Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

9.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53282

⸱

17 februari 2016

 ,  ,  , 
1Cell Division and Cancer Group, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), 2Centro de Investigaciones Biomédicas en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), 3Departmento de Biologìa Celular, Universidad de Valencia, 4Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona (IBUB), 5Department of Molecular and Translational Medicine, Fibroblast Reprogramming Unit, University of Brescia

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Samenvatting

Relatief rustige somatische stamcellen ondersteunen levenslange celvernieuwing in de meeste volwassen weefsels. Neurale stamcellen in de hersenen volwassen zoogdieren zijn beperkt tot twee specifieke neurogene niches: de subgranulaire zone van de dentate gyrus in de hippocampus en de ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ, ook wel subependymal zone of SEZ) in de wanden van de laterale ventrikels. De ontwikkeling van in vivo genoverdracht-strategieën voor volwassen stamcellen populaties (dwz die van de hersenen van zoogdieren) resulterend in lange termijn expressie van transgenen in de gewenste stamcellen en hun nakomelingen afkomstig is een cruciale rol spelen bij huidig ​​biomedisch en biotechnologisch onderzoek. Hier wordt een directe in vivo methode gepresenteerd voor de stabiele genetische modificatie van volwassen muizen V-SVZ cellen die gebruik maakt van de celcyclus-onafhankelijke infectie door LVs en de zeer gespecialiseerde cytoarchitecture van de V-SVZ niche. In het bijzonder, het huidige protocol te betrekkens de injectie van lege LVs (controle) of LVs codeert specifieke transgene expressiecassettes in hetzij de V-SVZ zelf, voor de in vivo targeting van alle cellen in de nis of in de laterale ventrikel lumen, voor het richten van ependymale alleen cellen. Expressiecassettes worden vervolgens geïntegreerd in het genoom van de getransduceerde cellen en fluorescerende eiwitten, eveneens gecodeerd door de LVs, zodat de detectie van de getransduceerde cellen voor de analyse van cel autonome als niet-autonome, niche-afhankelijke effecten van de gelabelde cellen en hun nakomelingen.

Inleiding

De muizen ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ), in de wanden van de laterale ventrikel tegenover het striatum, is een zeer actief germinale gebied waarin een continu proces van voorlopercellen celdeling en differentiatie leidt tot de aanhoudende productie van bulbus olfactorius (OB ) interneuronen en corpus callosum oligodendrocyten 1. De levenslange genereren van deze cellen blijkt te worden door de aanwezigheid in deze regio van neurale stamcellen (NSC's; ook wel B1 cellen), waarbij de astrocytaire antigeen glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) tot expressie en stamcel markers zoals nestine, Id1 en Sox2 2. GFAP expressie B1 cellen genereren transit versterken voorlopercellen (TAP) cellen (C-cellen), die tot expressie transcriptiefactoren Dlx2 (distale-less homeobox 2) en Ascl1 (zoogdieren Achaete-Schute homoloog 1) en verdeel snel een paar keer voordat ze aanleiding geven te migreren neuroblasts (A-cellen) of oligodendroblasts 3. Nieuw-gegenereerde ProlifERATIVE neuroblasts migreren naar voren, de vorming van de rostrale migratiestroom (RMS) aan de OB, waar ze te integreren in de granulaire en glomerulaire lagen zo gedifferentieerd remmende interneuronen. Migreren jonge oligodendroblasts verplaatsen naar de CC, waar ze worden onvolwassen NG2-positieve cellen die nog steeds lokaal splitsen of te differentiëren tot rijpe myeliniserende oligodendrocyten 1,4.

B1 cellen, die afkomstig zijn van foetale radiale gliale cellen behouden langwerpig en gepolariseerde morfologie van hun voorgangers en vertonen een zeer gespecialiseerde relatie met hun niche. Omspant tussen de ependyma welke lijnen de ventrikel en het netwerk van bloedvaten die de V-SVZ niche irrigeren. De kleine apicale proces van B1 cellen intercalaten onder multiciliated ependymocytes en eindigt in een enkele niet-beweeglijke primaire cilium, terwijl hun basale proces strekt zich lange afstanden naar de vlakke vasculaire plexus dat deze niche einde bevloeit in de b benaderenasal lamina van de plexus haarvaten 2,5-8.

