Methodenartikel

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

16.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53287

⸱

15 januari 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Samenvatting

In tegenstelling tot vaak gerapporteerde humane glioma xenograft-diermodellen, recapituleren GL261 muis glioma xenografts bijna alle relevante klinische en histopathologische kenmerken van de humane ziekte. Wanneer GL261 cellen intracranieel worden geïmplanteerd in syngene C57BL/6 muizen, heeft het model het extra voordeel van het behoud van een intact immuun micro-omgeving. Stabiele expressie van luciferase in GL261 cellen maakt niet-invasieve, kosteneffectieve bioluminiscentie monitoring van intracranieel tumorgroei mogelijk. We hebben recent aangetoond dat luciferase expressie in GL261 cellen de tumorgroei eigenschappen, immunomodulerende cytokine expressie van tumorcellen, infiltratie van immuuncellen in de tumor, of de algehele overleving van dieren met de intracraniale tumor niet beïnvloedt. Daarom lijkt het erop dat het GL261 luciferase glioma model nuttig kan zijn in de studie van nieuwe chemotherapeutische en immunotherapeutische modaliteiten. Hier rapporteren we de techniek voor het genereren van stabiele luciferase expressie in GL261 cellen en hoe de in vitro en in vivo groei van de tumorcellen te bestuderen door bioluminiscentie beeldvorming.

Inleiding

Maligne glioom is de meest voorkomende en dodelijkste hersentumor bij mensen. Zelfs bij behandeling met maximale chirurgische resectie, radiotherapie en chemotherapie, blijft de mediaanoverleving 15-20 maanden in grote hersentumorverwijscentra1, 2, 3. De meest agressieve vorm van kwaadaardig glioom, glioblastoma, wordt gekenmerkt door mitotische figuren, nieuwe vaatvorming, invasie in aangrenzende hersenen en pseudopalisaderende necrose. Orthotopische hersentumor xenografts met behulp van menselijke hersentumorcellen hebben een essentiële functie vervuld in neuro-oncologisch onderzoek en de preklinische translatie vergemakkelijkt voor het testen van nieuwe middelen, voordat ze worden toegelaten tot klinische onderzoeken bij mensen. Hoewel de meeste humane xenograftmodellen veel kenmerken van de menselijke ziekte nabootsen, is een fundamentele beperking van alle humane gebaseerde xenograftmodelsystemen het gebruik van immuungecompromitteerde dieren4.

De afwezigheid van een intacte gastheerrespons wijzigt duidelijk de tumorgroei, zowel in termen van tumormorfologie als efficiëntie van implantatie. Hoewel bepaalde aannames acceptabel zijn in de interpretatie van resultaten uit xenograftmodellen, is het bereiken van relevante conclusies op het gebied van therapeutische beoordeling een uitdaging. Bepaalde fundamentele biologische kenmerken zijn waarschijnlijk vergelijkbaar in immuungecompromitteerde en immuuncompetente dieren, maar andere zoals tumorgeassocieerde ontsteking, weefselinvasie, respons op letsel zijn waarschijnlijk heel verschillend. In tegenstelling daarmee is GL261 een chemisch geïnduceerde muisglioomcellijn die nauwkeurig glioom nabootst wanneer geïmplanteerd in de hersenen van immuuncompetente syngene C57BL/6 muizen5. Net als bij de menselijke ziekte, leidt intracranieel tumorgroei snel en reproduceerbaar tot neurologische symptomen en de dood van het dier6-10.

Subcutane tumorgroei kan direct worden gemeten. Intracraniële tumorgroei kan alleen worden gemeten met dierenoffer of met dure beeldvormingsstudies. Stabiele expressie van het enzym luciferase maakt non-invasieve en kosteneffectieve intracranieel bioluminiscentiebeeldvorming mogelijk11. Bioluminiscentie van luciferase getransfecteerde GL261 cellen correleert goed met intracranieel tumorgroei. We hebben onlangs GL261 rechtstreeks vergeleken met luciferase gemodificeerde GL261 cellen en hebben geen verschil aangetoond in in vitro groei en invasie, immunologisch cytokineprofiel, in vivo overleving van intracranieel tumordragende C57BL/6 muizen of immuuncelinfiltraat. Deze techniek is toepasbaar op preklinische glioblastoomstudies die non-invasieve monitoring van tumorgroei omvatten.

