Methodenartikel

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

DOI:

10.3791/53288

⸱

24 december 2015

 , 
1Department of Medicine, Harvard Medical School - BIDMC

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adaptieve immuniteit wordt geregeld door dynamische interacties tussen T-cellen en antigeen-presenterende cellen ("APC's") genoemd "immunologische synapsen. Binnen deze intieme cel-cel-interfaces discrete sub-cellulaire clusters van MHC / Ag-TCR, F-actine, hechting en signaalmoleculen vormen en snel te verbouwen. Deze dynamiek wordt gedacht dat ze kritische factoren voor zowel de efficiëntie en kwaliteit van de immuunresponsen die zich ontwikkelen en dus van beschermende immuniteit tegen pathologische. Huidige begrip van immunologische synapsen met fysiologische APC's wordt beperkt door de ontoereikendheid van de verkregen beeldresolutie. Hoewel kunstmatig substraat modellen (bijvoorbeeld vlakke lipidendubbellagen) bieden een uitstekende resolutie en zijn zeer waardevolle hulpmiddelen geweest, ze zijn inherent niet-fysiologische en ongenuanceerd. Vasculaire en lymfatische endotheelcellen naar voren zijn gekomen als een belangrijke perifere weefsels (of stromale) compartiment van 'semi-beroepal APCs. Deze APC's (die het merendeel van de moleculaire machinerie van professionele APC's tot expressie) hebben de unieke eigenschap van het vormen nagenoeg vlak celoppervlak en gemakkelijk te transfecteren (bijvoorbeeld met fluorescente proteïne reporters). Hierin een fundamentele benadering van endotheelcellen als nieuw en fysiologische "vlakke cellulaire APC model" voor verbeterde beeldvorming en ondervraging van fundamentele antigene signaleringsprocessen uitvoering worden beschreven.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T lymfocyten een tak van het adaptieve immuunsysteem gekenmerkt door het vermogen om efficiënt te herkennen peptide-antigeen (Ag) gebonden aan major histocompatibility complex (MHC) moleculen door hun T-celreceptoren (TCR's) 1. Naïeve lymfocyten constitutief migreren en scannen 'professionele Ag presenterende cellen (APC's, bijvoorbeeld, dendritische cellen) in lymfeklieren, terwijl het geheugen / effector-T-cellen nodig hebben om effectief te overzien een zeer breed scala van APC's en potentieel doelwit cellen in perifere weefsels.

In de min na de eerste opname van verwante Ag op een APC, lymfocyten arresteren hun migratie en beginnen aan een gespecialiseerde intieme cel-cel-interface genaamd 'immunologische synaps' vormen (IS). Aanhoudende (dwz 30-60 min) IS contacten nodig zijn om te versterken en te ondersteunen signalering 2-7. Opkomende studies identificeren die binnen de IS, is de continue vorming en snelle remodeling van discrete sub-cellulaire signalering micro-clusters (dwz bevattende MHC / Ag-TCR, F-actine, adhesie en signaalmoleculen) de sterkte en de kwaliteit van de verkregen immuunreacties 07/02 bepalen. Echter, dynamische details en regulerend mechanisme van dit proces onvolledig begrepen 8,9. Dit vloeit grotendeels voort uit de technische uitdagingen in verband met onregelmatige topologieën van APC oppervlakken en slecht gecontroleerde oriëntatie van de cel-cel interactie vliegtuigen, kwesties die diep beperken de vereiste spatiotemporele imaging benaderingen 8-10 (Figure1A).

figure-introduction-1

Figuur 1. Een Fysiologische Planar Cell APC Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics. Het schema illustreert traditionele beeldvorming van immunologische synaps tussen een T-cel en een professio nal APC (A) en T-cel en een traditionele vlakke lipide dubbellaag APC model (B) in relatie tot deze nieuwe endotheliale vlakke APC model (C). Professionele APCs bieden fysiologische immunologische synapsen maar bieden weinig georiënteerde cel-interface (dat wil zeggen ten opzichte van de optimale xy beeldvlak; resolutie ~ 0,2 pm), die dramatisch compromissen ruimtelijke (z beeldvlak resolutie ~ 1 micrometer) en tijd (dat wil zeggen, vanwege de noodzaak om herhaaldelijk gescand door alle z beeldvlakken) oplossing van beeldvorming. Bilaag modellen hebben een vlakke topologie die optimale spatiotemporele beeldvorming resolutie voorziet, maar ook sterk vereenvoudigd, niet-fysiologische en rigide. Deze endotheelcellen model combineert de vlakke topologie van lipidendubbellagen met de fysiologische substraat van een klassieke APC om een ​​optimale ruimtelijke en temporele beeldvorming resolutie leveren in een fysiologische omgeving.m / files / ftp_upload / 53.288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vorige werk is gedeeltelijk omzeild deze obstakels door het ontwikkelen vlakke ondergrond modellen (dwz lipidendubbellagen en antilichaam-gecoate oppervlakken) die optimale spatiotemporele resolutie (dwz bieden, via de vaststelling van de T-cel activatie oppervlak in een enkel plan dat parallel aan de optimale xy beeldvorming vliegtuig) 11-15 (Figuur 1B). Deze modellen hebben belangrijke inzichten vergemakkelijkt in de subcellulaire / moleculaire dynamica dat antigene signalering in T-cellen, met inbegrip van de ontdekking van dynamische actine / TCR signalering micro-clusters 7,11-14 controleren. Echter, dergelijke modellen inherent oversimplified, evenals stijve (evenwel de ontwikkeling / studie van 3-dimensionale topologische kenmerken) (Figuur 1B). Daarom blijft het onzeker hoe dergelijke bevindingen aan phy betreffensiologic cel-cel immune surveillance.