De meest betrouwbare manier om B1-NSCs onderscheiden van niet-neurogene astrocyten, die ook GFAP +, in het intacte V-SVZ niche in gehele-mount preparaten van de ventrikel zijwand en de analyse van 3-D confocale microscopie na immunokleuring voor GFAP de dunne B1-NSC apicale proces, β-catenine label celmembranen af te bakenen, en ofwel γ-tubuline als een marker van cilial basale organen of geacetyleerde α-tubuline om het etiket van de omvang van elk cilium 5,8. Opmerkingen van deze hele mounts van de ventriculaire oppervlak hebben aangegeven dat B1 en ependymale cellen zijn opgesteld in "vuurraderen" 5, waarbij de uniciliated apicale processen van één of meer GFAP + B1 cellen worden omringd door een rozet van multiciliated ependymale cellen.

De karakteristieke morfologie van B1 cellen correleert met experimenteel bewijs indicating die de bloedvaten / endotheelcellen en ventriculaire cerebrospinale vloeistof (CSF), vormen geregeld bronnen van oplosbare signalen die op NSC 2,6,9-11. Bij de ventriculaire oppervlak, homotypische en heterotypische apico-laterale interacties van ependymale en B1 cellen omvatten krappe kruispunten en adherens kruispunten 5,12. Bovendien adhesiemoleculen betrokken bij de junctionele complexen tussen B1 en ependymale cellen, zoals N-cadherine en V-CAM, is aangetoond dat niet alleen de zeer georganiseerde positionering van B1 regelen de V-SVZ niche, maar ook hun rust 12 , 13. De ependymale-B1 cel monolaag lijkt te werken als een diffusiebarrière waardoor de afgestelde stroom van water en kleine moleculen uit de CSF, maar beperkt de doorgang van grote intercellulaire eiwitten 10,11. Experimenteel bewijs geeft aan dat de unieke positie B1 cel apicale cilium een rol kunnen spelen als een sensor van signalering Polypeptiden aanwezig in de CSF 2,5-7. Ependymale cellen zijn op zich een bron van oplosbare en membraangebonden signalen met een rol in de regulatie van NSC gedrag 14,15.

Traceerbaar nucleosiden, zoals broom- deoxyuridine (BrdU) of retrovirussen zijn op grote schaal gebruikt om progenitorcellen, waaronder NSCs label in vivo. Deze werkwijzen zijn niet optimaal voor de lange termijn gebeurt tracing omdat BrdU signalen verdund door herhaalde celdelingen en retrovirussen lijken preferentieel richten tijdelijk amplificeren van cellen als gevolg van de eis van celproliferatie voor transductie 16,17. Om NSC fysiologie in vivo, met inbegrip van interacties met niche componenten te onderzoeken, is het cruciaal om een methode om te labelen en te traceren zelden delende cellen, zoals B1-NSCs zijn grotendeels rustig en hun naburige ependymale cellen nooit verdelen onder fysiologische omstandigheden 3 vast te stellen. Hier laten we zien dat lentivirale vectoren (LVs) zorgen voor high-efficiency-gen marking en langdurige wijziging van volwassen NSCs en niet-delende ependymale cellen, vanwege meest redelijk om hun vermogen te transduceren en te integreren in het genoom van de doelcellen in een celcyclus-onafhankelijke manier. Verder tonen we aan hoe de route van aflevering en virale titer hulp specifiek transduceren ependymale cellen, maar niet B1 cellen waardoor de analyse van niche-afhankelijke, ependymale effecten op NSC toestaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

ETHIEK STATEMENT: Dit protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Universiteit van Valencia in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63 / EU.

1. Generatie van LV voor in vivo Markering Studies (zie figuur 1a)

LET OP: De procedure hier beschreven is bioveiligheidsniveau 2, dus het uitvoeren van de volgende procedures in een biohazard kap. Ervoor te zorgen dat onderzoek personeel voldoende gekwalificeerd en opgeleid in alle procedures. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder toga, dubbele handschoenen en geschikte oogbescherming. Tot slot grondig ontsmet alle gereedschappen en oppervlakken die in contact komen met virussen kunnen zijn volgens de goedgekeurde faciliteit desinfectie praktijken (door af te vegen met 70% ethanol, 10% bleekmiddel en / of behandeling in een autoclaaf).

