Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca 2+ In Aged hippocampus Neuronen

Samenvatting

Intracellulair Ca²⁺-remodellering bij veroudering kan bijdragen aan excitotoxiciteit en neuronbeschadiging, processen gemedieerd door Ca²⁺-overbelasting. We wilden Ca²⁺-remodellering in de verouderende hersenen onderzoeken door middel van fluorescentie- en bioluminescentie-beeldvorming van cytosolisch en mitochondriaal Ca²⁺ in langetermijnculturen van hippocampusneuronen van ratten, een model voor neuronale veroudering.

Samenvatting

Gevoeligheid voor neuron celdood geassocieerd met neurodegeneratie en ischemie zijn zeer toegenomen in de leeftijd van hersenen, maar mechanismen die verantwoordelijk zijn slecht bekend. Excitotoxiciteit een proces zou kunnen bijdragen aan zenuwbeschadiging veroorzaakt door zowel beledigingen wordt gemedieerd door activering van glutamaatreceptoren die ^Ca2 + influx en mitochondriale ^Ca2 + overload bevordert. Een belangrijke verandering in de intracellulaire Ca ²⁺ homeostase of verbouwen van de intracellulaire Ca ²⁺ homeostase kan neuron schade in het oude neuronen bevorderen. Voor het onderzoeken van Ca ²⁺ remodeling bij veroudering hebben we gebruik live cell imaging op lange termijn culturen van de rat hippocampus neuronen die lijken op sommige aspecten neuronen in vivo jaar. Voor dit doel, de hippocampus cellen, op de eerste plaats, vers verspreid van nieuwe zeepaardjes geboren rat en uitgeplaat op poli-D-lysine gecoat glas dekglaasjes. Daarna kweken worden in gecontroleerde media gedurende meerdere dagen of meerdere wEeks voor het onderzoeken van jong en oud neuronen, respectievelijk. Ten tweede worden gekweekte neuronen geladen met fura2 en onderworpen aan metingen van cytosolische ^Ca2 + -concentratie die digitale fluorescentieverhouding imaging. Ten derde worden gekweekte neuronen getransfecteerd met plasmiden die een tandem lage affiniteit aequorine en GFP gericht op mitochondria. Na 24 uur wordt aequorine in de cellen gereconstitueerd met coelenterazine en neuronen worden blootgesteld aan bioluminescentie beeldvorming voor monitoring van mitochondriale ^Ca2 + -concentratie. Dit drietrapsprocedure maakt het monitoren van cytosolische en mitochondriale ^Ca2 + responsen op stimuli zoals bijvoorbeeld de glutamaat receptor agonist NMDA wensen of deze en andere reacties worden beïnvloed door veroudering. Deze procedure kan nieuwe inzichten opleveren over hoe veroudering beïnvloeden cytosolische en mitochondriale ^Ca2 + respons op geselecteerde stimuli en het testen van de geselecteerde geneesmiddelen ter voorkoming neuronenceldood in leeftijd gerelateerde ziekten.

Inleiding

Excitotoxiciteit is een van de belangrijkste mechanismen die bijdragen aan neuronale schade en celdood in neurologische beledigingen zoals ischemie, en in sommige neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer ^1. Dit type neurotoxiciteit wordt voornamelijk gemedieerd door glutamaat handelen over Ca ²⁺ -doorlaatbare, ionotrope NMDA-receptoren (NMDAR) ^2. Blootstelling van gekweekte neuronen glutamaat excitotoxiciteit kan tot ^3, waarbij neuronale apoptose ⁴ veroorzaakt. Wij en anderen hebben eerder gemeld dat neuronale gevoeligheid voor NMDA-geïnduceerde apoptose kan veranderen in vitro ontwikkeling en veroudering ^5-8.