Hoewel nog weinig bestudeerd, vasculaire en lymfatische endotheelcellen zijn in opkomst als een grote (dwz, groter in aantal dan alle professionele APC's, door ~ 1000-voudig) perifere compartiment van 'semi-professioneel "APC's 16-18. Deze cellen brengen MHC-I, MHC-II en een veelheid aan co-stimulator moleculen (bijvoorbeeld CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, maar niet CD80 en CD86) en strategisch gepositioneerd aan de bloed-weefsel interface waar ze dienen gespecialiseerde sentinel functies 16-18. Vorige studies aangetoond dat endotheelcellen effectief opnieuw stimuleren effector / geheugen, maar niet naïeve T-cellen 19-25. Aldus endotheelcellen waarschijnlijk unieke APC rollen in effector fase van adaptieve immuunreacties in de perifere weefsels, zoals lokale invloed op T-celactivering, differentiatie, geheugen en tolerantie 16,17,26. Critisch, wanneer gekweekt in vitro endotheliale cellen vormen vrijwel vlakke celoppervlakken en gemakkelijk te transfecteren (bijvoorbeeld met fluorescente proteïne reporters). Deze functies zijn ideaal voor hoge spatiotemporele resolutie beeldvorming van topologische dynamiek in cel-cel interacties 19,27. Zo endotheelcellen kunnen dienen als een fysiologische "vlakke cellulaire APC-model duidelijk geschikt voor het onderzoek van de subcellulaire / moleculaire remodeling mechanismen antigeenherkenning drijven en te reguleren responsen (figuur 1C) 19,20.

Eerder vastgestelde complementaire beeldvormingstechnieken (waaronder transfectie van endotheel cellen met fluorescent eiwit makers van de plasmamembraan en cytosol) voor het bestuderen van de details van leukocyt-endotheel interactie tijdens hechting en transendotheliale migratie 27, bleek dat leukocyten actief sonde het oppervlak van het endotheel door dynamische inbrengen van eend terugtrekken van sub-micron-schaal, actine-rijke cilindrische uitsteeksels (~ 200-1000 nm in diameter en diepte) genoemd invadosome-achtige uitsteeksels (dat wil zeggen, 'POPs') 27,28. Deze beeldvormingstechnieken zijn verder uitgebreid met de creatie protocollen te profiteren van endotheliale APC functie om de eerste werkwijzen voor spatiotemporele hoge resolutie afbeelding van de T-cel-endotheliale immunologische synaps gerapporteerde 19,20 ontwikkelen en verder hierin beschreven. Een centrale bevinding afgeleid van deze nieuwe vlakke cellulaire APC model is dat T-cel POPs functioneren, zowel in het bevorderen van de initiële Ag detectie en bij het instandhouden van de daaropvolgende signalering. Inderdaad, arrays van meerdere POPs (die werden gestabiliseerd en opgebouwd in reactie op calciumflux initiële) tonen verrijking in TCR en moleculen die wijzen op actieve signalering zoals PKC-Q, ZAP-70, fosfotyrosine en HS1. Daarom POPs lijken een driedimensionale fysiologische equivalent aan het TCR-signalering micro vertegenwoordigenclusters gezien op vlakke dubbellaag modellen. Deze aanpak, dus onthult gevoelig / rapporten moleculaire en architecturale (en impliciete biomechanische) dynamiek anders niet aantoonbaar.

De hierin beschreven werkwijze moet nuttig zijn om de kloof tussen professionele APC en kunstmatige APC substraat modellen om ons vermogen om fundamentele mechanismen van adaptieve immuunreacties ondervragen verbeteren zijn. Hoewel hier de nadruk op de activatie van CD4 + Th1-type effector / geheugencel kan deze basisaanpak gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van T-cel soorten en Ags bestuderen, zoals hieronder besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten beschreven in dit protocol worden uitgevoerd met primaire menselijke T-cellen en in de handel verkrijgbaar primaire menselijke endotheelcellen (huid of longen microvasculaire EC) Je verder onderzoeksprotocol met mensen moet worden goedgekeurd door een institutionele review board en schriftelijke geïnformeerde toestemming moet worden verstrekt uit elke bloeddonor. Experimenten uitgevoerd met behulp van dit protocol werd goedgekeurd door de IRB van Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Voorbereiding Human CD4 + Th1 effector / geheugen T-cellen

