Experimentele Strategieën om Grote Tissue Hiaten in de Gewonde Spinal Cord brug na Acute en chronische Letsel

Samenvatting

Ernstige verwondingen van het ruggenmerg resulteren vaak in weefseldefekten. Er worden twee mogelijkheden beschreven om dergelijke openingen succesvol te overbruggen om weefseladaptatie, regeneratieve reacties en functionele verbetering bij ratten te bevorderen via implantatie van een mechanisch microconnector-systeem na acute verwonding en vijf weken na volledige doorknipping van het ruggenmerg.

Samenvatting

Na een dwarslaesie (SCI) een litteken vormen in de laesie kern die het regenereren van axonen belemmert. Overbruggen van de plaats van letsel na een insult van het ruggenmerg, tumor insnijdingen of weefseldefecten gevolg van traumatische ongelukken kunnen helpen bij het ​​vergemakkelijken algemeen weefselherstel alsook regeneratieve groei van zenuwvezels in en buiten het getroffen gebied. Twee experimentele behandelingsstrategieën worden: (1) implantatie van een nieuw microconnector apparaat een acuut en volledig doorgesneden thoracale ruggenmerg van de rat om opnieuw aan te passen doorgesneden ruggenmerg weefsel stompen, en (2) polyethyleenglycol vullen van de SCI site chronisch gelaedeerde ratten na litteken resectie. Chronische dwarslaesie in dit model u een ruggenmerg doorsnijding die 5 weken toegebracht vóór de behandeling. Beide methoden hebben onlangs bereikt veelbelovende resultaten en gepromoot axonale hergroei, gunstig cellulaire invasie en functionele verbeteringenin knaagdier modellen van ruggenmergletsel.

De mechanische microconnector systeem (MMS) is een multi-channel systeem, bestaande uit polymethylmethacrylaat (PMMA) met een uitlaat slang systeem om negatieve druk uit te oefenen op de MMS-lumen dus trekken aan het ruggenmerg stompen in de honingraat-structuur gaten. Na de implantatie in de 1 mm weefsel tussenruimte het weefsel wordt gezogen in de inrichting. Bovendien is de binnenwanden van de MMS-berichten worden microgestructureerde betere adhesie van weefsel.

Bij chronische ruggenmergletsel benadering ruggenmergweefsel - inclusief de litteken gevulde laesiegebied - gereseceerd over een gebied van 4 mm. Na het litteken microchirurgische resectie de resulterende holte wordt gevuld met polyethyleenglycol (PEG 600) en bleek een uitstekend substraat voor cellulaire invasie, revascularisatie, axonale regeneratie en zelfs compact remyelinisatie in vivo.

Inleiding

Een traumatisch letsel aan het ruggenmerg leidt niet alleen tot verlies van axonen maar meer resultaten in weefseldefecten waarop een regeneratieve respons belemmert (voor review zie ^1,2). Ruggenmerg weefsel wordt vaak verloren door secundaire degeneratie die leidt tot de vorming of gaten cyste in en rond de laesie omgeving. Meest experimentele therapeutische interventies gericht op onvolledige ruggenmerg schade als gedeeltelijke doorsnijding, pletten of contusie verwondingen met een resterende rand van gezond weefsel. Voor volledige verwondingen zoals totale doorsnijdingen als gevolg van traumatische ongevallen of chirurgische ingrepen, zoals tumor resectie, slechts zeer beperkte behandelingsmogelijkheden zijn vandaag de dag ^3,4 beschikbaar. Na volledige doorsnijding, mechanische spanning van het weefsel resulteert in spinale stomp terugtrekken, waardoor een kleine opening in het ruggenmerg. De meeste strategieën richten zich op te vullen dit gat met weefsel, cellen of matrices ^5,6.

Hier, een andere strategiewordt gepresenteerd, namelijk opnieuw aanpassing van de afgescheiden stompen met behulp van een roman microconnector apparaat ^7. Om de twee stompen opnieuw aan te passen, mechanische kracht moet worden aangebracht als een lichte onderdruk op deze (figuur 1) te bereiken. De mechanische microconnector systeem (MMS) is een multi-kanaalsysteem polymethylmethacrylaat (PMMA) met honingraatvormige openingen (figuur 1A) en voorzien van een uitlaat buissysteem. Het wordt geïmplanteerd in het weefsel voeg door volledige doorsnijding ruggenmerg bij ratten (Figuur 1C). Een buis kan worden verbonden met een vacuümpomp om negatieve druk op het mms (figuur 1D). De druk trekt de losgekoppelde ruggenmerg stompen in de honingraat-vormige gaten van de MMS, die microgestructureerde wanden om het weefsel op zijn plaats wanneer de druk wordt losgelaten (Figuur 1B). De buis kan na de operatie intact worden gelaten en om bevestigd aan een osmotische minipompstoffen doordringen in de laesie kern (figuur 1E-F).