Protocol

Alle procedures hieronder beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Northwestern University goedgekeurd en uitgevoerd onder gesteriliseerde omstandigheden.

1. Wijziging van de GL261 cellen met vuurvliegluciferase Uiting Reporter

OPMERKING: HIV-1-gebaseerde lentivirale vectoren tot expressie vuurvlieg luciferase (Fluc) onder controle van de milt focus vormende virus (SFFV) promoter. De optische reporter gen is gekloneerd in de vector plasmide pHRSIN-CSGW-dlNotI.

  1. Handhaaf 293-T-cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en GL261 cellen in RPMI medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 95 % lucht en 5% kooldioxide (CO 2).
  2. Wanneer de 293-T celkweek bereikt 80% confluentie in een T-75 kolf, was de cellen eenmaal met phosphate buffer zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 +, Incubeer de cellen met 3 ml trypsine (0,05%) bij 37 ° C gedurende 5 min, fijnstampen met een pipet 5 ml van met de kolf enigszins schuin en verzamel alle cellen van de bodem van kolf. Breng de 3 ml trypsine celsuspensie in een 15 ml conische buis en voeg 7 ml vlees RPMI medium (in totaal 10 ml van de celsuspensie).
  3. Meng de celsuspensie goed met een pipet 5 ml. Neem 100 ul van de celsuspensie uit de buis en tel het aantal cellen met behulp hemocytometer. Hiervoor mix 100 ul van de celsuspensie met 300 pi trypan blauwe oplossing en voeg 2 pl van het mengsel in een hemocytometer. Tel het aantal cellen zonder blauwkleuring vier verschillende weergaven onder een microscoop. Het gemiddelde aantal cellen van elke weergave, omdat dit getal vertegenwoordigt 10 4 cellen / ml.
  4. Ondertussen, centrifugeer de buis met de celsuspensie bij 300 xg gedurende 7 min. Zuigen de media en resuspendeer de cel pellets met verse RPMI medium om een GL261 celsuspensie te maken op de dichtheid van 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 GL261 cellen met 2,5 ml RPMI-medium in een T-175 kolf met 27,5 ml DMEM (dag 1).
  5. Na 24 uur, vervang het medium met 20 ml vers DMEM (dag 2).
  6. Om de lentivirale vector produceren, meng 54 pl transfectie reagens met 2 ml serumvrij DMEM gedurende 5 min. Voeg 3 ug gag-pol, 3 ug van vesiculaire stomatitis G envelope (VSV-G), en 4,5 ug Fluc (pSIN-Fluc) in de DMEM met transfectie reagens en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Laat de gehele DNA-mengsel in 293-T kolf (T-175) en incubeer bij 37 ° C in een vochtige kamer met 95% lucht en 5% CO2 gedurende 48 uur (dag 2).
  7. Voeg 10 ml vers DMEM bij 24 uur na transfectie (totaal volume van 293-T celkweekmedium moet ongeveer 30 ml) (dag 3).
  8. Om GL261 cellen gesplitst in een24-wells plaat, was de cellen eenmaal met PBS zonder Ca2 + en Mg2 +, Incubeer de cellen met 5 ml trypsine (0,05%) bij 37 ° C gedurende 5 min, fijnstampen met een pipet 5 ml van met de kolf enigszins gehelde Verzamel de cellen van de bodem van de kolf, en tel cellen via hemocytometer zoals in stap 1,2. Ondertussen, centrifugeer de buis bij 300 xg gedurende 7 min. Zuigen de media en resuspendeer de cel pellets met verse RPMI medium om een GL261 celsuspensie te maken op de dichtheid van 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 GL261 cellen met 1 ml RPMI medium in een 24-well plaat (dag 3).
