de aansluiting stevig vast zit en dat er geen lucht achterblijft in de katheter. Laat de nieren om voorzichtig hangen nierslagader katheter, zodat de nierslagader niet verdraaien of knikken.
   5. Draai de metalen klem bij elkaar houden van de bioreactor hoofd en het lichaam, zodat de bioreactor reservoir goed is afgedicht. Sluit de rode schroefdop op de bioreactor hoofd.
8. Steriliseren nieren bij kamertemperatuur door perfusie met 0,1% perazijnzuur, 4% ethanol oplossing bij 5 ml / min gedurende 1 uur, daarna drie opeenvolgende 1-uur perfusie bij kamertemperatuur met 50 ml PBS bij 5 ml / min.
   1. Veranderen van oplossingen:
      1. Na 1 uur, stop de pomp en open rode schroefdop. Met behulp van een steRILE (geautoclaveerd) Pasteur pipet voorzichtig alle oplossing uit de bioreactor reservoir zuigen. Laat de perfusiecircuit volledig gevuld.
      2. Pipetteer 50 ml verse oplossing in de bioreactor reservoir, sluit de schroefdop, en start de pomp.
9. Na de laatste PBS spoeling, aspireren PBS uit het reservoir en de pipet 50 ml DMEM / F12 medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen-Strep. Sluit de schroefdop, en breng de bioreactor met de bijgevoegde perfusiecircuit een grote capaciteit incubator gehandhaafd bij 37 ° C en 5% CO _2.
10. Eventueel overbrengen van de pompaandrijving naar de incubator. Sluit bioreactor perfusiecircuit de pomp en perfuseren de nieren bij 4 ml / min gedurende ten minste 1 uur vóór het zaaien.

3. Nier hercellularisatie met Renal Cortical tubulaire epitheelcellen

1. Warm voldoende hoeveelheden DMEM / F12 (gesupplementeerd met 10% FBS en 1% Pen-Strep) en cell dissociatie enzym cel heffen tot 37 ° C. Suggereerde volumes zijn hieronder opgesomd:
   1. Bereid 10 ml cel dissociatie enzym en 10 ml DMEM / F12 per 175 ^cm2 kolf voor het heffen.
   2. Bereid 5-10 ml DMEM / F12 per nier te worden gezaaid.
2. Verzamel voldoende kweekkolven de gewenste concentratie zaaien (4 x 10 ⁷ cellen geïmmortaliseerde humane RCTE ¹⁸ per results nier maximale enting van RCTE cellen met behulp van deze strategie enten).
3. Lift cellen van de kolven het gebruik van mobiele dissociëren enzym. Zuig medium uit fles, dan pipet 10 ml cel dissociatie enzym in de kolf. Cuvette in 37 ° C incubator dissociatie versnellen.
4. Controleer fles op een fase contrast microscoop om de 2 minuten tot de volledige dissociatie van de cellen van de fles oppervlak wordt waargenomen. Opmerking: Incubatietijd is afhankelijk van de mate van confluentie van de cellen, maar RCTE cellen require ongeveer 15 minuten volledig dissociëren.
5. Neem een ​​monster van gedissocieerde celsuspensie voorafgaande tellen tot pellets vermelden. Verdun de celsuspensie met een gelijk volume van voorverwarmde DMEM / F12-medium en centrifugeer bij 232 xg relatieve centrifugale kracht (RCF) gedurende 5 min.
6. Tel de cellen tijdens het centrifugeren. Verdun het verkregen monster met een gelijk volume van trypan blauw en pipetteer 10 pi in elk uiteinde van een hemacytometer om te tellen. Bereken noodzakelijk pelletverdunning volume op het gewenste zaaien concentratie (2 x 10 ⁷ cellen / ml) te verkrijgen.
7. Na centrifugeren Verdun de pellet met een geschikt volume kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 2 x 10 ⁷ cellen / ml te verkrijgen. Trek 2 ml van het zaaien suspensie in een steriele 5 ml spuit.
8. Breng de perfusie bioreactor naar een biologische veiligheid kabinet. Draai de plugkraan klep stroming dicht bij het zaaien poort. Verwijder de mannelijke Luer slip stekker uitde kraan, en sluit de spuit geladen met het zaaien ophanging.
9. Snel overdracht van de perfusiecircuit terug naar incubator, en gebruik de grote pomp cartridge om de pompslangen segment vast te zetten aan de pomp hoofd.
10. Cel zaaien: Sluit de kraan kleppoort wijst naar de pomp. Langzaam injecteren celsuspensie in nier, zodat de gehele suspensie wordt overgebracht van de spuit in de kraan en perfusie lijn. Draai de plugkraan klep stroming sluiten van de spuit, en start de pomp met 25 ml / min gedurende 15 min.
11. Na 15 min, laat het pompdebiet tot 4 ml / min. Exchange medium (volume van 100 ml voor latere wijzigingen) de volgende dag en daarna om de twee dagen.

