Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Summary

We bieden een nieuwe strategie om virale replicatiecompartimenten (RC) te isoleren van adenovirus (Ad)-geïnfecteerde menselijke cellen. Deze aanpak vertegenwoordigt een celvrij systeem dat kan helpen om de moleculaire mechanismen die virale genoomreplicatie en -expressie reguleren, evenals de regulatie van virale-gastheerinteracties die in het RC worden gevestigd, te verduidelijken.

Abstract

Tijdens infectie van menselijke cellen door adenovirus (Ad) wordt de celkern van de gastheercellen dramatisch gereorganiseerd, wat leidt tot de vorming van nucleaire micro-omgevingen door de aanwerving van virale en cellulaire eiwitten op locaties die worden bezet door het virale genoom. Deze sites, replicatiecompartimenten (RC) genoemd, kunnen worden beschouwd als door virus geïnduceerde nucleaire domeinen waar het virale genoom is gelokaliseerd en virale en cellulaire eiwitten die deelnemen aan replicatie, transcriptie en post-transcriptionele verwerking worden gerekruteerd. Bovendien worden cellulaire eiwitten die betrokken zijn bij de antivirale respons, zoals tumorsuppressoreiwitten, DNA-schaderespons (DDR) componenten en factoren van de aangeboren immuunrespons, ook meegeteld naar RC. Hoewel RC een cruciale rol lijken te spelen om een efficiënte en productieve replicatiecyclus te bevorderen, is er geen gedetailleerde analyse gemaakt van hun samenstelling en bijbehorende activiteiten. Om het onderzoek naar adenovirale RC en mogelijk die van andere DNA-virussen die zich in de celkern repliceren, te vergemakkelijken, hebben we een eenvoudige procedure aangepast op basis van snelheidsgradienten om Ad RC te isoleren en een celvrij systeem opgesteld dat geschikt is voor morfologische, functionele en samenstellingsstudies van deze door virus geïnduceerde subnucleaire structuren, evenals om hun impact op gastheercelinteracties te bestuderen.

Introduction

Adenovirussen een dubbelstrengs DNA-genoom, dat repliceert in de geïnfecteerde celkern. Als het virale DNA de kern binnengaat, is gelokaliseerd grenzend aan PML kernlichaampjes ^1. Naar aanleiding van de virale vroege genexpressie, wordt de nucleaire architectuur drastisch gereorganiseerd, het induceren van de vorming van virale micro-omgevingen, zogenaamde virale replicatie compartimenten (RC) ^2. Sinds adenovirus (Ad) RC zijn sites waar virale genoom replicatie en expressie van virale late genen plaatsvinden, ze bieden een omgeving voor de aanwerving van alle noodzakelijke virale en cellulaire factoren die deelnemen aan deze processen. Interessant is dat een verscheidenheid aan cellulaire eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de cellulaire antivirale respons, zoals de DNA-schade reactie de aangeboren immuunrespons en tumorsuppressie samen worden gekozen om deze virale plaatsen ^2. Daarom kan Ad RC worden beschouwd regelgeving hubs die een efficiënte virale replicatie te bevorderen, terwijl tegelijkertijd de regulering van decellulaire antivirale respons, wat aangeeft dat deze structuren zijn de sleutel tot het begrip van virus-gastheer cel interacties. Niettemin, de moleculaire mechanismen van RC vorming, de samenstelling en de bijbehorende activiteiten worden slecht begrepen.

Adenovirale RC, en RC uit andere DNA-virussen die repliceren in de kern wordt niet geassocieerd met membranen, in tegenstelling tot cytoplasmatische RC ^3. Bovendien zijn deze virus-geïnduceerde structuren waarschijnlijk geheel bestaande uit eiwitten en nucleïnezuren. RC gevormd in cellen geïnfecteerd met RNA-virussen (gewoonlijk aangeduid als virale fabrieken) zijn geïsoleerd, profiteren van hun cytoplasmatische lokalisatie en membraangebonden status waarin de gedetailleerde morfologische, functionele en biochemische karakterisatie ⁴ is vergemakkelijkt.