Het is algemeen aanvaard dat een toename van de vrije cytosolische ^Ca2 + -concentratie ^([Ca2 +] _cyt) leidt tot activatie cellen. Als dit echter aanleiding te hoog is en / of voldoende duurzame, kan celdood ⁹ leiden. Bovendien is voorgestelddat excitotoxiciteit vereist mitochondriale ^Ca2 + opname ^10, aangezien het behandelen neuronen met een mitochondriale ontkoppelaar beschermd neuronen tegen door glutamaat geïnduceerde celdood ^11. Indien mitochondriën te veel ^Ca2 +, kan de opening van de mitochondriale permeabiliteittransitieporie plaatsvinden, waardoor los van cytochroom C en andere pro-apoptotische factoren, en het induceren van apoptose. We hebben onlangs aangetoond dat mitochondriële ^Ca2 + opname direct gerelateerd aan de leeftijd afhankelijke gevoeligheid voor excitotoxiciteit, door direct meten van NMDA-geïnduceerde mitochondriale ^Ca2 + opname in enkele hippocampale neuronen ^5, een werkwijze die is beschreven in dit artikel. De hippocampus, die betrokken zijn bij fysiologische processen zoals leren, geheugen en andere cognitieve processen ^12, zeer gevoelig voor veroudering en neurodegeneratieve aandoeningen ^13. Voorgesteld is dat, na een aantal weken in vitro gekweekthippocampale neuronen tonen een aantal typische kenmerken van oude neuronen ^14. Dienovereenkomstig kan op lange termijn gekweekte hippocampale neuronen een alomvattend model Ca ²⁺ gemedieerde mechanismen van verbeterde excitotoxiciteit bij veroudering onderzoeken bieden.

Het algemene doel van de gepresenteerde methode is dan ook aanzienlijke veranderingen in intracellulaire ^Ca2 + homeostase of ^Ca2 + remodellering in de ouder wordende hersenen onderzoeken waaronder differentiële ^Ca2 + responsen opgewekt door NMDA receptor agonisten op lange-termijn gekweekte hippocampale neuronen . De werkwijze bevat een gedetailleerde beschrijving van de cultuur van rat hippocampale neuronen en de controle cytosolische en mitochondriale ^Ca2 + concentraties van fluorescentie en bioluminescentie beeldvorming in individuele neuronen, respectievelijk. Fluorescentiebeelvorming van cytosolisch ^Ca2 + in gekweekte neuronen is een standaardprocedure. Deze methode is minder betrouwbaar voor subcellulaire ^Ca2 + metingen zoals mitochondriale ^Ca2 +. Redenen hiervoor zijn onder andere het ontbreken van een goede afstemming van de synthetische probes en ongepast affiniteit voor Ca ²⁺ concentraties die kunnen veranderen in de mitochondriën van de lage uM niveau zelfs tot het mM niveau. Het gebruik van ^Ca2 + probes op basis van eiwitten zoals bijvoorbeeld aequorine, kon de targeting naar subcellulaire organellen en gebruik van derivaten verschillende ^Ca2 + affiniteiten met verschillende coelenterazines of gemuteerde probes ontbreekt specifieke ^Ca2 + bindingsplaatsen ^15. Op deze wijze kan bioluminescentie beeldvorming van cellen die aequorine-mitochondriën gerichte monitoring van mitochondriale ^Ca2 + concentraties in individuele neuronen mogelijk te maken. Toch kan deze procedure het gebruik van fotontellende camera's of ultragevoelige CCD camera's voor bioluminescentie ^16-18 vereist. Deze werkwijze kan nieuwe resultaten op die in meer establ worden bevestigdished hersenen veroudering modellen als, bijvoorbeeld, de hersenen plakjes van oude dieren.

Protocol

Ethiek Verklaring: Procedure waarbij proefdieren zijn behandeld in het kader van protocollen door de Valladolid University stallen faciliteit goedgekeurd in overeenstemming met de Europese Conventie 123 / Raad van Europa en Richtlijn 86/609 / EEG.