  9. Verzamel 30 ml van de lentivirale supernatant met 10 ml pipet uit de 293-kolf T (T-175) en 48 uur na transfectie en overdracht van de supernatant in 50 ml conische buis. Zuig het lentivirale 30 ml bovenstaande vloeistof via een injectiespuit 50 ml, door een 0,22 urn spuitfilter en aliquot het virale supernatant in 1 ml aliquots (dag 4).
  10. Vervang 1 ml RPMI middelmatige GL261 celplaatelektrode (24 putjes) met 1 ml van het supernatant lentivirale en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde kamer (dag 4).
  11. Na 48 h lentivirale infectie, vervang het medium met 1 ml vers RPMI (dag 6).
  12. Na 24 uur, herhaal de lentivirale infectie van de GL261 cellen (dag 7).
  13. Na de 2 e 48 h lentivirale infectie, vervang het medium met 1 ml vers RPMI (dag 9).
  14. Blijf de luciferase gemodificeerde GL261 cellen groeien (hierna aangeduid als GL261.luc cellen) en vergroten de celkweek aan een T-75 kolf.
  15. Wanneer de GL261.luc celkweek bereikt 70% confluentie in een T-75 kolf oogst van de cellen door behandeling met trypsine en tellen met een hemocytometer zoals in stap 1,2. Plate de GL261.luc cel in een 24-wells plaat bij afstuderen dichtheden (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 cellen / putje) en incuberen bij 37 ° C in een luchtbevochtigerfied kamer die 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur.
  16. Meet cellulaire luciferase activiteit ten opzichte Luciferase gemodificeerde U-87 MG (U87.luc) cellen met behulp bioluminescentie (figuur 1).
    1. Start de afbeelding software (klik op het pictogram op het bureaublad) en initialiseer de imaging-systeem (klik op "Initialize" knop). Initialisatie begint automatisch en kan enkele minuten duren voordat het systeem check-up en de camera afkoelen tot -90 ° C.
    2. Voeg 25 pl luciferine (D-luciferine kaliumzout, 150 mg / kg) in elk putje.
    3. Incubeer de cellen met luciferine gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en de plaat voor 10 sec. Het opzetten van de imaging-systeem, selecteer "Lichtende", "10 sec" belichtingstijd, en "Medium" binning. Plaats de 24-well plaat op de imaging-station en klik op de "Acquire" knop om de afbeelding te starten.
    4. Nadat het beeld met succes is overgenomen, zal u een beeld venster en het gereedschap pa zienlette op het scherm. Klik op "ROI (regio's van belang) Tools" en selecteer 6 x 4 van het pictogram spleet. Maak 6 x 4 spleten aan de oppervlakte van het signaal op het imago van de 24-well plaat bedekken en klik op het tabblad metingen (potloodje). Observeren een venster met een lijst van ROI metingen eenheid van fotonen per seconde per steradiaal per vierkante cm (fotonen / sec / sr / cm2).
    5. Gebruik U87.luc cellen, eerder bewerkt met dezelfde lentivirus hier gebruikt voor GL261 modificatie 11, als een controle voor de beoordeling van luciferaseactiviteit in getransduceerde GL261.luc cellen.