  1. Toepassing tourniquet aan de arm van de donor, veeg ader met alcohol, en steek de naald. Langzaam trekken 15 ml bloed in vacutainer met EDTA als antistollingsmiddel. Wanneer het bloed is getrokken, los van de tourniquet voordat het verwijderen van de naald. Onmiddellijk van toepassing druk om wond met steriel gaasje wanneer de naald wordt verwijderd.
  2. Breng bloed naar een 50 ml buis. Add RPMI-1640 bij kamertemperatuur in een 1: 1 verdunning (eindvolume 30 ml). Overlay zorgvuldig de verdunded bloed op twee 50 ml buizen met 15 ml van voorgefilterde lymfocyten isolatiemedium zoals Ficoll-Paque bij kamertemperatuur.
  3. Centrifugeer de helling bij KT gedurende 30 min bij 1200 xg in een swinging bucket rotor. Terwijl centrifugeren bereiden T-cel medium (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml penicilline / streptomycine).
  4. Na verwijdering van de 50 ml buis van de centrifuge, in acht vier lagen: een pellet van rode bloedcellen op de bodem, de paque, een laag van cellen die witte bloedcellen (waaronder lymfocyten) en de plasma bevat. Verwijder de witte bloedcellen laag met een pasteur pipet en overdracht in een 50 ml Falcon buis zorgvuldig.
  5. Was de witte bloedcellen laag door toevoeging RT RPMI-1460 (tot 20 ml) en centrifugeren bij KT gedurende 5 min bij 1200 x g. Resuspendeer de witte bloedcellen in 1 ml T-celmedium. Voeg 5 ul van de 1 ml celsuspensie met 250 pi T-celmedium in een 1,5 ml centrifugebuis en meng voorzichtig op en neer met een pipet.
  6. Voeg 25 ul verdundd celsuspensie tot 25 pi 0,4% trypan blauw. Voeg 10 ul van het mengsel aan elke zijde van een standaard hemocytometer.
  7. Plaats hemocytometer op een laag vermogen lichtmicroscoop. Met behulp van een 10X objectief tel het aantal levende cellen dat trypan blauwe kleurstof uitgesloten en aanwezig in het middelste vierkant van beide zijden van de hemocytometer worden.
  8. Om de celconcentratie vermenigvuldigt het gemiddelde van de kwadraten van 2 100 (verdunningsfactor) en vervolgens vermenigvuldigen met 10 4 om het aantal cellen / ml.
  9. Stel het uiteindelijke concentratie 0,5 x 10 6 cellen / ml in T-celmedium. Voeg een eindconcentratie van 1 ug / ml van bacteriële superantigenen stafylokok enterotoxine B (SEB) en toxische-shocksyndroom toxine 1 (TSST) aan de cellen. Cultuur van 72 uur (37 ° C en 5% CO 2) aan de CD4 + T-celpopulatie uit te breiden.
  10. Pellet T-cellen (1200 xg, 5 min) en resuspendeer in 0,5 x 10 6 cellen / ml in T-celmedium mettoevoeging van menselijk IL-15 (20 ng / ml). Transfer lymfocyten een T150 kolf. Verder uit te breiden / split cellen volledig medium-IL-15 elke 24-48 uur als nodig is (op basis van media kleur, dat wil zeggen, wanneer de media verandert van roze tot licht geel) daarna. Behouden de resulterende lymfocytenpopulatie voor maximaal 15 dagen.
    OPMERKING: Door het ontwerp, zal dit protocol te activeren en uit te breiden met name subset van CD4 + T-cellen die reactief zijn SEB en TSST en dan rijden ze naar een Th1-achtige effector / geheugen fenotype. Andere witte bloedcellen niet te overleven en te groeien onder deze omstandigheden, zodat stap 1,10 de cellen ten minste 95% CD4 +, CD45RO + T-cellen 19, zoals gemakkelijk kan worden beoordeeld door flowcytometrie. Desgewenst kunnen verdere zuivering gemakkelijk worden bereikt door in de handel verkrijgbaar antilichaam / magnetische bead-based positieve of negatieve selectie kits.

2. Vanaf primaire humane endotheelcellen Cultuur

  1. Coat een T25 fles met fibronectine (FN) 20 ug / ml in PBS in steriele omstandigheden. Laat bij KT 30-60 min. Verwijder FN en voeg 5 ml compleet medium (Endotheel basismedium (EBM-2) medium aangevuld met endotheelcellen groeimedium (EGM-2) singlequots). Pre-incubeer bij 37   ° C celkweek incubator gedurende ten minste 30 min.
  2. Dooi een flacon van bevroren menselijke long of dermale microvasculaire endotheelcellen (HLMVECs of HDMVECs) in een 37 ° C waterbad met af en toe zacht schudden ~ 2-3 min. Onmiddellijk overdracht cellen om T25 kolf met voorverwarmde media. Zwenk en plaats in de incubator bij 37 ° C.
  3. Wijzig de media na ~ 4-6 uur. Blijven de media veranderen ongeveer elke 48 uur (of wanneer media wordt lichtgeel), totdat de plaat bereikt ~ 90-95% confluentie.

3. Algemene Splitsen en uitbreiding van endotheelcellen

  1. Cellen groeien tot confluentie ~ 90-95. Dit kan 2-5 dagen duren. Voor splitsing,Verwijder de media en spoel met PBS. PBS verwijderen en te vervangen met een minimale hoeveelheid verse 1x trypsine (0,5 ml voor T25 of 1,5 ml voor T75). Zwenk om alle oppervlak met trypsine te dekken. Incubeer bij 37 ° C ~ 5 min. Bewaken van de onthechting van de cellen van de plaat met een laag vermogen lichtmicroscoop.
  2. Wanneer meeste cellen lijken rond of losgemaakt, voeg 5 volume (dat wil zeggen, vergeleken met het volume trypsine toegevoegd) voorverwarmde volledige EGM-2 medium en voorzichtig pipetteren over het oppervlak van de kolf om alle cellen los.
  3. Telling endotheliale cellen met een hemocytometer beschreven in 1,6-1,7. Pellet de cellen door centrifugeren (5 min, 1200 x g). Verwijder het supernatant. Pas concentratie 0.500.000 cellen per ml door toevoeging van voorverwarmde volledige EGM-2 MV media.
  4. Overdracht aliquots van cellen om de juiste FN-beklede schalen of flacons onderhoud. Zwenk en plaats in de incubator. Wijzig de media binnen 6-12 uur in de platen. Media should ongeveer vervolgens om 48 uur worden vervangen.

4. endotheelcellen Transfectie

OPMERKING: Primaire endotheelcellen ongevoelig transfectie de meeste gebruikelijke chemische werkwijzen en elektroporatie. De transfectie gebaseerde werkwijze nucleaire hieronder beschreven maakt betrekkelijk hoge transfectie efficiëntie (~ 50-70%). Een effectieve alternatieve methode is het gebruik van een infectie door geschikte virale vectoren (zie opmerkingen bij Materials tabel).

  1. Bereid T25 en T75 flessen (indien nodig) van HLMVECs of HDMVECs tot een uiteindelijke dichtheid van 90-95% confluency.Coat met fibronectine (FN) 20 ug / ml in PBS in steriele omstandigheden ofwel microscoop cultuur platen zoals Delta-T-platen (voor stap 5) of 12 mm ronde dekglaasjes geplaatst in een putje van een 24-well celkweek plaat (voor stap 6) met als hierboven (2.1) beschreven.
  2. Voeg 1 ml compleet EGM-2 kweekmedia tot microscoop cultuur platesor 0,5 ml voor elke 24 goed evenwicht en platen ineen bevochtigde 37 ° C / 5% CO2 incubator.
  3. Oogst en tel endotheelcellen in stappen 3.1-3.3.Centrifuge het vereiste volume van cellen (0,5 miljoen cellen per monster) bij 1200 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 100 pl RT nucleaire transfectieoplossing per monster.
  4. Combineer 100 pi celsuspensie met 1-5 pg DNA. Transfer cel / DNA suspensie in gecertificeerde kuvet; monster de bodem van de cuvette te dekken zonder luchtbellen.
    OPMERKING: Constructen richten YFP of DsRed aan het celmembraan (via de N-terminale 20 aminozuren van neuromoduline die een signaal voor posttranslationele palmitoylering bevat) werden alleen toegepast (membraan-YFP alone of membraan-DsRed afzonderlijk) of gecotransfecteerd met een cytoplasma volumetrische marker (bijvoorbeeld membraan-YFP en oplosbare DsRed). Vele permutaties van fluorescente eiwit markers kunnen worden gebruikt.
  5. Sluit de cuvet met de dop. Plaats de cuvet metcel / DNA suspensie in de cuvettehouder van de electroporator en toepassen elektroporatie programma S-005. Neem de cuvette uit de houder zodra het programma klaar is.
  6. Voeg ~ 500 ul van de vooraf in evenwicht kweekmedia de cuvette en verwijder voorzichtig de celsuspensie uit de cuvette met de plastic transferpipetten voorzien in de transfectiekit kern.
  7. Voor experimenten met microscoop cultuur platen verdelen de celsuspensie van de ene reactie even tussen twee gerechten met voorverwarmde media (Stappen 4,2-4,3). Voor experimenten met 24 goed / plaat, partitie één reactie gelijkelijk over 3 putten.
  8. Incubeer de cellen in een bevochtigde 37 ° C / 5% CO2 incubator veranderingsmedia 4-6 uur en opnieuw bij 12-16 uur na transfectie.

5. Live-cell imaging en analyse

  1. Het voorbereiden van endotheel
    1. Dag 0: Co-transfecteren primaire HLMVECs met membraan-YFP en oplosbare DsRed via een nucleofection technologie zoals beschreven in stap 4 en plaat op voor live-cell imaging kweekplaten.
    2. Dag 1: Vervang medium met vers medium met IFN-γ (100 ng / ml) aan MHC-II-expressie te induceren. Op dag 2. Stimuleer getransfecteerde cellen door toevoeging van 20 ng / ml TNF-α de bestaande media.
    3. Op dag 3, incubeer het endotheel met 1 ug / ml van bacteriële superantigenen stafylokok enterotoxine B (SEB) en toxische-shocksyndroom toxine 1 (TSST) bij 37 ° C gedurende 30-60 min onmiddellijk voorafgaand aan experimenten. Sla deze stap voor '-AG' controle omstandigheden.
  2. Het voorbereiden van lymfocyten
    1. Gelijktijdig met stap 5.1.3, bereiden Buffer A (fenolrood-vrije HBSS), aangevuld met 20 mM Hepes, pH 7,4 en 0,5% v / v humaan serumalbumine voorverwarmd tot 37 ° C. Neem een ​​monster van gekweekte lymfocyten en het bepalen van de dichtheid door het tellen met een hemocytometer (Stap 1,12-1,17).
    2. Centrifuge 2 miljoen cellen per monster op 1,200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een 15 ml conische buis. Zuig media en voorzichtig resuspendeer celpellet in 2 ml buffer A zodat geen celgroepen blijven.
    3. Verwijderen van een verse portie van Fura-2 calcium kleurstof en resuspendeer in DMSO een voorraad concentratie van 1 mM te maken.
    4. Voeg 2 ul van Fura-2 voorraadoplossing aan de T-celsuspensie (2 uM eindconcentratie), cap de buis onmiddellijk meng door de buis gelijkmatige spreiding van kleurstof te verzekeren. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min.
    5. Gecentrifugeerd zoals in stap 5.2.2. Zuig buffer-A en voorzichtig maar grondig mengen lymfocyten in 20-40 pl verse buffer-A.
  3. Live-cell imaging Setup en Acquisition
    Opmerking: Een grote verscheidenheid aan systemen kunnen worden toegepast voor levende cellen fluorescentie beeldvorming op rechtop en omgekeerd lichtmicroscoop. Basisvereisten zijn een fluorescentie lichtbron en filters, een CCD-camera, gemotoriseerde filter schakelen en rolluiken, een verwarmd podium (of Microscope-monteerbare verwarmde kamer) en software voor geautomatiseerde beeldacquisitie. Voor dit protocol hoge numerieke lensopening, hoge vergroting (dat wil zeggen, 40x, 63x) olie-immersie-lenzen nodig zijn om de nodige ruimtelijke resolutie te bereiken. Speciale zorg moet worden genomen bij het kiezen van de juiste fluorescentie bron en lenzen voor Fura-2-gebaseerde calcium beeldvorming als niet alle compatibel zijn met de vereiste 340/380 nm excitatie golflengten. Een alternatieve benadering (compatibel met standaard groene en rode fluorescentie filtersets) kan worden gebruikt met niet-ratiomentic calcium-gevoelige kleurstoffen (bv Fluo-4, Rhod-3), hoewel deze niet nauwkeurig kwantificeren calcium flux en alleen een relatieve / kwantitatieve uitlezing.
    1. Schakelen microscoop systeem (PC voor gebruik, microscoop, CCD-camera, filter wiel en xenon lamp).
    2. Open de aangewezen software.
    3. Opgezet microscoop / software voor automatische multichannel time-lapse imaging. Omvatten sequentiële overname van adifferential interferentie contrast (DIC), standaard groene fluorescentie, standaard rode fluoresceren en de standaard 340 en 380 nm excitatie Fura-2 beelden. Stel het interval voor het ingaan van 10-30 seconden en een totale duur van ~ 20-60 min.
      1. Stel belichtingstijden voor Fura-2 beeldvorming.
        1. Voeg verse objectieve olie en monteer een microscoop schotel met slechts 0,5 ml buffer-A op de verwarming podium adapter en onmiddellijk zet in evenwicht tot 37 ° C (duurt ~ 2-3 min).
        2. Add rust fura2 geladen lymfocyten aan de gemonteerde microscoop gerecht kamer met behulp van een 20 pi pipet.
        3. Zet helder field imaging. Selecteer het lichtpad naar het oculair. Gebruik de grove scherpstelling knop om objectief in contact komt met bodem van de miscoscope gerecht te brengen. Gebruik het oculair en het scherpstellen knop te concentreren op de T-cellen zich op de bodem van de schaal.
        4. Gebruik de xy fase controles een gebied dat ten minste 10 cellen te selecteren. Vermijdenovervol velden en celklonten omdat deze beeldvorming artefacten creëren.
        5. Switch van helder veld naar lichtbron fluorescerend. Overschakelen van oculair beeldvorming CCD-camera. Stel acquisitie parameters (bijvoorbeeld, belichtingstijd, detector winst en binning). De software verwerven rust Fura2-340 en Fura2-380 afbeeldingen (ab dezelfde belichtingstijd voor ieder, gewoonlijk in het bereik van ~ 200-1000 msec).
        6. Gebruik de in stap 5.4.1 op de Fura2-340 / Fura2-380 berekenen voor elk van lymfocyten beschreven methoden. Voeren herhaalde herhalingen van het aanpassen van de Fura2-340 en Fura2-380 belichtingstijden, het verwerven van beelden en het berekenen van verhoudingen tot de gemiddelde waarden liggen dicht bij 1.
      2. Stel belichtingstijden voor mem-YFP en DsRed.
        1. Vervang de microscoop schaal gebruikt in stap 5.3.3.1 met een miscroscope schotel met getransfecteerde, geactiveerd en SAg behandeld (of onbehandeld; controle) HLMVECs of HDMVECs van celkweek incubator (Steps 4.5.1). Gebruik een wegwerp transferpipet snel verwijderen media uitspoelen één handeling door toevoeging van ~ 1 ml voorverwarmde buffer-A. Aspireren en voeg vervolgens 0,5 ml buffer-A.
        2. Identificeer gebieden waar fel fluorescerend positieve transfectant endotheelcellen aanwezig zijn en gezond met goed gevormde intercellulaire kruispunten worden weergegeven.
        3. Pas acquisitie parameters (bv, belichtingstijd, detector winst en binning) voor mem-YFP en DsRed. Zorg ervoor dat de gemiddelde fluorescentie signaalintensiteit elk kanaal ligt tussen 25% en 75% van het dynamisch bereik van de detector.
    4. Voeren voor live-cell imaging experiment.
      1. Gebruik geautomatiseerde software om de afbeelding acquisitie te beginnen en te vangen enkele tussenpozen van afbeeldingen om de baseline vast te stellen.