4. Evaluatie van de levensvatbaarheid van de cellen en de proliferatie met Resazurin Perfusie Assay

1. Bereid resazurin reagens. Los 110,5 mg resazurin natriumzout in 100 ml PBS onder roeren en 1:10 verdund door toevoeging van 5 ml van deresulterende oplossing 45 ml verse PBS tot een 440 uM voorraadoplossing resazurin creëren. Filter-steriliseren (via een 0,2 urn spuitfilter) en bewaar de voorraadoplossing in een licht-beschermde 50 ml conische buis bij 4 ° C.
2. Bereid-resazurin aangevuld media controles. Bereid een 10% oplossing van Resazurin reagens in kweekmedium (bijv. 5 ml resazurine voorraadoplossing + 45 ml kweekmedium) maken resazurin werkoplossing. Autoclaaf een volume van 10 ml van de resazurin werkende oplossing in een licht-beschermde container. Opmerking: Hiermee zal verminderen Resazurin verbinding resorufine, en dient als een positieve controle voor het berekenen van percentage resazurin reductie.
3. Aliquot 1 ml elk van resazurin werkende oplossing (geoxideerd), autoclaaf resazurine werkende oplossing (gereduceerd) en kweekmedium alleen (blanco) in afzonderlijke 1,5 ml collectie buizen. Plaats open buisjes in hetzelfde incubator de perfusie bioreactoren.
4. Breng de nieren perfusiecircuit uit de incubator naar een biologische veiligheid kabinet. Verwijder de schroefdop van de bioreactor hoofd en aspireren kweekmedium van de bioreactor reservoir met behulp van een Pasteur pipet.
5. Pipetteer 10 ml van resazurin werkende oplossing in het reservoir, dicht schroefdop, en de overdracht van de nier perfusiecircuit terug naar de incubator.
6. Start de pomp bij 4 ml / min en laat reagens perfuseren via de nieren gedurende precies 1 uur.
7. Na 1 uur, stop de pomp, en de overdracht van de nieren perfusiecircuit om de biologische veiligheid kabinet.
8. Verzamel de airconditioning (gedeeltelijk gereduceerd) resazurin oplossing, en voeg 100 ml kweekmedium aan de bioreactor reservoir. Transfer perfusiecircuit om incubator, en hervatten flow (4 ml / min).
9. Pipet 100 pi (x 3 herhalingen) geconditioneerde resazurin oplossing, resazurine werkende oplossing, autoclaaf werkende oplossing, en de cultuur media lege in een zwart (dekkend) 96-well assay plaat. Lees fluorescentie-intensiteit (excitation: 540/35; emissie: 590/20) met behulp van een spectrofotometer.
10. Bereken procent reductie als een verhouding van fluorescentie-intensiteiten genormaliseerd door de fluorescentie-intensiteit (FI) gegenereerd door het geoxideerde Resazurin medium (ORM of resazurine werkoplossing niet blootgesteld aan cellen) of gereduceerde Resazurin medium (RRM of autoclaaf werkoplossing):% vermindering = 100 x {[FI (geconditioneerde resazurin oplossing) - FI (ORM)] / [FI (SRM) - FI (ORM)]}. Om resultaten te normaliseren, vermenigvuldig% reductie van circulerend volume (10 ml) en delen door incubatietijd (1 uur).

Resultaten

Nieren achtereenvolgens geperfuseerd met water en verdunde detergent oplossingen (1% Triton X-100, 0,1% SDS) volgens een vooraf vastgestelde optimale ontcelling protocol (zie figuur 1A, B) ^7, progressief transparanter gedurende een 26 uur periode, zoals figuur 2A. De resulterende acellulaire nier scaffold is verstoken van cellen en behoudt een samenhangende renale ECM ondersteund door een intacte renale capsule, die onbeschadigd na de perfusie protocol. Met het uiteindelijke ...