2. In vitro Proliferatie assay

  1. Wanneer de GL261 en GL261.luc celculturen 70% confluentie bereiken in een T-75 kolf oogsten beide cellijnen door behandeling met trypsine en tellen als in stap 1,2, en plaat cellen in een 96-putjesplaat met een dichtheid van 1500 cellen in 80 ul van RPMI medium per putje met behulp van een multichannel pipet om tijd en pipetteren fouten te minimaliseren. Seed elke cellijn in 20 putten totaal. De verdamping in de putjes bevolkt door cellen te beperken, vul lege putjes met 100 pl vers RPMI medium.
  2. Beoordeel de cellulaire proliferatie met behulp van een colorimetrische celproliferatie assay. Hier gebruiken we de MTS-celproliferatie assay. Een multi-kanaal pipet wordt 20 pl MTS reagens in elk putje van de 96-well plaat die de cellen bevat.
  3. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een vochtige kamer met 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. Meet absorptie bij 490 nm met behulp van een microplaat reader. Dit wordt herhaald op dag 1, 2, 4 en 7 na plating. Om absorptiewaarden normaliseren, worden de waarden van elke dag gedeeld door de overeenkomstige waarden verkregen op dag 1 (Figuur 2).

3. Tumor Cell Implantatie

Opmerking: Autoclaaf alle apparatuur. Bereid chirurgische gebied door het sproeien van een ontsmettingsmiddel (2% chloorhexidine oplossing) en bedek met absorbent gordijnen. Om steriele omstandigheden te handhaven, dragen steriele chirurgische handschoenen tijdens de operatie, en verdeel de chirurgische gebied in twee gebieden door kleur tape. Area 1 wordt het label "schoon" en bevat gesteriliseerd leveringen; Area 2 is gelabeld "vuile" en bevat gebruikte materialen.

  1. Voorafgaand aan chirurgie dier, bereiden een celsuspensie voor intracraniale injectie. Oogst cellen uit een 70% confluente T-75 kolf door behandeling met trypsine en tel cellen via hemocytometer zoals in stap 1,2, en een celsuspensie bij een dichtheid van 1,0 x 10 5 cellen / gl in Hanks 'uitgebalanceerde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg 2+ (HBSS).
  2. Verdoven muizen met intraperitoneale injectie van 200 pi mengsel dat 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine in 0,9% zoutoplossing. Om een ​​goede verdoving te bevestigen, knijp de teen van de muis. Als de muis volledig onder narcose moet de muis niet reageert op de stimulus.
  3. Toedienen van 0,1 mg / kg buprenorfine via subcutane injectie aan de postoperatieve pijn te verlichten.
  4. Scheren de bovenkant van het hoofd van de dieren met behulp van klippers en schoon met een katoenen tip applicator gedoopt in 2% chloorhexidine-oplossing. Gelden oogzalf om adequate smering tijdens de operatie te behouden.
  5. Maak een sagittale incisie ongeveer 1 cm lang over de parietooccipitalis bot met een steriele scalpel. Om de bregma visualiseren, veeg het oppervlak van de schedel met een katoen-tip applicator gedrenkt in een 3% waterstofperoxide-oplossing.
  6. Boor de schedel met een steriele 25-G naald een klein gat 3 mm rechts van de bregma en net achter het coronale hechtdraad maken.
  7. Opdat intracraniële injectie is tot een diepte van 3 mm van de schedel, cut 3 mm van de punt van een 20 ul pipetpunt met een schaar en plaats een injectiespuit in de pipetpunt.
  8. Steek de spuit loodrecht op het gat eerder gemaakte, en injecteer langzaam de tumorcel suspensioen met 3,0 x 10 5 cellen in 3 ul HBSS, over een periode van 1 min. Laat de naald in de plaats voor nog een minuut, en dan langzaam trek de naald.
  9. Zwabberen de schedel met katoen-tip applicator gedoopt in 3% waterstofperoxide en de 2% chloorhexidine-oplossing. Droog het oppervlak van de schedel met de katoen-tip applicator. Knip de steriele bot was ongeveer 3 mm 3 in grootte en bevestig het bot was op het einde van het katoen-tip applicator. Breng de been was om het gat met de katoen-tip applicator dekken.
  10. Teken de beide zijden van de hoofdhuid elkaar via schedel behulp van een tang en nieten om de wond te sluiten. Reinig de wond met een katoen-tip ondergedompeld in 2% chloorhexidine-oplossing.
  11. Monitor alle muizen post-operatief totdat ze ambulante en behouden normale activiteit. Gewoonlijk hersteltijd bedraagt ​​ongeveer 30 minuten. Laat de muizen niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig hersteld van anesthesie.

4. Bioluminescentie beeldvorming van GL261 tumorgroei

  1. Spray een ruime hoeveelheid ontsmettingsmiddel (0,05% dimethyl ammoniumchloride-oplossing) op een schone papieren handdoek. Gebruik de-desinfectiemiddel gedrenkte papieren handdoek grondig vegen de zwarte plaat, neus kegels en verdeler in de beeldvorming kamer waar de dieren in contact komen met het apparaat. Grondig veeg alle oppervlakken met een schone, droge papieren handdoek. Herhaal dit nog een keer en wacht 5 min.
  2. Initialiseren van de imaging station in stap 1.14.1.
  3. Verdoven de muis met een 300 pi mengsel dat 200 pl ketamine / xylazine en 100 pl luciferine (D-luciferine kaliumzout, 150 mg / kg) door intraperitoneale injectie.
  4. Wacht 10 minuten na de injectie en bevestigen als de muizen volledig onder narcose door knijpen de staart. Het opzetten van de imaging-systeem, selecteer "Lichtende", "Auto" belichtingstijd, en "Medium" binning. Plaats de muizen op de beeldvorming statiop en klik op de "Acquire" knop om de afbeelding te starten. Zorg ervoor dat de tijd na de injectie is consistent met elke opnamesessie.
  5. Nadat het beeld met succes is overgenomen, moet een beeld raam en palet verschijnen. Klik op "ROI Tools" en selecteer "auto" van het icoon cirkel. Om ROI te definiëren, omringen het gebied van het signaal op de afbeelding, en neem dan de metingen van de ROI als eenheid van fotonen / sec / sr / cm2.
  6. Neem de muizen uit de beeldvorming kamer en het toezicht op de muizen totdat ze ambulante en behouden normale activiteit. Typisch hersteltijd is ongeveer 15 min. Laat de muizen niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig hersteld van anesthesie.
  7. Monitor tumorgroei door bioluminescentie tweemaal per week totdat aanwezige dieren de volgende symptomen: gewichtsverlies (verlies van meer dan 20% van het gewicht vóór de implantatie), gebrek aan eetlust (complete anorexie voor 24 uur), en een gebrek aan duurzame purposeful respons op zachte stimuli (weak poging om omhoog), waarna ze moeten worden gedood. Euthanaseren dieren met deze symptomen met een CO 2 kamer, gevolgd door cervicale dislocatie.
    1. Plaats muizen in de euthanasie kamer (niet overvol de kamer) en de instroom samengeperst CO 2 voor 5-6 min. Merk op dat alle dieren zijn bewusteloosheid en niet na ongeveer 5 min ademhalen.
    2. Neem de muizen uit de kamer. Zorg ervoor dat het hart niet klopt door het gevoel van de borst tussen duim en wijsvinger en controleer of er geen blink reflex.
    3. Weerhouden de muis in een buikligging op een vlakke ondergrond en het grijpen van de achterkant van de nek aan de basis van de schedel met de ene hand en de basis van de staart met uw duim en wijsvinger van de andere hand.
    4. Restrain het hoofd en snel de staart te trekken naar achteren. Zorg ervoor dat de schedel is gescheiden van de eerste halswervel met duim en wijsvinger.
  8. Normalize luminescentie waarden voor elke dag tegen corresponderende metingen verkregen bij de eerste dag van bioluminescentie als in stap 2,3 (Figuur 3A).
  9. Voor statistische analyse, het genereren van overlevingscurven met behulp van de Kaplan-Meier schatter 12 en vergelijk de verschillen tussen overlevingscurven met behulp van een log-rank test 13.

Resultaten

GL261 cellen werden geïnfecteerd met luciferase bevattende lentivirus zoals hierboven beschreven in stap 1. In vitro bioluminescentie illustratie robuuste luciferase-expressie vergelijkbaar met niveaus in de positieve controle U87.luc humane glioblastoma cellijn (Figuur 1). Zoals verwacht, niet-geïnfecteerde GL261 cellen tonen geen achtergrond luciferase expressie. Deze stap is eenvoudig cruciaal te voeren voordat verdere studies op de geïnfecteerde cellijn stabiele luciferase expressie te bevestigen.

Luciferase-expressie na intracraniale implantatie.

Voor intracraniale implantatie we lieten geen verschil in vitro groeisnelheid van GL261.luc opzichte GL261 cellen (Figuur 2). Voor intracraniële groei en overleving analyse werden cellen geïnjecteerd in de brAins van C57BL / 6 muizen per protocol stap 3. tumorgroei in muizen die tumoren GL261.luc werd serieel geanalyseerd op bioluminescentie beeldvorming met behulp protocol stap 4 en toonde detecteerbare tumorgroei (Figuur 3A). Muizen snel en consequent lager GL261.luc tumoren werd stervende en werden gedood. Belangrijk is er geen verschil in overall overleving tussen GL261.luc en GL261 tumordragende dieren (figuur 3B). In vivo bioluminescentie kan derhalve worden gebruikt om de respons op experimentele glioblastoma behandelingen volgen. Snelle betrouwbare tumorgroei en korte overleving kunnen grote hoeveelheden data op in een relatief korte tijd.