Naast een acute doorsnijden van het ruggenmerg ander type volledige laesie gevolg van chirurgische verwijdering van een tumor of een spinale vaste chronische laesie litteken weefsel leidt tot grote verschillen van enkele millimeters, die niet kan worden overwonnen door de mms nu toe. De meeste patiënten met ruggenmerg trauma aan chronische blessures. Bij deze patiënten, een volledig ontwikkelde litteken bezet de laesie kern. De chirurgische verwijdering van de laesie litteken is een concept voor behandeling die momenteel wordt onderzocht na experimentele SCI ^8,9. Terwijl de resectie procedure zelf kunnen worden uitgevoerd zonder dat aanzienlijke bijkomende schade, het resulterende weefsel gat moet worden overbrugd met een geschikte matrix die het mogelijk maakt en bevordert de regeneratie van weefsel en, in het specifieke geval van ruggenmergletsels, de regeneratie van zenuwvezels te handhaven en motorische functies te bevorderen. Het wasgevonden dat laag-molecuulgewicht polyethyleenglycol (PEG 600) is een zeer geschikt materiaal voor dit doel. Het ontbreken van immunogeniciteit en de zeer lage viscositeit mogelijk soepele integratie in het omringende weefsel. Insertie van het biopolymeer alleen bevordert de invasie van goedaardige cellen, zoals endotheliale cellen, perifere Schwann cellen en astrocyten, en - heel belangrijk - het herstel en rek axonen van aflopende of oplopende vezelbanen en hun ensheathment door compact myeline ^8. Deze regeneratieve reacties bleken te worden begeleid door langdurige functionele verbeteringen. De combinatie van resectie van littekenweefsel en daaropvolgende implantatie van PEG 600 bevat een veilige en eenvoudige, doch efficiënte wijze te overbruggen aanzienlijke ruggemerg defecten.

Protocol

Institutionele richtlijnen voor de veiligheid en het comfort van dieren werden nageleefd, en alle chirurgische ingrepen en pre- en post-operatieve verzorging van dieren werden verstrekt in overeenstemming met de wet Duitse Dierenbescherming (State Office, milieu en consumentenbescherming van Noordrijn-Westfalen, LANUV NRW ).

1. volledige doorsnijding van de thoracale ruggenmerg van vrouwelijke Wistar ratten (220-250 g)