Voor zover wij weten, zijn virale kern RC niet geïsoleerd, misschien vanwege de complexiteit van de nucleaire architectuur en afwezigheid van intranucleaire membranes dat hun isolatie zou vergemakkelijken. Hun studie heeft vertrouwd in plaats daarvan op immunofluorescentiemicroscopie, vis en transmissie elektronen microscopie. Echter, ondanks de complicaties die inherent zijn aan het isoleren subnucleaire structuren, andere nucleaire domeinen zoals nucleoli en Cajal organen zijn geïsoleerd voordat ^5,6. Aangezien nucleoli en RC zijn beide samengesteld uit eiwitten en nucleïnezuren, en een diameter tussen 0,5 - 5 pm, veronderstelden we dat RC ook vatbaar afzonderlijk te beoordelen. Teneinde de moleculaire samenstelling en functies in verband met RC preciezer te karakteriseren hebben we een nieuwe werkwijze voor subnucleaire fracties verrijkt met RC isoleren. Daartoe hebben we bereid sub-nucleaire fracties behulp snelheidsgradiënten en sucrose kussens Soortgelijke procedures voor nucleoli ⁷ of andere nucleaire domeinen ⁶ isoleren en werd een celvrij systeem dat de studie van de moleculaire samenstelling en bijbehorende activiteiten mogelijk maaktRC. Deze techniek dient derhalve vooraf het begrip van virus-gastheer cel interacties en vormt een krachtig instrument dat ook een gedetailleerde analyse van RC dient te vergemakkelijken van andere virussen die repliceren in de kern en induceren de vorming van replicatie compartimenten van soortgelijke afmetingen aan die gevormd in adenovirus geïnfecteerde cellen, zoals herpesvirussen, papillomavirussen en polyomavirussen.

Protocol

1. HFF Cell Cultuur en Ad-infectie

1. Propageren Ad5 WT virus in monolagen van HEK-293-cellen en titer als fluorescerende eenheden (FFU) op HFF cellen zoals eerder beschreven ^8.
2. Groei humane voorhuid fibroblasten (HFF) in 10 ml DMEM / 10% foetaal runderserum (FBS) in steriele kweek 100 mm schalen bij 37 ° C en 5% _CO2 in een bevochtigde incubator. Bepaal het aantal cellen met een Neubauer kamer door het tellen van cellen in de vier 16-square sets. Het aantal cellen per ml wordt verkregen door het gemiddelde aantal cellen in de vier 16-square sets en dit aantal te vermenigvuldigen met 10 ^4. Voor iedere keer na infectie in stap 1,3, gebruik 1 x 10 ⁷ HFF cellen.
3. Mock-infecteren infecteren HFF cellen met adenovirus type 5 (Ad5) wild-type (WT) (H5pg4100 ⁸⁾ in 100 mm weefselkweekplaten gebruik 1 ml van Ad5 in DMEM per schaaltje met een MOI van 30 Focus Forming Unit of FFU per cel. Incubeer 2 uur in ahumidified celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO ₂ voorzichtig schommelen van de gerechten elke 15 min een homogene verdeling van het virus inoculum over de cellen te waarborgen. Hierna verwijdert het medium vervangen door vers DMEM aangevuld met 10% FBS en incubeer gedurende 16, 24 of 36 uur in een bevochtigde celkweek incubator bij 37 ^° C en 5% _CO2. Ga verder met stap 2.1.