  1. Productie van LV in humane embryonale nier 293T-cellen
    1. Begin dit protocol door het opstellen van zuiver DNA voor transfectie. Voor te bereiden en te zuiveren elk plasmide door dubbel CsCl gradseerde centrifugeren of andere commercieel verkrijgbare kolom methoden waardoor endotoxine-vrij DNA. In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de overdracht vector plasmide pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Aanbevolen kern verpakking plasmiden pMDLg / pRRE en pRSV.REV en envelop plasmide pMD2G 13,18,19.
    2. Vierentwintig uur voor transfectie, plaat 5 x 10 6 293T cellen in Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM) (zie Tabel Materials) in een 10 cm plastic schaaltje om een ongeveer 1/4 tot 1/3 confluente cultuur te verkrijgen transfectie. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van 5-7% CO2.
    3. Vervang het medium door vers medium 2 uur voor de transfectie.
    4. In steriele 1,5 ml microcentrifugebuis mengeling 10 ug plasmide transfervector (die het cDNA van het transgen of shRNA te leveren) met 2,5 ug van het pRSV.REV en 5 ug van het pMDLg / pRRE verpakking plasmiden en 3,5 & #181, g van de envelop plasmide pMD2G. Uitmaken van het plasmide oplossing tot een eindvolume van 450 gl met TE-buffer 0,1x (zie tabel of Materials) / dH 2 0 (2: 1). Voeg vervolgens 50 pl 2,5 M CaCl2.
    5. Vorm het precipitaat door druppelsgewijze toevoeging van 500 ul van de 2x Hepes gebufferde zoutoplossing (HBS, zie Tabel Materials) oplossing van 500 gl TE-DNA-CaCl2 mengsel terwijl vortexen op volle snelheid.
    6. Voeg het neerslag aan de 293T cellen onmiddellijk. Zwenk de plaat te mengen. De terugkeer van de cellen naar de incubator en verander het medium 14-16 uur na transfectie.
    7. Verzamel de cel supernatanten 30 uur na het veranderen van de media. Filter bovenstaande vloeistof door een 0,22 pm porie nitrocellulose filter en overgaan tot concentratie.
  2. Concentratie van LVs
    1. Concentreer het geconditioneerde medium door ultracentrifugatie bij 50.000 xg (19.000 rpm met SW-28 ultracentrifuge rotor) voor 2uur bij kamertemperatuur (RT) in een 30 ml polypropyleen conische rotor transparante buis.
      Opmerking: Gebruik ultracentrifuge adapters voor conische rotor buizen (zie tabel of Materials).
    2. Gooi de supernatanten door decanteren en resuspendeer de pellets in een klein volume (200 gl of minder als één wordt gecentrifugeerd) fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS, zie tabel of Materials). pipet dan op en neer ongeveer 20 keer.
    3. Verzamel de suspensies en opnieuw geconcentreerd door ultracentrifugatie, ook bij 50.000 x g (23.000 rpm met SW-55 ultracentrifuge rotor) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik polypropyleen transparant rotor buizen met een nominaal volume van 5 ml (zie tabel of Materials).
    4. Resuspendeer de uiteindelijke pellet in een zeer klein volume (1/500 en 1/1000 van het uitgangsvolume medium) steriel PBS en schud op een roterend wiel gedurende 1 uur bij KT. Opgesplitst in kleine hoeveelheden (5-20 pi) en fReeze ze bij -80 ° C.
    5. Behandel alle lege buizen met 10% bleekmiddel voor weggooien.
  3. Lentivirale titratie met flowcytometrie
    1. De dag voor, plaat 5 x 10 4 HeLa-cellen per putje in 6-well weefselkweek platen in 2 ml gemodificeerd Eagle's Medium Dulbecco's (DMEM) (zie tabel of Materials). Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator in een atmosfeer van 5-7% CO2 gedurende 24 uur.
    2. Op de dag van titratie ontdooien een monster van de virale voorraad bereiden seriële verdunningen van 10 tot 10 -3 -8, in DMEM.