1. korte en lange termijn Cultuur van Rat hippocampus Neuronen

1. Bereiding van poly-D-lysine beklede, 12 mm dekglaasjes.
   1. Steriliseren 12 mm diameter glazen dekglaasjes in ethanol gedurende tenminste 24 uur. Laat ze drogen onder steriele omstandigheden.
   2. Verdeel de dekglaasjes op een strook van parafilm in een petrischaal. Bedek het oppervlak van elk dekglaasje met 200 ui 1 mg / ml poly-D-lysine. Laat behandelen O / N.
   3. De volgende dag was de dekglaasjes met dubbel gedestilleerd steriel water om de 15 minuten gedurende 90 min onder steriele omstandigheden.
   4. Vul een vier-goed multidish plaat met 500 ul van Neurobasal Cultuur Medium per putje. Neurobasal Cultuur Medium moet worden aangevuld met10% foetaal runderserum, 2% B27, 1 ug / ml gentamicine en 2 mM L-glutamine.
   5. Plaats de dekglaasjes in de multidish plaat. Handhaaf ze in een bevochtigde 37 ° C en 5% CO _2-incubator tot gebruik.
2. Isolatie van hippocampale neuronen van neonatale ratten.
   1. Bereid 1,8 ml papaïne oplossing (rechtstreeks aangekocht) in een flesje (20 ul / ml) onder steriele omstandigheden: Aan een uiteindelijke concentratie van 20 ul vinden / ml ongeveer 40 ul papaïne voeg in 1,8 ml Hank's plus 0,6% BSA (pi worden berekend afhankelijk van de leverancier omstandigheden). Hank's 0,6% BSA wordt bereid door 85 ml HBSS medium met 15 ml van 4% runderserumalbumine (BSA, bereid oplossen van 4 g BSA in 100 ml HBSS). Bereid in een steriele kap.
   2. Incubeer de papaïne in Hank plus 0,6% BSA gedurende 30 minuten bij 37 ° C vóór gebruik. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 urn filter vóór gebruik.
   3. Bereid Ham's F-12 medium door toevoeging van Dulbecco'sGemodificeerd Eagle's Medium poeder (13,5 g per L) in 900 ml dubbel gedestilleerd steriel water. Voeg dan 6 g HEPES en 336 mg _NaHCO3 en de pH op 7,42 met behulp NaOH 4 N. Voeg steriel water om een 1 L oplossing te verkrijgen en filteren met behulp van een 0,20 um polyethersulfon (PES) dop filter. Draag deze werkwijze in een steriele kap. Tenslotte verzadigen van de oplossing met CO ₂ onder steriele omstandigheden vóór gebruik. Store-oplossingen bij 4 ºC en gebruik ze gekoeld.
   4. Euthanaseren pasgeboren (P0) pups rat door onthoofding en was het hoofd in steriele HBS medium. Open de schedel met de hulp van een steriele schaar. Pak de hersenen met een spatel en al snel was het in Ham's F-12 medium.
   5. Voeg een diagonale snede met behulp van een scalpel in elk halfrond (Figuur 1B), en dragen een petrischaal met Ham's F-12 medium.
   6. Teruggooi hersenvliezen voorzichtig met de hulp van dissectie pincet en onder een vergrootglas.
   7. Identificeer de hippocampus in een karakteristiek concave locatie over de cortex met behulp van vergrootglas. Dan scheiden de hippocampus van de cortex door voorzichtig te trekken van de ene grens en te verwijderen uit zijn positie met het oog schaar.
   8. Breng de hippocampus weefsel van een 4-wells plaat gevuld met steriele Hank's medium zonder ^Ca2 + en ^Mg2 + plus 0,6% BSA en wassen hippocampus weefsel. Zonder het verwijderen van de media snijden het weefsel in kleine stukjes (ongeveer 2 x 2 mm) met dezelfde oog schaar.
   9. Overdracht hippocampus stukken aan een flesje dat 1,8 ml pre-gefiltreerde papaïne oplossing. Broeden ze dan bij 37 ° C met af en toe, zacht schudden. 15 min later, voeg 90 ul DNase I-oplossing (50 ug / ml eind) en incubeer gedurende 15 extra minuten.
   10. Breng het weefsel een 10 ml centrifugebuis en was de fragmenten vers Neurobasal kweekmedium. Verkrijgen celsuspensie door het passeren van weefsel fragmenten door een 5 ml plastic pipette.
   11. Centrifugeer celsuspensie bij 160 xg gedurende 5 min. Verwijder het supernatant met een plastic steriele Pasteur pipet en zorgvuldig schorsen pellet met 1 ml geautomatiseerd pipet in 1 ml Neurobasal kweekmedium.
   12. Meet celdichtheid met behulp van een Neubauer telkamer. Zet het glas dekglaasje over de Neubauer kamer. Voeg 10 ul celsuspensie. Zorg ervoor dat de cel schorsing komt de kamer gelijkmatig en maken geen bubbels. Tel het aantal cellen onder de microscoop en de bijbehorende berekeningen een geschikte druppel 40-80 gl bevattende 30 x 10 ³ cellen te verkrijgen. Het totale aantal cellen zal afhangen van het aantal gebruikte dieren.
3. Op korte termijn en op lange termijn de cultuur van de rat hippocampale neuronen.
   1. In de vier-well multidish plaat met 500 pl kweekmedium Neurobasal toegericht en in de incubator, plaat bleef ongeveer 30 x 10 ³ cellen in een daling van ongeveer 50 pi aan elkputje van de multidish plaat met een poly-D-lysine-gecoate, 12 mm diameter glazen dekglaasje.
   2. Handhaaf primaire hippocampale cellen in een bevochtigde 37 ° C en 5% _CO2 incubator gedurende 2-5 dagen in vitro (DIV korte termijn, jonge culturen) of> 15 DIV (lange termijn, leeftijd kweken) voor experimenten zonder de kweek media.