figure-results-1
Figuur 1. Luciferaseactiviteit in GL261.luc cellen. U87.luc, GL261.luc en GL261 (negatieve controle) cellen werden bij dichtheden van1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4 en 2,5 x 10 4 cellen / putje van links naar rechts. Luminescentie (foton / sec / sr / cm2) werd gemeten door het Lumina imaging station. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Luciferase-expressie geen invloed GL261 celproliferatie. GL261.luc cellen niet veroorzaken verschil in proliferatie zoals aangetoond door MTS celproliferatie assay. De grafiek laat voudige toename ten opzichte van dag 1, zoals bepaald door de gemiddelde absorptiewaarde vergelijking (gemiddelde ± SEM) en thespecified tijdstip de gemiddelde waarde op dag 1 (ongepaarde t-test-waarden vergelijkingentussen elke cellijn: P = 0,7796) 14. Fout balken geven de gemiddelde waarden (gemiddelde ± SEM) van viervoud monsters op elke dag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Luciferase-expressie dosis geen effect op in vivo tumorgroei en overleving van dieren. (A) Bioluminescence bewaking toont progressieve groei van intracraniële GL261.luc tumor in C57BL / 6 muizen. (B) Kaplan-Meier survival analyse toont geen verschil in de totale overleving voor muizen intracraniaal geïmplanteerde met ofwel GL261 (vaste lijn) of GL261.luc cellen (stippellijn).Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

GL261 muizen glioomcellen, wanneer intracraniaal geïmplanteerde syngene immuuncompetente in C57BL / 6-muizen, bieden een aantal voordelen in vergelijking met humane glioma xenograft diermodellen. Veel van xenogetransplanteerde tumoren groeien als ingekapselde letsels die niet nauwkeurig niet herhalen de invasieve ziekte bij de mens. Daarentegen GL261 tumor toont niet alleen invasie in aangrenzende hersenen, maar ook neovascularisatie, mitotische figuren en diepe necrose 7. Het belangrijkste is het bestuderen tumorimmunologie of immunotherapeutische strategieën 15, 16, de C57BL / 6 muis behoudt een intact immuunsysteem 8. Eerdere studies hebben aangetoond robuuste expressie van het immuunonderdrukkende cytokine TGF-β en intracraniale tumoren bevatten immunosuppressieve T-regulerende cellen vergelijkbaar met humane glioblastoma 9, 10.

De eenvoudige techniek beschreven maakt stabiele expressie van luciferase door GL261 cellen. We hebben onlangs gemeld Similar in vitro en in vivo groei van cellen GL261.luc opzichte GL261 cellen naast soortgelijke tumor histologische kenmerken en immuuncel 17 infiltreren. GL261.luc cellen stabiel tot expressie luciferase die de oxidatie van het substraat luciferine omzetten van chemische energie fotonen en dus detecteerbaar licht katalyseert. Luciferine kan veilig worden toegediend aan dieren en passeert de bloed-hersenbarrière na intraperitoneale of intraveneuze injectie. In kleine proefdieren, zoals muizen, kan de bioluminescentie extern worden gedetecteerd in een niet-invasieve manier 11. Daarom kan tumorgroei serieel worden geëvalueerd zonder dat dierenoffer of dure MRI of CT-beeldvorming.

De kritische stappen in het protocol omvatten, niet alleen de lentivirale transductie, maar ook de controle van de stabiele expressie van luciferase in vitro alvorens te beginnen met in vivo experimenten. Verlies van transductie kan buitere herhalen lentivirus infectie. Invoering van een antibioticum resistentiegen in de expressievector kan ook worden gebruikt om te selecteren op luciferase-expressie. Zorgvuldige techniek vereist intracraniale implantatie reproduceerbaar plaats een substantieel aantal cellen in een exacte anatomische locatie aan vergelijking van verschillende behandelingsgroepen toelaten. Een belangrijk verschil tussen de huidige studie en eerdere studies van luciferase expressie GL261 cellen is het gebruik van een vrije hand techniek voor het implanteren van cellen in vergelijking met het gebruik van een stereotactische kader 18. We hebben eerder aangetoond consistente implantatie resultaten met de vrije hand techniek 19. Het voordeel van de vrije hand techniek is het vermogen om hoge doorvoer analyse van verschillende behandelingsmiddelen voeren. In onze handen, kunnen we ongeveer 60 dieren geïmplanteerd in 1 uur.

