Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Summary

Kernmembraaneiwitten spelen een centrale rol in veel fundamentele biologische processen en zijn betrokken geweest bij een verscheidenheid aan menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft een nieuw Cre/Lox-gebaseerd muismodel dat de ruimtelijk-tijdelijke controle van LINC-complexen-verstoring mogelijk maakt.

Abstract

Kernmigratie en verankering in zich ontwikkelende en volwassen weefsels is sterk afhankelijk van grote macromoleculaire eiwitassemblages die LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexen) worden genoemd. Deze eiwitschalen overspannen de kernmembraan en verbinden het binnenste van de kern met componenten van het omringende cytoplasmatische cytoskelet. LINC complexen bestaan uit twee evolutionair geconserveerde eiwitfamilies, Sun eiwitten en Nesprins die C-terminale moleculaire signaalsequenties hebben die de SUN en KASH domeinen worden genoemd, respectievelijk. Sun eiwitten zijn transmembraan eiwitten van de binnenste kernmembraan waarvan het N-terminale nucleoplasmatische domein interactie heeft met de kernlamina terwijl hun C-terminale SUN domeinen uitsteken in de perinucleaire ruimte en interactie hebben met het KASH domein van Nesprins. Canonieke Nesprin isoformen hebben een variabel gedimensioneerde N-terminus die zich in het cytoplasma projecteert en interactie heeft met componenten van het cytoskelet. Dit protocol beschrijft de validatie van een dominant-negatieve transgene muisstrategie die endogene SUN/KASH interacties verstoort op een celtype-specifieke manier. Onze aanpak is gebaseerd op het Cre/Lox systeem dat veel nadelen omzeilt zoals perinatale letaliteit en cel niet-autonome fenomenen die geassocieerd zijn met germinale modellen van LINC complex inactivatie. Om deze reden biedt dit model een nuttig hulpmiddel om de rol van LINC complexen te begrijpen tijdens ontwikkeling en homeostase in een breed scala aan weefsels.

Introduction

De nucleaire enveloppe (NE) scheidt de nucleoplasma van het cytoplasma. Het bestaat uit een binnenste en buitenste kernmembraan (INM en ONM, respectievelijk) die aansluiten op kernporiën. De lumen afgebakend door beide membranen heet de perinucleaire ruimte (PNS). De ONM is een uitbreiding van het ruwe endoplasmatisch reticulum (ER) en de INM hecht aan de nucleaire lamina, een maaswerk van nucleaire type V intermediaire filamenten vertegenwoordigers A- en B-type lamins ^1,2. Linkers van het Nucleoskeleton cytoskelet (LINC) complexen macromoleculaire samenstellingen die de gehele kern envelop overspannen fysiek het inwendige van de kern verbinden met cytoskelet filamenten en moleculaire motoren (figuur 1A). Ze bestaan ​​uit interacties tussen evolutionair geconserveerde motieven die twee families van integrale transmembraaneiwitten van de NE karakteriseren: Zon (Sad1 / Unc84) eiwitten en Nesprins (Nuclear Envelope SPectRINS). Bij zoogdieren, sun1 en Sun2 are transmembraaneiwitten van de INM waarvan N-terminale gebied nucleoplasmatische interageert direct met A- en B-type lamins ^3-5. Aan de andere kant van de INM binnen de PNS, Zon eiwitten haven een evolutionair geconserveerde gedeelte van ~ 150 C-terminale aminozuren genoemd SUN domein. SUN domeinen interactie rechtstreeks met de evolutionaire-geconserveerde KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologie) domein, de moleculaire ondertekening van Nesprins. KASH domeinen bestaan ​​uit een stuk ~ 30 C-terminale aminozuren die uitsteekt in het PZS, gevolgd door een transmembraandomein ^6. Ten minste vier verschillende Nesprin genen (Nesprin1-4) coderen KASH bevattende eiwitten die lokaliseren op de NE ^7. De cytoplasmatische regio Nesprins, waarvan de afmetingen variëren van ~ 50 kDa (Nesprin4) een verbazingwekkende 1000 kDa (Nesprin1 reus), bevatten meerdere spectrin herhaald en specifieke motieven waarmee de interactie met cytoskelet componenten zoals actine, plectine en moleculaire motoren ^{8- 13.}