2. Fluorescentie Imaging van cytosolische Ca ²⁺ Concentratie

1. Bereiding van de testoplossingen voor fluorescentiebeeldvorming.
   1. Bereid een externe HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) oplossing die in mM: NaCl 145, KCl 5, _MgCl2 1, _CaCl2 1, 10 glucose, natrium-HEPES 10 (pH 7,42).
   2. Bereid een externe, ^Mg2 + -vrij, HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) oplossing die in mM: NaCl 146, KCl 5, _CaCl2 1, glucose 10 en 10 HEPES (pH 7,42).
   3. Los NMDA in Mg ²⁺ -vrij, HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) bij een final concentratie van 100 uM en aan te vullen met 10 uM glycine.
   4. Bereid een HBS oplossing van KCl in plaats van NaCl door het oplossen (in mM) KCl 145, _MgCl2 1, _CaCl2 1, glucose 10 en 10 HEPES (pH 7,42).
2. Laden van hippocampus cellen met fluorescerende calcium probe fura2 / AM.
   1. Neem de celkweek met dekglaasjes van de incubator en was ze met HBS medium bij RT door ze naar een nieuwe vier-en multidish plaat met 500 ul HBS per putje.
   2. Incubeer de cellen met fura2 / AM 4 uM (bereid op dezelfde HBS medium) gedurende 60 min bij kamertemperatuur (25 ° C) op een donkere plaats.
   3. Na 60 min, wassen dekglaasjes met verse HBS medium.
3. Het opnemen van fluorescentie beelden van cytosolisch [Ca ^2+] in gekweekte cellen.
   1. Zet de lamp, microscoop, perfusie-systeem, fluorescentie camera en computer.
   2. Plaats de dekglaasjes in een thermostaat platform vooropenen 12 mm dekglaasjes op het stadium van het omgekeerde microscoop en selecteer een microscopisch veld met een 40x objectief (olie, NA: 1,3). Perfuseren cellen continu met voorverwarmde (37 ºC) HBS medium in afwezigheid of aanwezigheid van teststoffen. Handhaaf de stroom bij een snelheid van ongeveer 5-10 ml / min.
      Opmerking: Cel perfusie systeem voor levende cellen wordt in een thermostaat platform voor de open 12 mm dekglaasjes gemonteerd. 8-lijnen zwaartekracht aangedreven perfusie systeem uitgerust met een klep controller wordt gebruikt om de oplossingen te perfuseren. Een vacuümpomp is verantwoordelijk voor het verwijderen van overtollige medium. Oplossingen worden verwarmd met behulp van een in-buis verwarmingssysteem.
   3. Leg een achtergrondafbeelding met de sluiter gesloten beide golflengten.
   4. Epi-verlichten cellen afwisselend bij 340 en 380 nm. Neem uitgestraalde licht bij 520 nm elke 5-10 seconden met een fluorescentie camera, welke werd gefiltreerd door een Fura-2 dichroïsche spiegel.
   5. Wanneer de opname periode is voltooid, slaan de volledige sequentie of images geëmitteerd bij 520 nm in de computer voor verdere analyse.
4. Analyse van de geregistreerde fluorescente afbeeldingen.
   1. Open het experiment bestand. Met behulp van de aquacosmos software, klik op 'Ratio' en kies de gewenste verhouding bereik. Bereken de pixel voor pixel verhouding in de beelden teneinde een reeks van afbeeldingen verhouding te verkrijgen.
   2. Aftrekken achtergrond door het aanpassen van de 'achtergrond eliminatie'. Druk op 'start berekening'.
   3. Druk op 'allen tijde volgorde' knop en wissen van de oude regio's van belang (ROI). Voor de kwantitatieve analyse van individuele cellen, vestigen nieuwe gebieden van belang of ROI overeenkomt met individuele neuronen. Gemiddelde verhouding alle waarden in elke pixel overeenkomt met elke ROI en elk beeld een registratie van verhouding fluorescentiewaarden individuele ROI (cellen) te verkrijgen.
   4. Aan de individuele opnames grafiek de verhouding fluorescentie waarden overeenkomen met elke ROI te exporteren naar een grafische progreen M.
   5. Maak de overeenkomstige berekening voor het schatten van de omvang van de stijging van de verhouding fluorescenties voor iedere stimulatie met een geschikte data-analyse en grafische software.