1. Bereiding van het ruggenmerg
   1. Gebruik isofluraan inhalatie-anesthesie (2-3% isofluraan in O ₂ / NO ₂ in een verhouding van 1: 2) en bolusinjectie Carprofen (subcutaan [sc] 5 mg / kg). De combinatie van carprofen en het opioïde buprenorfine (0,02 mg / kg sc) aanbevolen. Start operatie wanneer ooglid reflex om lichte aanraking met een wattenstaafje en poot terugtrekking reflex te knijpen stimulus met een pincet worden niet meer waargenomen.
   2. Plaats het dier op een verwarmingselement deken bij 37 ° C te handhaven lichaam temperare tijdens chirurgie en zet oogzalf op de ogen tot droog terwijl onder verdoving te vermijden.
   3. Scheren rug van het dier en de voorbereiding van de huid met een huid ontsmettingsmiddel.
   4. Snijd de huid op de middellijn langs de borstwervels van 4 cm met een chirurgisch mes en openen. Vanaf deze stap, gebruik gesteriliseerd chirurgische instrumenten voor alle procedures (een autoclaaf of onderdompeling-gesteriliseerd).
   5. Trek de spieren boven de borstwervels met een kleine spieren te klemmen.
   6. Verwijder de doornuitsteeksels op thoracale niveau 8 (TH8) en Th9 met een been rongeur door voorzichtig het knippen van kleine stukjes bot, totdat het wervellichaam botten zijn plat.
   7. Gebruik anatomische pincet om de wervelkolom op processus spinosus Th7 tillen en gebruik een rongeur om kleine stukjes wervel bot clip van caudaal naar rostraal tot een laminectomie wordt uitgevoerd bij TH8 en Th9. Maak de dura mater zonder schade door zorgvuldig verwijderen van slechts enkele zeer kleine stukjes wervelbot tegelijk.
   8. Klem de ruggengraat van 2 stabilisatie klemmen aan doornuitsteeksels Th7 en TH10, tilt het dier om de ademhaling bewegingen los te koppelen van de wervels.
2. Voltooi Spinal Cord doorsnijding op Thorax Niveau 8/9
   1. Til de dura mater met fijne tang, knip de dura mater met fijn oog schaar in dwarsrichting.
   2. Houd de laterale afgesneden uiteinde van de dura mater met fijn pincet en plaats een spinale haak in de subarachnoidic ruimte tussen de dura mater en arachnoidea. Voorkom beschadiging van de hersenvliezen door niet te prikken in de pia of dura mater met ofwel een tang of het ruggenmerg haak.
   3. Langzaam draait de haak om het allemaal te plaatsen langs het ruggenmerg weefsel, waarbij zorg niet te prikken in de dura (pia is nog steeds intact).
   4. Til het ruggenmerg ongeveer 1-2 mm naar boven, totdat er een kloof is te zien aan de buikzijde tussen het ruggenmerg weefsel en dura.
   5. Plaats fijn oog schaar in de ruimte between dura en pia en snijd het ruggenmerg, terwijl de wervelkolom haak blijven zitten.
   6. Til de twee stompen van het ruggenmerg met twee tang en visueel zorgen voor volledige doorsnijding.
   7. Voor-control laesie dieren en dieren met een chronische blessure, sluit de dura door onderbroken hechtingen met monofilament niet-adsorbeerbare 9.0 draden.
   8. Voor chronische laesies volgen onderdeel 1.6.
3. MMS Implantatie
   1. Plaats MMs boven de beschadigde plaats de twee buizen die op elke laterale zijde van de wervel en laat deze in laesie holte.
   2. Suture buizen naar de spieren aan de zijde van de wervel met niet-resorbeerbare 4-0 draad stabilisatie van de mms waarborgen. Zorg voor een fixatie van het MMS-bericht met behulp van een tang tijdens deze stap.
   3. Verwijder de MMS-connector pin door te snijden met een paar fijne schaar.
   4. Sluit de dura boven de MMS en hechtdraad met 9,0 draden.
   5. Bevestig een buis naar de vacuümpomp, en verzegelende andere door klemmen.
   6. Pas lichte negatieve druk op de MMS door een vacuümpomp via de open buis, zuigen het ruggenmerg stompen in het MMS-lumen. Breng de negatieve druk gedurende enkele minuten (bij maximum 10 min) en monitor door sensoren (250-350 mbar).
   7. Snij de buizen dicht bij de MMS en verwijder de buizen. Ga verder met stap 1.6.
4. Resectie van Spinal Cord Tissue Inclusief de Chronic Lesion Scar in week 5 na Initial Letsel
   1. Volg de stappen 1.1.1 - 1.1.5.
   2. Identificeren littekenweefsel door bruingele uitstraling en stijf weefsel bovenop het ruggenmerg. Verwijder voorzichtig oppervlakkige lagen van littekenweefsel door te oordelen met fijn pincet en snijden met een fijne schaar. Met deze methode heropenen de plaats van laminectomie het weefsel dat de ruggenmergletsel gebied bloot. Stop met de voorbereiding als de dura hechtdraad visueel wordt geïdentificeerd.
   3. Klem de ruggengraat van 2 stabilisatie klemmen bij Spinlende processen Th7 en TH10, en dan te verheffen van het dier om de ademhaling bewegingen los te koppelen van de wervels.
   4. Met een kleine kartonnen liniaal het ruggenmerg gebied dat moet worden uitgesneden (lengte: 4 mm) en markeren de randen van het respectievelijke weefsel met dwarse insnijdingen aan de verwijdering van het weefsel mogelijk.
   5. Verwijderen littekenweefsel via een combinatie van snijden en aspiratie. Haal het weefsel dat is gescheiden van het ruggenmerg met de dwarse insnijdingen. Gebruik behoedzame aspiratie wanneer kan worden volstaan ​​met het verwijderen van het weefsel mogelijk. Bovendien, wanneer de stijve structuur van het littekenweefsel maakt weefsel aspiratie te moeilijk, maken gebruik van fijne schaar te snijden en dit weefsel te verwijderen.
   6. Steek een stuk (ongeveer 5 mm x 5 mm x 5 mm kubus) van hemostatische gelatine spons in het weefsel kloof tot bloeden afneemt. De gelatinespons zal kleiner worden zodra doordrenkt met vloeistof.
5. Implantation PEG 600
   1. Bereid 1 ml zuiver onverdund PEG 600 voor injectie door verwarmen tot 37 ° C.
   2. Verwijder gelatine spons.
   3. Plaats voldoende (ongeveer 5-7 ul) van PEG in de spleet met een 10 gl spuit of een 10 ul pipet.
   4. Zorgvuldig bestrijken het gebied met een stuk (ongeveer 5 mm x 4 mm) van de kit / dura vervanging.
   5. Bevestig het afdichtmiddel omringende spierweefsel met enkele druppels weefsellijm. Plaats de kit bovenop de gevulde PEG-resectie gap. Om slippen van de kit te voorkomen, gebruiken kleine druppeltjes weefsellijm om de hoeken van het afdichtmiddel vast aan de omringende spierweefsel. Opmerking: Voorkom lekkage van het weefsel lijm op het ruggenmerg weefsel!
6. Sluiting van weefsels en postoperatieve zorg
   1. Suture spieren en huid laag voor laag met onderbroken hechtingen met gevlochten adsorbeerbare 4-0 threads
   2. Injecteer 2 x 2,5 ml natriumchloride (NaCl[0,9%]) bij 36 ° C sc voor rehydratatie na de operatie. Een enkele injectie van 5 ml NaCl zou de huid van het dier te strekken en kan onnodige schade toebrengen aan het dier. Niet dier onbeheerd achter te laten tot de volledige bewustzijn herwonnen.
   3. Injecteer dagelijkse carprofen (sc 5 mg / kg) gedurende ten minste 2 dagen na de operatie. Huis dier in één kooi tijdens de eerste 2 dagen, daarna in groepen van 2-3.
   4. Solliciteer behandeling met antibiotica (dagelijkse orale toediening van enrofloxacine) voor de eerste postoperatieve week.
   5. Doe handmatig blaas plassen op twee tot drie keer per dag door zachtjes strelen over de buik van het dier uit rostraal naar caudaal. Zorg ervoor dat de wervelkolom van het dier niet te bewegen en hoeft het dier niet optillen aan de staart. Handmatig ongeldig blaas het volledig spinalized dier per dag tijdens de hele overlevingstijd. Zorg moet worden genomen om voedsel pellets en water flessen te plaatsen een hoogte die door de dieren kan worden bereikt zonderdie zich op hun achterpoten. Hoewel ze niet volwaardig in achterhand functie, de dieren te verplaatsen en verken de kooien actief onmiddellijk na de operatie. Het wordt aanbevolen om de ratten in gezellige groepen te houden.
   6. Voor chronische laesies laat een overlevingstijd van de dieren van de vijf weken voor litteken resectie. Volg stap 1.4.