2. Voorbereiding van de Sub-nucleaire Fracties verrijkt met Adenovirus RC

1. Oogst Ad5-besmet of mock-geïnfecteerde HFF cellen met een cel scrapper en het verzamelen van de cellen in steriele centrifugebuizen. Bepaal het aantal cellen zoals in stap 1,2. Gebruik 1 x 10 ⁷ cellen voor elke keer na infectie opgegeven in stap 1.3.
2. Centrifugeer de cellen bij 220 xg, 4 ° C gedurende 5 min.
3. Resuspendeer de celpellet in ijskoud PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na ₂ HPO ₄ en 1,8 mM KH _{2PO 4).} Was celpellets 3 maal gebruik 5 ml ijskoude PBS per wasbeurt. Daartoe centrifuge de cellen bij 220 xg, 4 ° C gedurende 5 min De bovendrijvende vloeistof (SN) weggooien en resuspendeer de celpellet door voorzichtig pipetteren.
4. Om het plasmamembraan verstoren, resuspendeer de celpellet in 700 pl ijskoude hypotonische buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCI, 1,5 mM _MgCl2, 0,5 mM DTT, 20 μ g / ml fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) een mengsel van cysteïne, serine, threonine en aspartyl protease remmers waaronder 10 μ g / ml runder alvleesklier trypsine inhibitor, 10 μ g / ml pepstatine A en 10 μ g / ml N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L -argininal) en laat de cellen zwellen op ijs gedurende 3 uur.
5. Lyse van de cellen met behulp van een homogenisator met een loszittende Een type teflon stamper. Voer 80 dounce beroertes en beeldscherm monsters per 20 slagen per helderveld microscopie zodat alle cellen zijn gelyseerd, maar nuclei not is beschadigd of gescheurd.
6. Centrifugeer de cel homogenaat bij 300 xg, 4 ° C gedurende 5 min. Bewaar de SN de cytoplasmatische fractie bij -20 ºC in een centrifugebuis.
7. Om celresten uit kernen te verwijderen, resuspendeer de pellet in 750 μ l oplossing 1 (S1) (0,25 M sucrose, 10 mM _MgCl2 20 μ g / ml PMSF, een mengsel van cysteïne, serine, threonine en aspartyl protease remmers waaronder 10 μ g / ml runder alvleesklier trypsine inhibitor, 10 μ g / ml pepstatine A en 10 μ g / ml N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal) en laag over een gelijk volume van oplossing 2 (S2) (0,35 M sucrose, 0,5 mM _MgCl2, 20 μ g / ml PMSF, een mengsel van cysteïne, serine, threonine en aspartyl protease remmers waaronder 10 μ g / ml runder alvleesklier trypsine inhibitor, 10 μ g / ml pepstatine A en 10 μ g / ml N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal). Centrifuge bij 1400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten.
8. Gooi de SN met behulp van een micropipet. Vermijd de pellet te verstoren.
9. Resuspendeer de pellet met geïsoleerde kernen in 750 μ l van S2.
10. Om subnucleaire fracties verrijkt met adenovirus RC (RCF) isoleren Sonificeer geresuspendeerd kernen met een ultrasoon bad, 5 min met twee pulsen, of totdat alle kernen zijn gelyseerd zoals waargenomen met helderveld microscopie. Gebruik ijs in ultrasoon bad nodig om monsters op of onder 4 ° C houden.
11. Laag het gesoniceerd kernen over een gelijk volume oplossing 3 (S3) (0,88 M sucrose, 0,5 mM _MgCl2) en centrifugeer bij 3000 xg, 4 ° C gedurende 10 min. Bewaar de 1,5 ml supernatant als nucleoplasmatische fractie (Npl) bij -70 ° C. Resuspendeer de pellet in 700 μ l van S2 en opslag als RCF bij -70 ° C.

3. Western Blot Analyse van RCF

LET OP: Voor de Western Blot analyse van Npl en RCF fracties set opzij 640 pi voor Npl en 300 μ l voor RCF uit de totale verkregen in stap 2.11 volume.

1. Meng 15 μ l van elk subnucleaire fractie in Laemmli buffer 2x (4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0,004% broomfenolblauw, 0,125 M Tris-HCl pH 6,8) en koken bij 95 ° C gedurende 5 min. Plaats de monsters in een 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) denaturerende gel en gescheiden eiwitten gedurende 1,5 uur bij 20 milliampère (mA).
2. Overdracht eiwitten door elektroblotten gedurende 1,5 uur bij 400 mA op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen.
3. Blok membraan gedurende 2 uur bij KT middels 3% magere droge melk in PBS.
4. Incubeer O / N bij 4 ° C met primair antilichaam tegen virale E2A-DNA-bindend eiwit (B6-8 ⁹⁾ bij een 1: 500 verdunning in PBS / 0,3% magere melkpoeder.
5. Was membraan 3 maal met PBS / 0,1% Tween 20 gedurende 10 minuten.
6. Incubeer het membraan met de muis anti-IgG een secundairetibody gekoppeld aan mierikswortelperoxidase (HRP) bij een 1: 10.000 verdunning in PBS gedurende 2 uur bij KT.
7. Was het membraan 3 maal met PBS / 0,1% Tween 20 gedurende 10 minuten.
8. Ontwikkel het membraan met behulp van versterkte chemiluminescentie en röntgenfilms.

4. Virale DNA Detection in RCF

LET OP: Voor DNA isolatie van zowel Npl en RCF fracties, gebruiken 210 μ l voor Npl en 100 μ l voor RCF van het totaal verkregen in stap 2.11 volume.