3. Bioluminescentie beeldvorming van mitochondriaal Ca ²⁺ Concentratie

1. Transfectie van gekweekte hippocampale neuronen bij de mitGAmut plasmide.
   Opmerking: De cellen worden eerst getransfecteerd met het plasmide dat een mitGAmut-mitochondriën gerichte gemuteerde sequentie en een aequorine ontbreekt een ^Ca2 + bindingsplaats gefuseerd met het green fluorescent protein (GFP). Deze constructie detecteert grote stijging van mitochondriale ^Ca2 + opname en maakt de identificatie van getransfecteerde cellen door de GFP fluorescentie. Het plasmide werd ontwikkeld en vriendelijk verschaft door P. Brulet en medewerkers ¹⁸ (CNRS, Parijs).
   1. Bereid Neurobasal TF, met Neurobasal Cultuur Medium, ontbreekt foetaal runderserum, B27, gentamicin en 2 mM L-glutamine.
   2. Bereid 50 pi Neurobasal TF plus 2,5 ul transfectie reagens in een flesje (oplossing A). Bereid 50 pi Neurobasal TF plus 4 ug plasmide mitGAmut in een flesje (oplossing B). Voeg voorzichtig oplossing B over oplossing A. Laat het mengen gedurende 20 min, zonder schudden.
   3. Breng de dekglaasjes met hippocampale neuronen nieuwe multidish platen die 200 pl vers Neurobasal TF.
   4. Druppel voor druppel toe te voegen 100 ul oplossing A + B over elke dekglaasje. Incubeer gedurende 30 min. Verwijder het medium. Eenmaal cellen met verse Neurobasal TF wassen. Zet de dekglaasjes naar de oorspronkelijke Neurobasaal kweekmedium.
   5. Culture neuronen nog eens 24 uur bij 37 ° C en 5% CO ₂ na transfectie efficiënte expressie en richten van de probe mogelijk maken.
2. Bereiding van testoplossingen voor bioluminescentie beeldvorming.
   1. Bereid HBS oplossingen bevattende 100 pM NMDA of 145 mM KCl alshierboven (stap 2,1). Bereid HBS oplossing die 10 mM ^Ca2 + plus 100 pM digitonine.
3. Reconstructie van mitochondriën gerichte aequorine met coelenterazine n.
   1. Overdracht dekglaasjes die getransfecteerde hippocampale neuronen vier-wells plaat met 200 ul HBS.
   2. Voeg 4 pi coelenterazine n (200 uM) aan 200 gl HBS voor een eindconcentratie van 4 uM en meng voorzichtig. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur (25 ° C) en in het donker.
4. Het opnemen van bioluminescentie beelden van mitochondriaal [Ca ^2+].
   1. Schakel de microscoop, de lamp, het perfusie systeem, bioluminescentie camera en computer.
   2. Transfer opgelost dekglaasjes een thermostaat is (37 ºC) perfusie kamer en perfuseren continu met voorverwarmd HBS oplossing met een snelheid van 5-10 ml / min.
   3. Met behulp van een 40X objectief (olie, NA: 1,3), selecteer een microscopisch veld bevat cellen die het eenpoaequorins zoals blijkt uit fluorescentie-emissie geassocieerd met expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) met de FITC filters. Een typisch veld kan 1-2 getransfecteerde cellen bevatten. Leg beeld GFP fluorescentie, met behulp van een CCD-camera.
   4. Schakel de microscoop licht. Verwijder de-dichroïsch met doos in het licht pad. Schakel het excitatielicht en sluit het donker-doos voor volledige duisternis.
   5. Perfuseren cellen bij 5-10 ml / min met HBS medium met of zonder testoplossingen voorverwarmd op 37 ° C.
   6. Leg fotonische emissie beelden elke 10 seconden met een foton-tellende camera behandeld met een beeldprocessor.
   7. Aan het einde van elk experiment permeabilize cellen met 0,1 mM digitonine in 10 mM CaCl ₂ in HBS om alle resterende fotonische stoffen afgeven.
      Opmerking: Deze fotonische emissies worden opgeteld om de totale fotonische emissies, een waarde die voor kalibratie in ^Ca2 + concentraties schatten <./ li>
   8. Store bioluminescentie beelden in de computer met een afbeelding van de GFP bijbehorende fluorescentie voordat het foton tellen beeldvorming gevangen.
5. Analyse van bioluminescentie beelden reflecteren mitochondriaal [Ca ^2+].
   1. Kwantificeren fotonische uitstoot met behulp van specifieke software. Fotonische emissies kunnen worden omgezet mitochondriale vrije ^Ca2 + -concentratie ^([Ca2 +] _mit) met de werkwijze beschreven door Brini et al. ¹⁵ algoritme.
   2. Open het beeld dat de GFP-fluorescentie experiment. Select gebieden van belang (ROI) met behulp van specifieke software door het tekenen van de vorm van de getransfecteerde cellen volgens de fluorescentiebeelden vastgelegd aan het begin van het experiment.
   3. Plak dezelfde ROI op elk beeld. Totaal fotonische emissies per ROI wordt berekend met specifieke software voor de luminescentie emissiewaarde (L) voor elke cel op elk punt in de tijd.
   4. Tel alle fotonische Emissionen in de bioluminescentie beelden, met inbegrip van die verkregen na permeabilisatie digitonine, met de specifieke software voor bioluminescentie beeld met alle fotonische-emissies.
   5. Export waarden van fotonische emissie voor elke regio van belang zijn voor een specifieke software voor de berekeningen. Om dit te doen, klikt u op 'Grafiek' om de bioluminescentie waarden te berekenen voor elke ROI op elk tijdstip. Selecteer 'totale waarde' en 'gebruik van de huidige ROI om alle beelden. Druk op 'berekenen'. Sla de 'txt.file' en exporteren naar een werkblad. Voor elke ROI, [Ca ^2+] _mit wordt berekend met het volgende algoritme:
      