      1. Hiervoor neem een ​​24-wells plaat en voeg 2 ml DMEM aan het eerste putje en 1,8 ml van de volgende putjes. Voeg dan aan het eerste putje 2 pi van het geconcentreerde virale voorraad (tot een uiteindelijke verdunning van 1: 1000 of 10 -3).
      2. Na pipetteren een paar keer om goed te mengen de oplossing, verandering tip en de overdracht van 200 ul van de 10 -3 verdunningde tweede put. Herhaal de procedure serieel de volgende putjes tot 10 -8 verdunning gemaakt.
    3. Neem HeLa-cellen vergulde de vorige dag uit de incubator. Haal medium uit putten. Voeg 1 ml van elke virale verdunning met 1 ui van 8 mg / ml hexadimethrinebromide de HeLa-cellen bevattende putjes. Zwenk de plaat te mengen.
      Opmerking: hexadimethrinebromide toegevoegd aan de virusadsorptie verhogen om de cellen in kweek.
    4. Zet de cellen in de incubator en laat de infectie verlopen gedurende 72 uur. Daarna verwijdert het medium, was de cellen eenmaal met PBS en voeg 200 ul trypsine-EDTA (zie tabel of Materials) aan elk putje.
    5. Na 5 minuten bij 37 ° C, voeg 2 ml PBS aan elk putje en oogst cellen in flowcytometrie buizen.
    6. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant.
    7. Resuspendeer de pellet met 1 ml van de vaststelling van solutiop (1% formaldehyde elektronenmicroscopie ruw en 2% foetaal runderserum in PBS), vervolgens vortex de buizen.
    8. Analyseer de cellen in een stroomcytometer onder toepassing van een 488 nm argon-ionlaser bij 15 mW vermogen.
    9. Stel het instrument met de standaard configuratie: forward-scatter (FS), side-verstrooiing (SS), en fluorescentie voor GFP (525/40 nm). Selecteer cel populatie gating in een FS vs. SS puntdiagram naar cel aggregaten en puin uit te sluiten. Verzamel fluorescentie in logaritmische schaal. Bereken het aantal GFP + cellen in elk monster.
    10. Bepalen vector titer met de volgende formule:% GFP + / 100 x aantal cellen geïnfecteerd x verdunningsfactor (DF) = transducerende eenheden (TU) / ml.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische voorstelling van de verschillende onderdelen van de procedure (a) deel 1 t.Hij protocol: generatie LVs voor in vivo labeling studies, de transfectie van HEK293T cellen met plasmiden geschikt om de LVs de bepaling van de virustiter te genereren door flowcytometrie met de aangegeven formule. De namen van de plasmiden en de centrifugerotoren aangegeven. (B en c) Deel 2 van het protocol: stereotaxische injectie van LVs. "B" toont een voorbeeld van een Vernier schaal een inrichting die onderdeel is van stereotaxische instrumenten en dient voor fijne metingen. Als voorbeeld, de pijlen 4,23 cm. Een Vernier schaal wordt gebruikt om de coördinaten in de antero-posterieure (AP), medio-laterale (ML) en dorso-ventrale (DV) as als getoond een bovenaanzicht (links) en een sagittale doorsnede recht bepalen ( ) van de hersenen. "C" geeft de positie van bregma als de snijlijn tussen de sagittale en coronale hechtingen. LVs worden geïnjecteerd met een spuit. (D) schematische tekeningen tonen hoe de hersenen is bewerkt voor analyse. De twee hersenhelften worden gesplitst en elk verdeeld in twee blokken. Block "a", die de OB, wordt geproduceerd door een coronale snede op de AP-niveau direct posterior aan de OB kruising met de telencephalon (bregma 2,46 mm, zie Paxinos' Atlas voor een referentie). Block "b" wordt geproduceerd door twee coronale snedes ter hoogte anterieure de rostrale aspect van het corpus callosum (bregma 1,7 mm) en een tweede ter hoogte van het kruispunt van de twee laterale ventrikels (bregma -0,22 mm). GL, glomerulaire laag; GCL, korrel cellaag; st, striatum; cc, corpus callosum; ac, commissura anterior; lv, laterale ventrikel.