Studies bij gewervelde en ongewervelde dieren hebben aangetoond dat Lamin / Zon / Nesprin / moleculaire motoren vormen een evolutionair geconserveerd "as" beheersen van nucleaire migratie en verankering. Verschillende knock-out (KO) muismodellen van LINC complexe componenten zijn beschreven en waren instrumentaal in een kader om de rol van de Zon en Nesprin eiwitten in het NE begrijpen tijdens zoogdieren ontwikkeling ^9,14,15. Echter, deze modellen huidige aantal belangrijke nadelen, met name: 1) moeilijkheden bij de interpretatie fenotypes als gevolg van niet-autonome effecten, 2) moeilijkheden cel onderscheiden de fenotypische bijdragen van KASH bevattende vs. KASH-less Nesprin isovormen ^16, 3) het functionele redundantie van Sun en Nesprin eiwitten in het NE in talrijke celtypen vereist complexe fokprogramma's om alle SUN-KASH interacties in muizen ^{17 en} 4) van de perinatale sterfte van muizen deficiënt voor de KASH-domein van zowel inactiverenNesprins1 en 2 zich verzet tegen de analyse van de volwassen fenotypen ^18.

Dit protocol beschrijft een nieuw muismodel ontworpen om alle SUN-KASH interacties in vivo te verstoren, in een cel autonome ontwikkeling gereguleerde wijze, zonder daarbij veel van de bovengenoemde nadelen. Dit Cre /-lox gebaseerde muismodel voert twee begrippen: 1) de KASH domein van elke bekende Nesprin eiwit is voldoende om EGFP richten op NO in celkweeksystemen en 2) SUN domeinen wisselwerking promiscuously met KASH domeinen, waardoor overexpressie van elke KASH domein alle endogene SUN domeinen verzadigen en inactiveren LINC complexen in een dominant-negatieve manier ¹⁷ (Figuur 1B). Dit protocol beschrijft weefsel oogsten en verwerken stappen gebruikt om de verstoring van SUN-KASH interacties in cerebellaire Purkinje cellen bevestigen.

Protocol

Ethiek Verklaring: Procedure waarbij proefdieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Washington University in St. Louis.

1. Mouse Fokkerij en Genotyping

1. Broeden Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muizen met Tg (PCP2-Cre) muizen om Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20 produceren. Opmerking: Terwijl de rest van dit protocol is gericht op het gebruik van de Tg (PCP2-Cre) muizenlijn binnen het cerebellum EGFP-KASH2 expressie Purkinje cellen te beperken, kan een soortgelijke procedure gevolgd met andere Tg (Cre) muis ( Figuur 2A).
2. Voeren genotypering om pups herbergen zowel EGFP en Cre transgenen zoals eerder beschreven ¹⁹ te identificeren.

2. Voorbereiding van de Materialen voor Dissection en Tissue Collection

1. Bereid 100 ml 30% sucrose in PBS (30 g sucrose / 100 ml 1x PBS) en bewaar bij -20 ° C. De dag van weefsel harvesting, ontdooien en load ~ 30-35 ml van sucrose oplossing in een 35 ml spuit voor transcardial perfusies.
2. Maak 40 ml van 4% PFA in PBS (10 ml 16% paraformaldehyde en 30 ml PBS). Load ~ 30-35 ml van 4% PFA in een 35 ml spuit voor transcardial perfusies.
3. Vul een 10 cm weefsel kweekplaat met 10 ml PBS weefseldissectie.
4. Bereid een ketamine / xylazine cocktail bestaande uit 16 mg / ml ketamine en 3 mg / ml xylazine.
5. Bereid een oplossing van 70% ethanol voor de dissectie.