Discussie

De beschreven decellularisatie protocol produceert onder een geheel acellulaire nier ECM die dient als een 3D model voor kweken van menselijke renale corticale tubulaire epitheelcellen (zowel proximale als distale tubulus afgeleide), naast vasculaire endotheelcellen ^7,17. De gecanuleerde niervaatstelsel dient als spil voor de uniforme aflevering van reagentia en cellen door het scaffold in een bioreactor set-up, waardoor de doorbloeding decellularisatie, zaaien van cellen, langdurige perfusiekweek en de Resaz...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO	VWR	M143-4L
Sodium dodecylsulfaat-oplossing, BioUltra, voor moleculaire biologie, 20% in H2O	Sigma-Aldrich	05030
Perazijnzuur-oplossing, purum, ~ 39% in azijnzuur (RT)	Sigma-Aldrich	77240	Perazijnzuur is ontvlambaar en corrosief. Bereid in een afzuigkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen, veiligheidsbril).
200 proof ethanol	VWR	V1001TP
Sigmacote, siliconisatiereagens voor glas en andere oppervlakken	Sigma-Aldrich	SL2	Voor behandeling van bioreactorreservoirs. In de tekst vermeld als siliconisatiereagens.
DMEM/F12-media	Life Technologies	11320-033
Corning cellgro foetaal bovien serum premium, Mediatech	Corning	35-010-CV
Penicilline-Streptomycine-oplossing, 100X 10.000 I.U. Penicilline 10.000 µg/mL Streptomycine	Corning	30-002-CI
TrypLE Express (1X), Fenol Rood	Life Technologies	12605-028	In de tekst vermeld als celdissociërend enzym.
Trypan Blauw Kleurmiddel (0,4%)	Life Technologies	15250-061
Resazurin natriumzout	Sigma-Aldrich	R7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC	Cole-Parmer	EW-07522-20
Masterflex L/S grote cartridges voor 07519-05 en -06 pomphoofden.	Cole-Parmer	EW-07519-70	In de tekst vermeld als grote pompcartridge.
Masterflex L/S 8-kanaals, 4-roller cartridge pomphoofd.	Cole-Parmer	EW-07519-06
Rechte 6" specimentang, gekarteld	VWR	82027-438
*Nierperfusie bioreactor	WilMad Labglass	*Aangepaste ontwerpen	Bioreactoren worden geproduceerd zoals beschreven door WilMad Labglass. De ontwerpen zijn uitgebreid beschreven in een eerdere publicatie.
Perfusiecircuitcomponenten
24 G x 0,75 inch BD Insyte Autoguard afgeschermde IV-katheter (0,7 mm x 19 mm) gemaakt van BD Vialon biomateriaal. Heeft een uitgesneden naald. (50/st, 200/ca)	BD Biosciences	381412	In de tekst vermeld als 24 gauge katheter.
Masterflex PharMed BPT-slang, L/S #14, 25'	Cole-Parmer	HV-06508-14	In de tekst vermeld als slang voor peristaltiekpomp.
Peroxide-genezen siliconenslang, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack	Cole-Parmer	HV-06411-62	In de tekst vermeld als 1/16" ID siliconenrubberslang.
Masterflex platina-genezen siliconenslang, L/S 14, 25 ft.	Cole-Parmer	HV-96410-14	In de tekst vermeld als dikwandige 1/16" ID siliconenrubberslang.
VWR Siliconenslang, 1/4" ID x 0,5" OD	VWR	89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences	VWR	28143-558	In de tekst vermeld als 0,2 micron ventfilter.
Cole-Parmer Luer-adapters, mannelijke Luer-lock naar 1/8" ID, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	T-45505-11	In de tekst vermeld als mannelijke Luer-lock naar 1/8" gebarsten adapter.
Cole-Parmer Luer-accessoire, mannelijke Luer-plug, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45505-58
Vrouwelijke luer x vrouwelijke luer-adapter, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-22	In de tekst vermeld als vrouwelijke Luer x vrouwelijke Luer-adapter.
Cole-Parmer Luer-accessoire, vrouwelijke Luer-dop, Nylon, 25/pk	Cole-Parmer	EW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-weg Hi-Flo Stopcock met verlengde mannelijke Luer-lock, Non-DEHP-formulering, Latexvrij (LF), Lipidweerstand, Non-PVD, 50/cs	Careforde Healthcare	10254821	Smiths Medical (leverancier) catalogusnummer is #MX4311L.
Overige componenten
5 ml BD Luer-Lok wegwerpspuit met BD Luer-Lok™ tip.	BD Biosciences	309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Cultuurschaal	BD Biosciences	353001	Wordt gebruikt om celsuspensie in de spuit te trekken voor celzaaien.