2. Stereotaxische Injectie van LV in de V-SVZ / striatum Border of in de laterale ventrikel (zie figuur 1b)

  1. Voorbereiding
    1. Steriliseren een 5 ul capaciteit spuit met een 33 gauge naald door het sproeien beneden het lichaam en naald met 70% ethanol met de plunjertrok alles uit de weg. Herhaaldelijk aspireren ethanol uit een 1,5 ml microcentrifugebuis en werpen het helemaal uit meerdere malen, en spoel de spuit grondig met steriel water achteraf. Plaats de spuit veilig opzij in de cultuur motorkap en laat ze drogen.
    2. Bereid een biologisch gevaarlijk afval container met 10% bleekwater naar een geschikt volume voor immersie van alle afval van deze procedure (in het algemeen 200 ml in een container 500 ml).
    3. Bereiden en verwarm een ​​37 ° C waterbed vult een afsluitbare plastic zak met water en warmen tot 37 ° C. Dit zal toelaten muizen om te herstellen na de injectie.
    4. Verwijder virale voorraden van -80 ° C vriezer bewaren 1 uur voor aanvang van de injecties en plaats de flacon op een draaiend wiel bij RT. Na ontdooien behouden de virale voorraden op ijs in de tijd van de injecties. Vóór de stereotaxische injectie van LV verdunnen geconcentreerde virale voorraden 10 6 TU / ul PBS gebruik in de cultuur kap.
    5. Ontsmetten de voor het uitvoeren van de operatie met 70% ethanol gebied.
  2. Micro-injectie van LV
    1. Selecteer en steriliseren van instrumenten die nodig zijn voor de operatie (scalpel, boren, en kleine pincet).
    2. Verdoven een 6-8 weken oude muis door intraperitoneaal (ip) het injecteren van een veterinair begeleid mengsel van ketamine en medetomidine. Weeg elk dier en dosering elk met 50-75 mg ketamine en 0,5-1 mg medetomidine per kg lichaamsgewicht van de muis (ongeveer 100-125 pl van ketamine / medetomidine werkoplossing per muis).
    3. Beoordeel de verdoving vliegtuig door knijpen de tenen, staart of oor en ervoor te zorgen dat het dier vertoont geen reactie.
    4. Zodra de muis verdoofd, butorfanol injecteren subcutaan toegediend in een uiteindelijke dosis van 0,4-0,5 mg per kg muis gewicht postoperatieve pijn te minimaliseren.
    5. Scheer het gebied tussen de oren en desinfecteren van de huid met een jodofoor zoals iodopovidone of 70% ethanol. Reinigen met behulp van steriele katoen-tipped applicators. Wees voorzichtig niet om het dier te natte als dit onderkoeling kan verergeren.
    6. Plaats het dier in buikligging op een stereotaxische frame en zorgvuldig vast het hoofd met behulp van het oor bars en het gehemelte ondersteuning van het apparaat. Houd de muis met een verwarmingselement ingesteld op 37 ° C en oogheelkundige smeermiddel op de ogen.
    7. Maak een 1 cm lange incisie op de hoofdhuid in de lengte met behulp van een scalpel, en zachtjes trekken van de huid aan de schedel bloot te leggen met behulp van fijne pincet.
    8. Reinig voorzichtig het bot oppervlak met een steriel wattenstaafje. Reinig de blootgestelde schedel bot van de resterende weefsel.
    9. Monteer de gesteriliseerde spuit op de stereotactische apparaat met behulp van de spuit houder.
    10. Verplaats de spuitvergrendeling x, y en z-as totdat de punt van de naald wordt op het bregma, de samenhang punt waar het sagittale (langs- en mediale) hechtdraad loodrecht doorsneden door de coronale hechtdraad (Figure 1b). Zorg ervoor dat de "nul" positie van de dorso-ventrale (DV) as is op de schedel oppervlak op bregma.
    11. Verplaats de spuit aan de x en y coördinaten aankomst (zie tabel 1 en figuur 1b).
Regio van de injectie coördinaten
Antero-posterior (AP) Mediolaterale (ML) Dorso-ventrale (DV)
SEZ / striatum grens 0,6 mm 1,2 mm -3,0 mm
laterale ventrikel -0,3 mm 1,0 mm -2,6 mm

Tabel 1: stereotaxische coördinaten van de inuitsteeksels. Voor de AP en ML as, x en y coördinaten worden gegeven als een afstand (in mm) vanaf bregma. geeft "richting posterior" - "". Voor de coördinaten DV "nul" is het oppervlak van de schedel bij bregma punt en DV coördinaten geven de afstand (in mm) beneden vanaf dit punt.