3. Dissection en Tissue Collection

1. Met behulp van een injectiespuit 1 ml, injecteer 500 ul van ketamine / xylazine cocktail per 25 gram lichaamsgewicht en wacht ~ 15 min. U kunt ook gebruik maken van een ander institutioneel goedgekeurd sedatie methode die geschikt is voor het biologische systeem van belang is.
2. Bij sedatie, zacht knijpen de achterpoot van het ontbreken van pijnreactie bevestigen pin alle poten op piepschuim lade met de dorsale zijde van demuis naar beneden.
3. Spuit de buik met 70% ethanol en een insnijding van de onderbuik naar de top van de ribbenkast voor de toegang tot het hart te krijgen.
4. Maak een kleine incisie in het rechter atrium van het hart en plaats de spuit met de 30% sucrose oplossing in het linkerventrikel van het hart.
5. Perfuseren de oplossing bij een snelheid van ~ 2-5 ml per minuut. Wanneer leeg, verwijder de spuit en herhaal met de 4% PFA-oplossing.
6. Losmaken van de muis van het piepschuim lade en onthoofden toegang tot de hersenen.
7. Verwijder de huid rond de kop van het dier met behulp van pincet en een schaar. Porren een gat in het achterste deel van de schedel met een naald en verwijder voorzichtig de schedel met een schaar en ontleden tang.
8. Zodra de hersenen duidelijk toegankelijk, een tang om het cerebellum te verwijderen en deze in PBS. Bisect het cerebellum in het sagittale vlak met een scalpel en overbrengen naar de 30% sucrose oplossing overnacht bij 4 ° C. Opmerking: Om prepzijn paraffinecoupes, bevestig het cerebellum overnacht bij 4 ° C in 4% PFA vóór tissue inbedding en snijden.

4. Tissue Verwerking en Sectioning

1. Bereid een suspensie van droog ijs en 2-methyl- butaan. Laat de temperatuur van het bad equilibreren 5 min.
2. Vul een cryomold met oktober verbinding en zet de helft van de doorgesneden cerebellum in de mal.
3. Met behulp van een dissectiemicroscoop en een pincet standpunt van de kleine hersenen zodat de doorgesneden oppervlak (nabij de middellijn van het cerebellum) naar boven.
4. Breng de cryomold om het droogijs slurry gedurende 5 minuten tot de verbinding oktober een stevige witte matrix rond het weefsel specimen heeft gevormd. Opmerking: Het bevroren monster kan nu worden opgeslagen bij -20 ° C indien nodig.
5. Label voorbehandeld poly-lysine dia's voor het verzamelen van weefsel secties en de voorbereiding van de cryostaat volgens de instructies van de fabrikant om 15 micrometer secties van de cere verzamelenbellum. Om de secties verzamelen, voorzichtig contact opnemen met de afdeling oktober met de poly-lysine gecoate zijde van de dia. Om de oriëntatie van de punt te bewaren, moet de schuif tijdens deze stap niet roteren.
6. WINKEL weefselcoupes bij -20 ° C tot verder gaat met kleuring en beeldvorming.