      [Ca ^2+] (M) = [R + (R · K _TR) - 1] / [K _R - (R · K _R)];
      
      waar,
      R = [L / (L _totaal λ)] ^{1 / n}
      L is de geëmitteerde luminescentie ten tijde van de meting in elk gebied van belang.
      L _{totaal is}de totale resterende na toevoeging van de in het weefsel op dat moment op het tijdstip van de meting voor elk gebied van belang tellingen luminescentie. λ, _TR K, K _R en n constanten zijn waarvan de waarden afhankelijk combinatie van aequorine (wildtype of gemuteerd) en coelenterazin gebruikt (wild type of n-type) en de opname ¹⁶ temperatuur. Voor de combinatie gebruikt hier (gemuteerd AEQ en coelenterzine n), bij 37 ºC, gebruikten we de volgende waarden: K _R = 8.47 x 10 ^7, K _TR = 165,6 x 10 ^3, n = 1204 en λ = 0138.
6. Maak de overeenkomstige berekening voor het schatten van de omvang van de stijging van bioluminescentie voor iedere stimulus met een geschikte data-analyse en grafische software.

Resultaten

Hier beschrijven we een eenvoudige methode om ^Ca2 + remodeling en de effecten van NMDA op cytosolische en mitochondriale evalueren [Ca ^2,] in oude neuronen. Figuur 1 toont het schema van de werkwijze voor het isoleren en kweken van hippocampale neuronen van neonatale ratten. Voordat u begint, moeten we steriele, poly-D-lysine gecoat glas dekglaasjes bereiden en vinden ze in een 4-goed gerecht. Vervolgens worden neonatale ratten gedood en de hersenen verwijderd. Na het isoleren van ...

Discussie

De herinrichting van intracellulaire ^Ca2 + homeostase in het ouder wordende hersenen is gerelateerd aan cognitieve verliezen, verhoogde gevoeligheid voor ischemische schade, excitotoxiciteit en neurodegeneratie. Om deze hypothese in vitro onderzoeken, Ca ²⁺ beeldvormende procedures beschikbaar. Helaas, levensvatbare kweken van hippocampale neuronen oude niet betrouwbaar. Recentelijk is waargenomen dat langdurige culturen van de rat hippocampale neuronen onderhavige veel van de typische ken...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (van bovien pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bovine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glazen deksels	Labolan	0111520/20012
Papaïne	Worthington	LS003127
4-wels multidish plakjes	Nunc	176740
Petri-schotels	JD Catalan s.l.	2120044T
Steriele pipetten	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonine	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscoop	Carl Zeiss Inc.
Xcite verlichtingssysteem	EXFO
ORCA ER fluorescentiecamera	Hamamatsu
VIM fotontel CCD-camera	Hamamatsu
VC-8 klepcontroller	Warner Instruments
SH-27B verwarmingssysteem	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics