Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Summary

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Abstract

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

Introduction

Adenovirussen een dubbelstrengs DNA-genoom, dat repliceert in de geïnfecteerde celkern. Als het virale DNA de kern binnengaat, is gelokaliseerd grenzend aan PML kernlichaampjes ^1. Naar aanleiding van de virale vroege genexpressie, wordt de nucleaire architectuur drastisch gereorganiseerd, het induceren van de vorming van virale micro-omgevingen, zogenaamde virale replicatie compartimenten (RC) ^2. Sinds adenovirus (Ad) RC zijn sites waar virale genoom replicatie en expressie van virale late genen plaatsvinden, ze bieden een omgeving voor de aanwerving van alle noodzakelijke virale en cellulaire factoren die deelnemen aan deze processen. Interessa....

Protocol

1. HFF Cell Cultuur en Ad-infectie

1. Propageren Ad5 WT virus in monolagen van HEK-293-cellen en titer als fluorescerende eenheden (FFU) op HFF cellen zoals eerder beschreven ^8.
2. Groei humane voorhuid fibroblasten (HFF) in 10 ml DMEM / 10% foetaal runderserum (FBS) in steriele kweek 100 mm schalen bij 37 ° C en 5% _CO2 in een bevochtigde incubator. Bepaal het aantal cellen met een Neubauer kamer door het tellen van cellen in de vier 16-square sets. Het aantal cellen per ml wordt verkregen door het gemiddelde aantal cellen in de vier 16-square sets en dit aantal te vermenigvuldigen met 10 ^4. Voor iedere keer na infectie....

Results

Aangezien virale replicatie compartimenten (RC) zijn subnucleaire viraal geïnduceerde structuren bestaande uit eiwitten en nucleïnezuren, vergelijkbaar met andere nucleaire domeinen, bleken zij vatbaar voor isolatie te worden door snelheidsgradiënten gebaseerd op biochemische kenmerken. Kritische stappen van de fractionering protocol worden geïllustreerd in figuur 1. Bij elke stap de monsters moeten worden gevolgd met helderveld microscopie om de integriteit van de verschillende subcellulaire fracties w.......

Discussion

In order to elucidate the molecular mechanisms that govern regulation of cellular activities by viral infection understanding the composition and activities associated with RC would be instrumental. Therefore, to make a detailed analysis of RC, we established a cell-free system that takes advantage of the size and biochemical composition of these virus-induced structures, to isolate subnuclear fractions enriched with RC using a simple procedure that relies on velocity gradients with sucrose cushions. Critical steps of th.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Warm in 37 ºC water bath before use
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Prepare a 2.55 M stock solution and store at 4 ºC
Dounce homogenizer	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasonic Bath	Branson	Z769533 SIGMA	Turn on 15 min before use.
Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-21121	Use at a 1:2,000 dilution in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in a laminar flow cabinet
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Pierce ThermoScientific	34080