1. Incubeer sub-nucleaire fracties gedurende 1 uur bij 55 ° C met 1 mg / ml proteïnase K en 0,5% Tween 20.
2. Inactiveer proteinase K door de monsters te incuberen gedurende 10 min bij 95 ° C.
3. Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g bij kamertemperatuur 2 min.
4. Verzamel de SN. Precipiteren van het DNA met 1/10 volume 3M natriumacetaat en één volume isopropanol O / N bij 4 ° C.
5. Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
6. Gooi de SN uzingen een micropipet. Was de pellet met 70% ethanol en centrifugeer bij 20.000 xg, 4 ° C gedurende 5 min.
7. Resuspendeer het DNA in 10 μ l 10 mM Tris-HCl pH 7,4
8. Kwantificeren DNA met een spectrofotometer door het meten van de optische dichtheid (OD) bij 260 nm.
9. Viraal DNA amplificeren, gebruik 100 ng DNA uit elke subnucleaire fractie in een standaard PCR-reactie met gebruikmaking van Taq DNA-polymerase in 25 μ l reactievolume met primers die de amplificatie van een gebied binnen de major late transcriptie-eenheid toe, van nucleotide 7273 tot nucleotide 7353 (81 bp) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Gebruik de volgende cyclusomstandigheden: Initiële denaturatie gedurende 3 minuten bij 95 ° C, gevolgd door 20 cycli van amplificatie (1 min bij 95 ° C, hybridisatie gedurende 1 minuut bij 62 ° C en verlenging gedurende 30 seconden bij 72 ° C) en een laatste verlenging stap 3 min bij 72 ° C.
10. Voer het PCR product in 2% agarose gels, bij 90 V. Stain met ethidiumbromide in 0,5 μ g / ml eindconcentratie en visualiseren DNA viraal DNA verrijking bevestigen in de RCF. Handvat ethidiumbromide met uiterste voorzichtigheid en zorgen er altijd voor om handschoenen te dragen, aangezien deze verbinding is een krachtige mutagene stof. Gooi ethidiumbromide volgens de institutionele richtlijnen.

5. Laat Viraal mRNA detectie in RCF

LET OP: Voor de RNA-isolatie van zowel Npl en RCF fracties, gebruiken 640 μ l voor Npl en 300 μ l voor RCF uit de totale verkregen in stap 2.11 volume.

1. Isoleren RNA uit subnucleaire fracties Trizol gebruik volgens de instructies van de fabrikant. Resuspendeer de RNA in 50 μ l DEPC (diethilpyrocarbonate) behandelde water.
2. Kwantificeren van de RNA met behulp van een spectrofotometer de OD bij 260 nm te meten (ongeveer 3 μ g worden verkregen). Bewaar het RNA in 50 ng / gl aliquots bij -70 ° C.
3. Controleer gezuiverd RNAde afwezigheid van DNA-contaminatie door het uitvoeren van een controle-PCR reactie in afwezigheid van reverse transcriptase (RT), gebruik 5 ng totaal RNA en cyclusomstandigheden in stap 4.9 beschreven.
   1. Als DNA verontreiniging afwezig geen amplicon worden geproduceerd. Als DNA verontreiniging aanwezig is, incubeer de monsters met 10 U DNase I, 10 U RNase inhibitor, 0,1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl en 15 mM _MgCl2 gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Ga opnieuw isoleren RNA zoals in stap 5,1.
4. Virale mRNA geassocieerd met RCF analyseren amplificeren 100 ng RNA uit elke fractie subnucleaire door RT-PCR met behulp van primers ontworpen om adenovirale late mRNA van verschillende genfamilies (tabel 1) te detecteren.
   1. Voor reverse transcriptie (RT), gebruikt 100 ng RNA uit elke fractie subnucleaire in een standaard RT-reactie met M-MuLV RT enzym in 20 μ l reactievolume gedurende 1 uur bij 42 ° C en 10 min bij 70 ° C.
   2. Voor versterking, gebruik 1μ l van het cDNA in PCR-reacties, zoals in stap 4,9. Gebruik de volgende cyclusomstandigheden: Initiële denaturatie gedurende 3 minuten bij 95 ° C, gevolgd door 25 cycli van amplificatie (1 min bij 95 ° C, hybridisatie gedurende 1 min bij de in tabel 1 en de verlenging 30 seconden bij 72 ° C temperatuur) en een laatste verlenging stap gedurende 3 min bij 72 ° C.
5. Voer de RT-PCR-producten in 2% agarosegels, op 90 V. Stain gels met ethidiumbromide bij 0,5 μ g / ml uiteindelijke concentratie en visualiseren om virale late mRNA associatie met het RCF bevestigen. Behandel ethidiumbromide zoals in stap 4.10.