5. kleuring en beeldvorming van kleine hersenen secties

1. Bereid de volgende oplossingen vóór weefselkleuring:
   ~ 50 ml PBS
   ~ 5-10 ml van 4% PFA in PBS
   ~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% donkey serum in PBS
2. Dooi cerebellaire secties. Belangrijker nog, het minimaliseren van hun blootstelling aan een bron van voortdurende en intens licht te vervagen van EGFP voorkomen.
3. Met behulp van een hydrofobe barrière pen, trek een rechthoek rond het weefsel secties.
4. Post-fix de secties met 4% PFA gedurende 5 min. Gebruik voldoende vloeistof om het hele gebied afgebakend door de hydrofobe barrière (meestal ~ 500 pi) te dekken. Met behulp van een vacuüm of pipet, reBeweeg de fixerende is bijzonder voorzichtig het weefsel secties niet te verstoren.
5. Met een pipet voorzichtig toepassing PBS op de dia zonder verstoring van het weefsel secties. Na 5 min met de stofzuiger of pipet om de vloeistof voorzichtig verwijderen. Herhaal de PBS spoelen in totaal drie keer.
6. Met behulp van een pipet voorzichtig toepassing van de juiste verdunning van primaire antilichamen (3 ul Calbindin en / of Nesprin2 antilichaam per 900 ul oplossing) in 0,5% Triton X-100, 10% ezel serum in PBS. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker.
   Opmerking: EGFP-KASH2 zichtbaar door directe fluorescentie microscopie op bevroren secties, en het is niet nodig om een ​​anti-EGFP-antilichaam te gebruiken. Indien paraffine secties zijn opgesteld, beeldvorming van EGFP-KASH2 vereist immunodetectie met een anti-EGFP-antilichaam.
7. Verwijder de antilichaam-oplossing en spoelen met PBS driemaal.
8. Bereid 1: 1000 verdunningen van Alexa-Fluor secundaire antilichamen in 0,5% Triton X-100,10% ezel serum in PBS en op te slaan in het donker.
9. Verwijder voorzichtig de laatste PBS spoelen en toepassen van de secundaire antilichaam verdunning gedurende een uur in het donker.
10. Verwijder de tweede antilichaam oplossing, spoelen en wassen de sectie drie keer. Indien nodig, breng dan een nucleaire vlek, zoals DAPI (~ 300 nM) gedurende de eerste PBS toepassing.
11. Volledig te verwijderen van de PBS-oplossing uit de hele weefsel en plaats ~ 5-7 ul van montage media op de sectie weefsel. Plaats een glazen dekglaasje bovenop de weefselsectie en gereserveerd voor ~ 15-30 min bij kamertemperatuur in het donker.
12. Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de juiste filters voor EGFP en andere golflengten geschikt voor het secundaire antilichamen die in stappen 5,8 / 5,9 visualiseren. In cerebellaire plakjes, gebruik dan een 20X doelstelling EGFP-KASH2 nucleaire velgen bekijken.

Results

Dit protocol illustreert de bruikbaarheid van de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muismodel voor EGFP-expressie KASH2 cerebellaire Purkinje-cellen middels Tg (PCP2-Cre) muizen beperken. In Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) nakomelingen, het LacZ / V5 open leeskader wordt uitgesneden op P6 door het Cre recombinase hetgeen leidt tot de expressie van EGFP-KASH2 specifiek gericht op Purkinje cellen (Figuur 2A). Zoals verwacht, wordt EGFP-KASH2 gericht op de nucleaire enveloppe aangegeven door de EGFP-posit...

Discussion

De meest kritische stap om met succes de studie van de rol van LINC complexen in vivo met behulp van de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) model is om een geschikte Cre muis regel (s) te identificeren. Inderdaad, als Cre actief in andere celtypes zijn betrokken bij soortgelijke trajecten, kan de interpretatie van de resultaten bemoeilijkt. Daarom is het belangrijk om nabijgelegen cellen te onderzoeken, zoals hier in de moleculaire en granulaat cellagen van het cerebellum (Figuur 2B). Ook elke fysiologi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% Paraformaldehyde-oplossing	Electron Microscopy Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Adhesieglazen	StatLab	M1000W
Ezelserum	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anti-Calbindin Antilichaam	Sigma Aldrich	C9848
Anti-EGFP Antilichaam	Abcam	ab13970
Anti-Nesprin2 Antilichaam			Voorgaf in Ref. 21
Fluorescente Montage Media	Dako	S3023
2-methyl butaan	Sigma Aldrich	O3551