      2. Gedurende acquisitie toepassing ~ 5 ul geconcentreerd Fura-2 geladen lymfocyten (van stap 5.2) naar het centrum van de beeldvormende veldmicroscoop schotel door de tip van een klein volume (P-5of P-20) pipet in de media nabij het midden van het doel en uitwerpen langzaam.
      3. Lymfocyten vestigen in het beeldveld, nauwkeurig afstellen in de focus te verzekeren dat de T-cel-endotheel cel interface (immunologische synapsen) worden behouden in het brandvlak. Met 40 en 63x objectief, ~ 10-20 cellen per veld optimaal zijn. Als er minder cellen worden waargenomen in de beeldvorming gebied herhaal stap 5.3.4.2.
      4. Nadat de gewenste waarneming interval experiment wordt geconcurreerd, verder imaging onmiddellijk pipet ionomycine onmiddellijk in miscoscope schaal (via techniek in 5.3.4.2) tot een eindconcentratie van 2 uM tot maximale calcium flux / Fura-2 signaleringssignaal induceren (dwz , een middel van kalibratie, zie analyse 5.4.).
      5. Als alternatief voor de gewenste waarneming interval experiment 5.3.4.4after wordt geconcurreerd onmiddellijk zuig het buffer-A en vervangen door 0,5 ml fixatief (3,7% formaldehyde in PBS) gedurende 5 min bijRT, gevolgd door spoelen driemaal met PBS. Ga dan naar stap 6.
  4. Analyse van live-cell imaging
    NB: Na het opslaan van verworven bestanden, kunnen ze direct worden geanalyseerd of voor analyse uitgevoerd door een grote verscheidenheid van off-line beeldanalyse software applicaties. ImageJ is een bijzonder waardevol, zeer veelzijdig pakket dat is vrij beschikbaar en compatibel met vrijwel elke acquisitie software pakket. Het ontwerp van de beeldvormende experimenten stappen 5,1-5,3 beschreven zal hoge ruimtelijke en temporele resolutie dynamiek van interacties tussen lymfocyten en endotheliale APC in de afwezigheid en aanwezigheid van verwante SAg opleveren. Bijna onbeperkt analyses mogelijk zijn bij de aanpak van beeldgegevens van cellulaire morfometrische / signalering dynamiek. De specifieke doelstellingen in dit protocol beschreven zijn gecoördineerd kwantificeren lymfocytenmigratie en signalering (dwz, kinetiek en de niveaus van de intracellulaire calcium flux), samen met dynamischeal veranderingen in de immunologische synaps architectuur met focus op specifieke kenmerken (dwz POPs / podo-prints). De volgende zijn voorbeelden van afzonderlijke standaard en niet-standaard (dat wil zeggen, speciaal voor deze experimenten / vragen) analyses.
    1. Meet Lymphocyte Calcium flux
      1. Selecteer de eerste Fura2-340 (340 nm EX-510 nm EM) en Fura2-380 (380 nm EX-510 nm EM) beelden die voor toevoeging van lymfocyten werden verworven. Gebruik deze als achtergrond beelden en digitaal af te trekken ze uit de alle van de beelden in de tijdreeksen voor de respectievelijke kanaal.
      2. Voor elk tijdstip maakt een digitaal beeld verhouding van de achtergrond afgetrokken Fura2-340 en de achtergrond afgetrokken Fura2-380 afbeeldingen (dwz 340 nm EX-510 nm EM-background / 380 nm-510 nm EX EM-achtergrond).
      3. Kies de juiste software tekenprogramma. Klik op het scherm om een ​​cirkelvormig gebied van i te trekkenBELANG (ROI) rond elke lymfocyt. Deze zullen een pixel gemiddelde verhouding voor elk van lymfocyten en tijd te genereren.
      4. Plot de berekende verhouding als functie van de tijd met een geschikte toepassing (bijvoorbeeld spreadsheetprogramma). Bereken gemiddelde calcium flux voor het experiment door het optellen van de verhouding tussen waarden van alle lymfocyten per veld en die waarde te delen door het totale aantal lymfocyten voor elk tijdstip
    2. Voeren lympocyte migratie volgen analyse.
      1. Analyseren cel T-cel migratie met behulp van een geschikte mobiele tracking software applicatie (bijvoorbeeld ImageJ) met de DIC kanaal van elke video. Met behulp van ImageJ Cell Tracking Plugin, te identificeren in elk frame het zwaartepunt van elke cel handmatig door erop te klikken in elke progressieve frame.
      2. Gebruik de resulterende seriële xy coördinaten (dwz, sporen van de migratie paden) naar de gemiddelde snelheid (totale afstand gemigreerd / totaal interval o berekenenf imaging) en de kronkeligheid (totale afstand gemigreerd / het lineaire end-to-end afstand tussen de cellocatie in de eerste en laatste beeld).
      3. Cross-correleren deze parameters met calcium flux (5.4.1) dynamiek op een cel-by-cel basis.
    3. Beoordeel de Podo-print / ILP Dichtheid binnen de IS
      1. Tellen totaal aantal ILP gevormd in elke T-cel wordt gedefinieerd intervallen (bijvoorbeeld 5 min na toevoeging van T-cellen). Deze kunnen worden geïdentificeerd discrete micron-schaal fluorescente membraan-YFP ringen die co-lokaliseren met donkere kringen in cytoplasma DsRed op de endotheliale APC op de plaats van lymfocyten hechting.
      2. Cross-correleren de resulterende 'ILP indexen' met calcium flux (5.4.1) dynamiek op een cel-by-cel basis.
    4. Meet de Podo-print / ILP levens.
      1. Voor elke podo-print / ILP in een bepaalde IS berekenen zijn levens als het laatste tijdstip waarop een ILP zichtbaar was - het tijdstip waarop dat podo-print / ILP fieerst verscheen. Gemiddeld ILP levens zowel per IS.
      2. Cross-correleren deze levens met calcium flux (5.4.1) dynamiek op een cel-by-cel basis.
    5. Beoordeel de temporele relatie tussen de eerste ILP vorming en calcium flux.
      1. Voor elk van lymfocyten identificeren tijdstip (frame) waarmee calcium eerst boven de uitgangswaarde 19.
      2. Voor elk van lymfocyten identificeren van de tijdstip waarop de eerste podo-print / ILP verschijnt.
      3. Voor elke lymfocyt berekent een 'offset time' door het aftrekken van de initiële calciumflux tijdstip van die van de eerste podo-print / ILP. Het gemiddelde van de waarden van alle lymfocyten in een veld. Positieve waarden geven de ILP vorming voorafgaat calciumflux terwijl negatieve getallen geven het tegenovergestelde.
        Opmerking: Deze experimenten kunnen gemakkelijk onder fysiologisch relevante laminaire schuifstroom uitgevoerd met in de handel verkrijgbaar parallelle wandstromingsfiltratie imaging kamers beschreven 19.