Resultaten

Tissue Preservation, Axonal Regrowth en functionele Benefit MMS Implantatie na Acute volledige doorsnijding van het ruggenmerg
Er wordt aangetoond dat de acute implantatie van de mms stabiliseerde de volledig doorgesneden ruggenmerg stompen en verminderde krimp van het weefsel (Figuur 2A versus B). Zoals gevisualiseerd door trichroomkleuring in sagittale secties, de groene bindweefsel kleuring van de fibrotische litteken ...

Discussie

Hier twee verschillende chirurgische benaderingen worden gepresenteerd om leemten weefsel te overbruggen in het ruggenmerg na (1) acute volledige doorsnijding en MMS-implantatie en (2) chronische dwarslaesie en vezelig litteken verwijdering plus PEG matrix implantatie. Beide strategieën leiden tot weefsel behoud en axonale regeneratie alsmede significante bewegingsapparaat functionele verbetering van de behandelde dieren. MMS-implantatie een adequate fixatie van de mms binnen het ruggenmerg door de firma dura hechting n...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PEG 600 Ph Eur	Merck/VWR	8,170,041,000
Gelastypt gelatine sponge	sanofi Aventis	PZN-8789582
Nescofilm Sealant	Roth	2569.1
Baytril	Bayer
Rimadyl (Carpofen)	Pfizer
Forene (Isoflurane)	Abbvie
Kodan (huiddesinfectiemiddel)
Histoacryl (weefsel lijm)
Friedman-Pearson Rongeur, 1 mm cup, recht	Fine Science Tools	16020-14
Twee-in-één Micro Spatula - 12 cm	Fine Science Tools	10091-12
Dumont #7 Forceps - Inox Medical	Fine Science Tools	11273-20
Dumont #5/45 Forceps - Inox Medical	Fine Science Tools	11253-25
Ruggenmergs haak	Fine Science Tools	10162-12
Schaar	Fine Science Tools	14078-10
Klem	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer
Anatomische tang	Fine Science Tools	11000-13
Zelfhoudende retractor	Fine Science Tools	17008-07
Huidklem	Fine Science Tools	13008-12
Aluspray	Selectavet