  1. Annoteren x, y en z coördinaten bestemming bij de Vernier schaal om te kunnen terugkeren naar de injectieplaats komen later. Markeer het bot aan de x en y-coördinaten met een chirurgische markeerstift.
  2. Beweeg de spuit uit de buurt van het werkgebied.
  3. Met een elektrische boor een gat op de schedel niet zorgvuldig naar de hersenen aantasten. Raak de pial oppervlak niet boren, omdat dit de hersenen oppervlak kunnen beschadigen.
  4. Plaats de spuit met 1 pl van de 10 6 TU / ul virale oplossing. Gebruik een 33 gauge scherpe schuine naald wiens tip heeft een hoek van 10-12 °. Plaats de naald op een 90 ° angle opzichte van het hersenoppervlak.
  5. Beweeg de spuit terug naar de plaats van injectie en verplaats het naar beneden totdat de tip de pial oppervlak raakt.
  6. Doordringen in de hersenen met de spuit om de z-coördinaat in de DV as.
  7. Rustig uit virale suspensie met een snelheid van 0,2 ul / min, om schade aan het hersenweefsel die worden veroorzaakt door overmatige fluïdumdruk.
  8. Wacht tot 5-10 minuten naar het terugstromen van virale suspensie te minimaliseren en vervolgens terug te trekken de spuit heel langzaam. Blot overtollige vloeistof die aan het oppervlak kan verschijnen als gevolg van het terugtrekken van de spuit met een klinisch veeg en plaats deze direct in de bleekbevattende bioveiligheid afvalcontainer.
  9. Neem het dier uit de stereotaxische set, leg het op een warme pad, en sluit de wond met behulp van huidlijm. Keer de sedatie met behulp van 0,1-1,0 mg / kg lichaamsgewicht atipamezol.
  10. Injecteren Bupenorphrine subcutaan bij een uiteindelijke dosis van 0,1 mg per kg muis gewicht om de 12 uur,beginnend 4 uur na de toediening van de kortdurende Butorphanol pijnstiller.
  11. Plaats het dier in een individuele kooi met een warme pad en op de voet totdat de muis herstelt van anesthesie. Plaats een zak van hydrogel in de kooi van het dier hydraat na herstel te stimuleren.
  12. Gooi alle bio-afval en het bleekwater biohazard beschikking. Maak de spuit door aspiratie en uitwerpen van ethanol en spoelen met water. Ontsmet het gebied, de stereotactische set en de chirurgische materiaal dat is gebruikt met bleekmiddel en 70% ethanol.
  13. Houd geïnjecteerde muizen die in het bioveiligheidsniveau 2 ruimte voor 24-48 uur, waarna ze kunnen worden overgebracht naar een conventionele behuizing faciliteit