Na het beheersen van de techniek, de toekomstige toepassingen van de techniek zijn eindeloos. Zoals GL261 demonstrates verhoogde mitose en snelle tumorgroei vergelijkbaar met humane glioblastoma, kunnen antiproliferatieve behandeling geëvalueerd. Evenzo kunnen anti-invasieve en anti-angiogene therapieën worden gebruikt als GL261 tumoren invasief en angiogene. Voorzichtigheid moet worden gebruikt bij het beoordelen van het effect van chemotherapeutische middelen die gericht zijn op de menselijke doelen. In vergelijking met eerdere studies gebruik te maken van de menselijke glioblastoma xenograften uiten luciferase 20, zou dit worden beschouwd als een beperking van ons model. Ook kan het effect van immunotherapeutische strategieën tumorgroei bestudeerd in de GL261 xenotransplantatie model.

Openbaarmakingen

Er zijn geen belangenconflicten die bekend moeten worden gemaakt.

Dankbetuigingen

We willen Rajwant Kaur bedanken voor technische assistentie. We willen Maxwell Tom bedanken voor assistentie bij de bereiding van het lentivirus. Dit werk werd ondersteund door de Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery aan UCSF, en de Michael J. Marchese Professor and Chair aan Northwestern University.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
D-Luciferin, Potassium SaltGold BiotechonologyLUCK-100Bewaar uit de buurt van licht
Living Image SoftwareCaliper Life SciencesContact op voor prijsopgavegeen
Xenogen LuminaCaliper Life SciencesContact op voor prijsopgavegeen
24-well; Standaard weefselcultuur; platte bodemFalcon353047
CellTiter 96 AQueous One Solution Celproliferatie Assay PromegaG3582geen
Synergy 2 Multi-Mode ReaderBioTekContact op voor prijsopgavegeen
96 wel Assay Plate, Zwarte Plaat, Heldere bodem met Deksel, Weefselcultuur TretaedCoster3603geen
KetasetPfizerNDC 0856-2013-01Controlestof
XylazineSigma-Aldrich23076-35-9geen
28G Naald (met spuit) Fisher  22-004-270Ook bekend als Insuline Spuit
2% ChlorhexidineFisherNC9756995Ook bekend als “Nolvasan”
3% WaterstofperoxideFisherH312P-4Bewaar uit de buurt van licht
Oftalmische ZalfCardinal Health1272830Ook bekend als “Akwa Tears”
25G 1 1/2 naaldBD Becton Dickinson305127geen
Wegwerp ScalpelsFeather2975Nr. 21
GaasFisher22028563Autoclaveer voor gebruik
VerwarmingskussentjesDunlapHP950geen
Huid Stapler, Haakjes, VerwijderaarStoelting59020geen
PDI Alcohol Prep PadsFisher23-501-711geen
Reflex 7 mm Wondclips 100 verpakkingBrain Tree Scientific, INC203 1000Autoclaveer voor gebruik
Reflex 7 mm Wondclip ApplierBrain Tree Scientific, INC204 1000Autoclaveer voor gebruik
Reflex 7 mm Wondclip VerwijderaarBrain Tree Scientific, INC205 1000geen
Single Ended Ronde Tip Swab met Hout handvatQosmedix10107Autoclaveer voor gebruik
Hanks' Gebalanceerde Zout Oplossing zonder Ca2+ en Mg2+ (HBSS)Gibco14170-112geen
Hamilton SpuitHamilton80300geen
FuGENE 6 Transfectie ReagensPromegaE2961geen
BeenwasHarvard Apparatus599864geen

Referenties

  1. Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
  4. Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
  5. Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
  6. Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
  7. Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
  8. Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
  9. Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
  10. El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
  11. Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
  12. Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
  13. Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).
  14. Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
  15. Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
  16. Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
  17. Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
  18. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403(2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
  20. Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

GL261 glioommodelimmunocompetente muisintracrani le tumorluciferase expressiein vivo monitoringtumorproliferatie assaystereotactische injectieregion of interestimmunotherapiestudie
Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.