6. Immunofluorescentie Visualisatie van RCF

Opmerking: Voer nu deze procedure onder een laminaire stroming kast contaminatie van monsters met eventuele stofdeeltjes te voorkomen, en alle oplossingen filteren vóór gebruik.

1. Spot 5 gl van de RCF fractie verkregen in stap 2.10 directly een silaan beklede slide.
2. Laat de vlek drogen gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Rehydrateren door langzaam en indirect pipetteren 500 μ l PBS in een druppel naast de RCF plek en te laten stromen door het kantelen van de dia. Afvoer van het overtollige PBS vanaf de zijkant.
4. Blok door het bedekken van het monster met 500 μ l van PBS / 5% runderserumalbumine (BSA) gedurende 2 uur bij KT.
5. Was de dia 3 keer door voorzichtig en indirect pipetteren 500 μ l PBS op het monster. Kantel de dia voor de afvoer van het overtollige PBS.
6. Incubeer het monster met het primaire antilichaam tegen virale E2A-DNA-bindend eiwit (B6-8 ⁹⁾ bij een 1: 500 verdunning in PBS gedurende 2 uur bij KT. Bedek de bevlekte monster met 20 μ l van de antilichaamoplossing en incuberen in een vochtige kamer om uitdrogen te voorkomen.
7. Was het monster 3 keer met PBS / 0,02% Tween 20 door voorzichtig en indirect pipetteren 500 μ l PBS op het monster. Kantel de dia tap de exproces wasoplossing.
8. Incubeer de monsters met muizen anti-IgG secundair antilichaam gekoppeld aan een fluorofoor die wordt geëxciteerd bij 488 nm in een 1: 2000 verdunning in PBS, gedurende 1 uur bij 4 * C. Bedek de bevlekte monster met 20 μ l van de antilichaamoplossing en incuberen in een vochtige kamer om uitdrogen te voorkomen.
9. Was het monster 3 keer met PBS / 0,02% Tween 20 door voorzichtig en indirect pipetteren 500 μ l PBS op het monster. Kantel de dia voor de afvoer van het overtollige wasoplossing.
10. Bedek de gespot monster op de dia met een dekglaasje met behulp van 2 μ l PBS / 10% glycerol als montage medium. Seal met duidelijke nagellak en slaan al -20 ºC.
11. Analyseer de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een 63x objectief en een 1,4 numerieke apertuur (NA) bij een golflengte van 488 nm.

Results

Aangezien virale replicatie compartimenten (RC) zijn subnucleaire viraal geïnduceerde structuren bestaande uit eiwitten en nucleïnezuren, vergelijkbaar met andere nucleaire domeinen, bleken zij vatbaar voor isolatie te worden door snelheidsgradiënten gebaseerd op biochemische kenmerken. Kritische stappen van de fractionering protocol worden geïllustreerd in figuur 1. Bij elke stap de monsters moeten worden gevolgd met helderveld microscopie om de integriteit van de verschillende subcellulaire fracties w...

Discussion

Om de moleculaire mechanismen die de regulatie van cellulaire activiteiten door virale infectie bepalen, te verduidelijken, zou het begrijpen van de samenstelling en activiteiten geassocieerd met RC van essentieel belang zijn. Daarom, om een gedetailleerde analyse van RC te maken, hebben we een celvrij systeem opgezet dat gebruikmaakt van de grootte en biochemische samenstelling van deze door virus geïnduceerde structuren, om subnucleaire fracties verrijkt met RC te isoleren met behulp van een eenvoudige procedure die ve...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	12100-046	Opwarmen in een 37 ºC waterbad voor gebruik
Fetal Bovine Serum	Gibco	12484-028
Sucrose, Ultra Pure	Research Organics	0928S	Bereid een 2.55 M stockoplossing en bewaar bij 4 ºC
Dounce homogenisator	Kontess Glass Company	884900-0000
Branson 1800 Ultrasoon Bad	Branson	Z769533 SIGMA	15 min voor gebruik inschakelen.
Goat anti-Mouse IgG1 Secundaire Antistof, Alexa Fluor 488 conjugaat	Life Technologies	A-21121	Gebruik bij een 1:2.000 verdunning in PBS
Silane-Prep Slides	Sigma	S4651-72EA	Open in een laminaire flow kast
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraat	Pierce ThermoScientific	34080