3. Histologische analyse

  1. Perfusie weefsel verzamelen, en snijden
    1. Diep verdoven de muizen met behulp van een veterinaire toezicht mengsel van medetomidine en ketamine (beoordelen van de verdoving vliegtuig door knijpen de toes, staart of oren), zoals eerder beschreven.
    2. Transcardially perfuseren de muizen met 25 ml zoutoplossing, gevolgd door 75 ml van 4% PFA in PB in hetzelfde tempo 17.
    3. Pak de hersenen en na oplossen door onderdompeling in ten minste 10 maal zijn volume aan koude 4% PFA in PB gedurende 1-16 h (toename na fixatietijden kan de immunoreactiviteit van bepaalde antigenen verminderen). Was grondig de resterende PFA met PB.
    4. Snijd de hersenen volgende indicaties van figuur 1d en lijm de resulterende blok aan de houder van een vibratome met behulp van cyanoacrylaat.
    5. Verzamel 30 urn dikke seriële coronale secties met behulp van een vibratome. Bewaar de hersenen plakjes in 24-putjes en met PB bij 4 ° C. Om besmetting te voorkomen, kan 0,05% natriumazide aan de PB-oplossing worden toegevoegd.
  2. immunohistochemie
    1. Incubeer de vrij zwevende gedeelten in blokkerende buffer (PB met 0,05% natriumazide, 1% glycine, 5% normaal geitenserum en 0,1% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden in een schudplatform.
    2. Haal de blokkerende buffer met een pipet, voeg een geschikte verdunning van anti-GFP konijn primaire antilichaam (zie tabel van Materialen) in het blokkeren van buffer en incubeer weefsel met deze verdunning gedurende 48 uur bij 4 ° C onder voorzichtig schudden.
    3. Wegwassen primaire antilichaamoplossing minste 3 maal met PB, een wasbeurt elke 10 min.
    4. Incubeer de vrij zwevende gedeelten met een verdunning van fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen) in blokkeeroplossing (zie tabel of Materials) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en voorzichtig schudden. Bescherm de secties van direct licht tijdens de incubatie.
    5. Wegwassen secundaire antilichaamoplossing met PB, 3 maal eens 10 min, en tegenkleuring het weefsel door incuberen van de secties met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) en 1 mg / ml in water gedurende 5 minuten. Afwassen de DAPI oplossing door spoelen twee keer en snel with water.
    6. Plaats voorzichtig de secties op een microscoopglaasje met een fijne kwast. Giet een paar druppels fixeermiddel voor fluorescerende preparaten (zie tabel of Materials) over het weefsel voorzichtig plaats een dekglaasje geplaatst en controleer of de bevestigingsoplossing juiste verdeling over het gehele oppervlak en er geen luchtbellen. Knijp voorzichtig naar beneden het dekglaasje om het overtollige montage medium af te voeren.
    7. Wanneer de bevestigingsoplossing uitdroogt (2-16 uur), analyseren monster door confocale laser scanning microscopie met de 488 nm laser.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

LV-gemedieerde genafgifte kan worden gebruikt voor de lange termijn in vivo transductie van cellen in volwassen muizen V-SVZ, waardoor hun tracking en genetische modificatie tijdens proliferatie, migratie en differentiatie. De infectie en de expressie zijn zeer effectief en geven talrijke cellen die gemakkelijk onderscheiden onder andere niet-geïnfecteerde cellen kunnen worden door de expressie van het opgenomen. We hebben tot dusver gevisualiseerd cellen getransduceerd met GFP fluorescente reporters, dankzij d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

LVs bieden belangrijke voordelen boven andere virale systemen voor de genetische modificatie van volwassen NSC 16,18. Stereotaxische levering van lentivirussen de V-SVZ niche vertegenwoordigt een efficiënte methode te labelen en te traceren zelden delen B1-NSC overwinnen van de beperkingen van andere gebruikelijke werkwijzen zoals BrdU, die verdund na meerdere celdelingen of retrovirus, die op doelcellen die prolifererende op het moment van toepassing. LVs, alsmede adenovirussen kunnen cellen ongeacht hun pos...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle manipulaties werden gemaakt in een bioveiligheidsniveau 2 kamer. Animal protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Valencia en waren allemaal in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63 / EU.