6. Vaste-cell imaging en analyse

  1. Vaste eindpunt T-cel-endotheel IS vorming en kleuring
    1. Bereid T cellen zoals beschreven in 1. Bereid endotheelcellen (- / + SAg) zoals in stap 5,1 (transfectie stap 5.1.1 is optioneel). Neem een ​​monster van gekweekte lymfocyten en bepalen van de dichtheid van tellen met een hemocytometer (Deel 1).
    2. Breng een lymfocytenkweek volume gelijk aan ten minste 3 x 10 5 lymfocyten / monster een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 3 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet lymfocyten in buffer-A (stap 5.2.1) concentratie van 6 x 10 5 lymfocyten / ml.
    3. Verwijder de endotheelcellen uit de celkweek incubator (verdergaat één monster tegelijk) achtereenvolgens aspireren media en vervangen door 0,5 ml van lymfocyt suspensie (3 x 10 5 lymfocyten / monster) en vervanging 37 ° C incubator.
    4. Na geschikte incubatie tijden, zoals hierboven vermeld, aspireren medium van de putten en voeg voldoende fixeeroplossing (3,7% formaldehyde in PBS) om het monster volledig te bedekken (bijvoorbeeld in 24 well plaat ~ 300-500 pi). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
    5. Spoel monster 3 maal met PBS. Vlek door het toevoegen van primair antilichaam gedurende 60 minuten bij RT (zie lijst). Als het primaire antilichaam is gericht op een intracellulair eiwit, een extra permeabilisatie stap moet worden uitgevoerd door toevoegen van voldoende permeabilisatie oplossing (0,01% Triton X-100 in PBS) aan het monster gedurende 1 min bij kamertemperatuur volledig bedekken. Spoel monster 3 maal met PBS. Voeg het juiste secundaire antilichamen (soms gelijktijdig fluorescerende phalloidin) gedurende 60 min bij RT.
    6. Monteer de ronde glazen dekglaasje op beeldvorming dia. Vaste eindpunt T-cel-endotheel IS formatie en kleuring. Om te beginnen beeldvorming plaats de beeldvorming dia met monsters op de microscoop podium en selecteer de 63x oliedoelstelling. Solliciteer verse immersie olie.
  2. Gebruik de bright-field imaging-modus en oculaire lenzen om de focal plane lokaliseren. Schakelen naar epifluorescentie en via de oculaire lenzen inspecteren monster. Selecteer een veld van belang. Overschakelen naar de laser-scanning mode.
  3. De snelkoppeling-scan en werken in een zo groot gebied mogelijk individueel laservermogen en versterking van ieder kanaal in op het signaal, zodat idealiter de specifieke signaalintensiteit bereikt optimaliseren ten minste ~ 25% en ten hoogste 75% van het dynamisch bereik van de detectoren.
  4. Handmatige focusregeling, snel door de Z-as en identificeren van de boven- en ondergrenzen van snijden (gewoonlijk alle informatie moet worden opgenomen in een dikte van ~ 15 urn). Selecteer de Z-as snijdikte in het bereik van ~ 0,2-1,0 micrometer.
  5. Tot slot, zoom / gewas het veld beeldvorming om de specifieke regio van belang en het gedrag scan. Naast het hebben van zeer licht en specifieke fluorescentie signaal in de steekproef, het verwerven van een hoge resolutie 3D-beeldvorming vereist herhalingen van scannen en het maken van aanpassingen aan acquisitie parameters. Het doel is om maximale xy en z-as resolutie, zonder noemenswaardige foto-bleken te verkrijgen.
  6. Kwalitatief analyseren de topologie van 3D-topologie van het IS door het uitvoeren van digitale 3D-reconstructie van de resulterende optische secties door middel van een geschikte softwaretoepassing (bijv Afbeelding J). Door soortgelijke toepassingen kwantitatief fluorescentiesignaal distributie te beoordelen (bv co-lokalisatie en correlatieve fluorescentie-intensiteit line-scan analyse van Pearson en orthogonale bekijken).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een nieuwe imaging benadering middels endotheliale cellen en het combineren van de resolutie voordelen van de vlakke lipide dubbellagen model met de fysiologische complexiteit en vervormbaarheid van professionele APC werd ontwikkeld (figuur 1). Figuur 2 geeft voorbeelden van normale migratie, calcium flux en topologische dynamiek waargenomen met dit aanpak. Aangezien SAg op endotheel, SAg-specifieke CD4 + Th1 lymfocyten snel verspreiden, polar...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kortom, dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen als i) weinig bestudeerd fysiologische APC's en ii) als een nieuw type 'vlakke cellulaire APC model'. Wat het eerstgenoemde is geworden steeds duidelijk zijn dat niet-hematopoietische perifere (of "stromale") APCs spelen cruciale, niet-redundante functies (bijv tegenover hematopoietische APCs) de vormgeving adaptieve immuunreacties 16-18. Onder dergelijke 'semi-professioneel "APC's, va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Peter T. Sage voor zijn hulp bij het genereren van enkele van de representatieve afbeeldingen. Dit werk werd ondersteund door een NIH R01-subsidie aan C.V.C. (HL104006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BD Vacutainer stretch latex free tourniquetBD Biosciences367203
BD alcohol swabsBD Biosciences326895
BD Vacutainer Safety-LokBD Biosciences367861K2 EDTA
BD Vacutainer Push Button Blood Collection SetBD Biosciences367335
RPMI-1640Sigma-AldrichR8758-1L
Ficoll-PaqueSigma-AldrichGE17-1440-02Breng voor gebruik naar RT
FCS-OptimaAtlanta Biologicss12450Heat geïnactiveerd
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4458-100ML
Trypan blueSigma-AldrichT8154-20ML