Dankbetuigingen

Wij erkennen de hulp van MJ Palop en de technische ondersteuning van de SCSIE van de Universiteit van Valencia. We danken ook Antonia Follenzi voor nuttige opmerkingen en bespreking van het manuscript. IF wordt ondersteund door Fundaciòn Botín, door Banco Santander via haar Santander Universities Global Division, en door subsidies van Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP en ISIC) en Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED en RETIC tercel) . Dit werk werd ook gesteund door BFU2010-21823 en RETIC tercel subsidies van MINECO en de European Research Council (ERC) 2012-StG (260511- PD-HUMMODEL) naar AC BM-P. is de ontvanger van een Spaanse FPI gemeenschap van de MINECO.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Onderdeel 1: Generatie van LV voor in vivo levering.
Apparatuur:
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima XL-100K
Ultracentrifuge rotorBeckman CoulterSW-28
Ultracentrifuge rotorBeckman CoulterSW-55
Ultracentrifuge buizen Beckman Coulter35812625 mm x 89 mm
Ultracentrifuge buizen Beckman Coulter32681913 mm x 51 mm
Ultracentrifuge adaptersBeckman Coulter358156
6-well plateSPLPLC-30006
24-well plateSPLPLC-30024
10 cm dishSPLPLC-20101100 x 20 style
FACS tubesAforaDE40080012 mm x 75 mm, 5 ml
Cup steriele FACS filterBD34062630 µm
Nitrocellulose filterMilliporeSCGPU05RE0.22 μm 
Flow cytometerBDLSR FortessaBlauwe laser 488 nm
Steritop filterBiofilFPE-204-500 0.22 µm
Reagentia:
pMDLg/pRRE plasmid Addgene#12251Core verpakkingsplasmide
pRSV.REV plasmid Addgene#12253Core verpakkingsplasmide
pMD2G plasmid Addgene#12259Envelope plasmid
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmid Addgene#12252Transfer vector plasmid
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium BiowestL0101-500Voor HeLa celcultuur
Iscove's Gemodificeerd Dulbecco's Medium Life technologies12440-053Voor 293T celcultuur
Tris-EDTA (TE)Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  DNAse/RNAse-vrij, 0.2 µm sterieel gefilterd
2x HBS0.28 M NaCl (Sigma, S7653), 0.05 M HEPES (Sigma, H7523), 1.5 mM anhydrous Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (bij voorkeur geen MilliQ). Breng pH naar 7.0 met NaOH oplossing (Calbiochem, 567530).
Fetal bovien serum (FBS)BiowestS181B-500Voorraad oplossing bij 100x, gebruikt om HeLa en 293T cultuur medium te bereiden bij een uiteindelijke concentratie van 10x.
GlutamineSigma-AldrichG7513-100Voorraad oplossing bij 200 mM, gebruikt om HeLa en 293T cultuur medium te bereiden bij een uiteindelijke concentratie van 6 mM.
NatriumpyruvaatLife technologies11360-039Voorraad oplossing bij 100 mM, gebruikt om HeLa en 293T cultuur medium te bereiden bij een uiteindelijke concentratie van 1 mM.
GlutaMAX SupplementLife technologies35050-061Gebruikt om 293T cultuur medium te bereiden bij een uiteindelijke concentratie van 1%.
Penicilline/streptomycineSigma-AldrichP4458Voorraad oplossing bevat 5.000 eenheden/ml penicilline en 5 mg/ml streptomycine. Gebruik om HeLa en 293T cultuur medium te bereiden bij een uiteindelijke concentratie van 1%.
Trypsine-EDTALife Technologies25200-056Met fenol rood, bevat 2,5 g varkens trypsine en 0,2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Fosfaat gebufferde saline  (PBS)Sigma-AldrichD1408Zonder calcium chloride en magnesium chloride, 10x, vloeibaar, sterieel gefilterd, geschikt voor celcultuur. Voorraadoplossing gebruikt om 1x PBS in celcultuurkwaliteit water te bereiden.
Polybren (hexadimethrine bromide) Sigma-AldrichH9268Poeder. Bereid een 1.000x voorraadoplossing bij 8 mg/ml in dHO
Paraformaldehyde EM grade 16%EM Sciences15710
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Onderdeel 2: Stereotactische injectie van LV in de SEZ proper of de laterale ventrikel.
Apparatuur:
Vernier stereotactisch instrumentNeuroLab, Leica39463001http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham muis en neonatale rat adapterNeuroLab, Leica39462950
SpuithouderKD ScientificKDS-311-CE
33 gauge spuitHamiltonP/N    84851/00#85RN
Elektrische boorFine Science Tool98096
Thermische dekenUfesaAL5512/01230-240 V, 100-110 W, type C_AL01
Shaver JataMP373NModel: beauty, 3 V, 300 mA, type HT-03.
Reagentia:
MedetomidineEsteveDOMTOR

Referenties

  1. Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
  2. Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
  3. Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
  4. Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
  5. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
  6. Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
  7. Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
  8. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
  9. Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
  10. Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow! Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  11. Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
  12. Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
  13. Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
  14. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
  15. Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
  16. Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
  17. Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
  18. Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
  19. Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  20. Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
  21. Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
  22. Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
  23. Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
  24. Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
  25. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Injectie van lentivirale vectorenventriculaire subventriculaire zonein vivo gentransfercelcyclusonafhankelijkdetectie van fluorescerende eiwittentargeting van ependymale cellengenetische modificatiemethodebrein van volwassen muisstabiele transgenexpressie
Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.