staphylococcal enterotoxin BToxin TechnologyBT202REDStockoplossing 1mg/ml in PBS
toxic shock syndrome toxin 1Toxin TechnologyTT606REDStockoplossing 1mg/ml in PBS
human IL-15R&D Systems247-IL-025Stockoplossing 50ug/ml in PBS
PBSLife Technologies10010-049
FibronectinLife Technologies33016-015Stockoplossing 1mg/ml in H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo CellsLonzaCC-2543Andere menselijke microvasculaire EC's kunnen worden gebruikt, d.w.z. HLMVEC's
EGM-2 MV bullet kitLonzaCC-3202
Trypsin-EDTASigma-AldrichT-4174Stockoplossing 10x, verdunnen in PBS
amaxa-HMVEC-L Nucleofector KitLonzavpb1003Vereiste kit voor stap 4
IFN-gSigma-AldrichI3265Stockoplossing 1mg/ml in H20
TNF-alpha 10ug, humanLife TechnologiesPHC3015Stockoplossing 1mg/ml in H20
phenol Red-free HBSSLife Technologies14175-103
HepesFisher ScientificBP299-100
Calcium ChlorideSigma-AldrichC1016-100GStockoplossing 1M in H20
Magnesium chlorideSigma-Aldrich208337Stockoplossing 1M in H20
Human Serum albuminSigma-AldrichA6909-10ml
Immersol 518 F fluorescence free Immersion oilFisher Scientific12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ugLife TechnologiesF1221Stockoplossing 1mM in DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)Clontech6917-1
pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed)Clontech632466
pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)Clontech632512
pEGFP-ActinClontech6116-1
Alexa Fluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
Formaldehyde solution 37%Fisher ScientificBP531-500Toxisch, gebruik afzuigkap
Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML
 Falcon 15mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-70C
Falcon 50mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-49A 
Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25Fisher Scientific10-126-9
 Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75Fisher Scientific  13-680-65
 Corning Cell Culture Treated T175Fisher Scientific10-126-61 
Glass coverslips Fisher Scientific12-545-85 12 mm diameter
 Falcon Tissue Culture Plates 24-wellFisher Scientific08-772-1
Delta-T platesBioptechs04200415B
Wheaton Disposable Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-8D
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific05-402-25
 ICAM1 mouse anti-humanBD Biosciences555509
HS1 mouse anti-humanBD Biosciences610541
Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) PurifiedebioscienceBMS102
Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488ebioscience53-0037-41
Anti-MHC Class II antibody Abcamab55152
Anti-Talin 1 antibodyAbcamab71333
Anti-PKC theta antibody Abcamab109481
phosphotyrosine (4G10 Platinum)Millipore50-171-463
Nucleofector IIAmaxa BiosystemsVereiste elektroporatieapparaat voor stap 4
Zeiss AxiovertCarl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510 Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison SoftwareCarl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Series 60) Biological Safety CabinetNuAIRENu-425-600
 Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Cell culture IncubatorFisher Scientific202370
Centrifuge 5810EppendorfEW-02570-02
HemocytometerSigma-Aldrich Z359629Bright-Line Hemocytometer
Isotemp Waterbath model 202Fisher Scientific15-462-2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
  2. Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
  3. Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
  4. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  5. Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
  6. Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
  7. Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
  8. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
  9. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
  10. Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
  13. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  14. Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
  15. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
  16. Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
  17. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
  18. Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
  19. Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
  20. Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
  21. Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
  22. Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
  23. Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
  24. Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
  25. Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
  26. Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
  27. Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
  28. Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
  29. Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
  30. Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
  31. Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
  32. Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
  33. Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
  34. Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
  35. Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).
  36. Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
  37. Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

T celactivatieantigeenpresenterende cellenfluorescentie imaginglive cell imagingmembraan YFPDS Redcalciumfluxsuperantigeenstimulatie

Gerelateerde artikelen