Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

Samenvatting

We beschrijven een sorteerstrategie voor muis spermatiden met behulp van flowcytometrie. Spermatiden worden ingedeeld in vier zeer zuivere populaties, waaronder ronde (spermiogenetische stappen 1-9), vroege verlengende (spermiogenetische stappen 10-12), late verlengende (spermiogenetische stappen 13-14) en langwerpige spermatiden (spermiogenetische stappen 15-16). DNA-kleuring, grootte en korreligheid worden gebruikt als selectieparameters.

Samenvatting

De differentiatie van muis spermatiden is een kritisch proces voor de productie van een functionele mannelijke gameet een intact genoom aan de volgende generatie over te dragen. Tot nu toe zijn moleculaire studies van deze morfologische overgang belemmerd door het ontbreken van een methode waarmee een goede scheiding van deze belangrijke stappen spermatide differentiatie voor latere analyses. Eerdere pogingen tot goede gating van deze cellen via flowcytometrie kan moeilijk zijn omdat een bijzondere toename DNA fluorescentie in spermatiden ondergaan chromatine hermodellering. Op basis van deze waarneming, geven we gegevens van een eenvoudige flowcytometrie regeling, waardoor reproduceerbare zuivering van vier populaties van muis met ethanol vaste spermatiden, die elk een andere toestand in het vernieuwingsproces kern. Bevolking verrijking wordt bevestigd met behulp van stap-specifieke merkers en morfologische criteria. Het gezuiverde spermatiden kan worden gebruikt voor genomische en proteomic analyses.

Inleiding

Haploïde ronde spermatiden differentiëren in spermatozoa door een proces dat spermiogenese wordt genoemd. Dit omvat veel verschillende stappen, waaronder het verkrijgen van een flagellum, remodellering van chromatine en cytoskelet, verdichting van de kern, evenals het verlies van het grootste deel van het cytoplasma. Deze unieke cellulaire gebeurtenissen moeten nauwkeurig worden gereguleerd om een volwaardige functionele gameet te produceren met een intact genoom dat geschikt is voor bevruchting. Spermiogenese kan nauwelijks in vitro worden bestudeerd, omdat geen enkel betrouwbaar celkweeksysteem tot nu toe in staat is geweest om de voortgang door de verschillende stappen van het proces te ondersteunen. Bovendien leiden actuele in vitro technieken tot een slecht rendement^1,2. In vivo zijn goede overgangen door de verschillende stappen van spermiogenese cruciaal voor de natuurlijke functionele integriteit van de mannelijke gameet. Succesvolle zuivering van spermatiden volgens hun differentiatiestappen is nog nooit bereikt met een niveau van verrijking dat moleculaire karakterisering van spermiogenese mogelijk maakt. Bijvoorbeeld, zuivering van sleutelstappen van de spermatidale differentiatie zou bijzonder nuttig zijn om het zich ontwikkelende acrosoom, vorming van het middenstuk³, celverbindingsdynamiek⁴, RNA-dynamiek⁵, chromatineremodelleringsproces^6,7 of genomische stabiliteit⁸ te bestuderen. Zuivering van spermatiden is bemoeilijkt door hun progressieve morfologische transformatie, het ontbreken van bekende fase-specifieke externe biomarkers, en hun eigenaardige vorm en grootte.

Hoewel de meeste mannelijke kiembaancellende een directe relatie vertonen tussen DNA-kleuring en ploïdie (DNA-inhoud), bemerkten we dat een dergelijke positieve correlatie niet langer van toepassing is op spermatiden. Dit komt voort uit onze vroege waarneming dat secties van de zaadleestjes een variabele intensiteit van DNA-kleuring vertonen gedurende de verschillende stappen van spermiogenese. Hoewel DNA-kleuring consistent is met hun haploïde set chromosomen van spermiogenese stappen 1 tot 7 (ronde spermatiden), observeerden we een scherpe toename in fluorescentie-intensiteit met DAPI of SYTO 16 rond het begin van nucleaire reorganisatie en chromatineremodellering (spermiogenetische stap 8) die een piek bereikt bij het begin van nucleaire verdichting (spermiogenetische stappen 11-12). Na verdichting van de kern neemt de DNA-kleuringsintensiteit af tot spermiëring (spermiogenetische stap 16). We veronderstelden dat dit waarschijnlijk verband hield met de vorming van hun eigenaardige chromatinestructuurtransitie waarbij histonen worden vervangen door protaminen. Daarom ontwikkelden we een betrouwbare flowcytometrie-methode die de scheiding van spermatiden mogelijk maakt door gebruik te maken van de variatie in DNA-intensiteit van spermatiden als een belangrijk selectieparameter.

Een eenvoudige flowcytometrie-aanpak wordt beschreven om muis-spermatiden met hoge zuiverheid (95-100%) te scheiden op basis van hun schijnbare DNA-inhoud (SYTO16-kleuring), grootte en granulositeit. Spermatiden worden gescheiden in vier populaties; spermiogenese stappen 1-9, 10-12, 13-14 en 15-16. Gezuiverde spermatiden zijn geschikt voor genetische/genoomanalyse, evenals voor proteomische toepassingen zoals beschreven in een recente publicatie van onze groep⁹.

Protocol

Animal Care in overeenstemming was met de Université de Sherbrooke dier zorg en gebruik Comite.

1. Tube Voorbereiding

1. De dag voor celsortering, voeg 1-2 ml warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) tot 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem en met 15 ml en 50 ml polypropyleen conische buizen.
   Kritische stap: Zorg ervoor dat elke buis gebruikt in het protocol is gecoat.
   Opmerking: FBS coating voorkomt kiemcellen van het vasthouden aan de buis muren.
2. Langzaam mix O / N geroteerde bij 4 ° C te bekleden de buizen gelijkmatig met een rotator.
3. De volgende dag, verwijder FBS uit gecoate buizen door decanteren.
   1. * Kritische stap: Zorg ervoor dat de 5 ml polypropyleen ronde bodem buizen en de 15 en 50 ml buizen gebruikt voor celpreparaat (protocol stappen 2,1-2,11) volledig ontdaan van FBS te waaieren (dwz, onnauwkeurig afwijking van de kant stromen) te voorkomen. Gebruik een P200 pipet aan de FBS te verwijderen.
      Opmerking: Overblijvende FBS in buizen voorafgaand aan het sorteren kan leiden tot een verlies aan cellen of verontreiniging van andere buizen tijdens celsortering
   2. Laat een klein resterend volume van FBS (ongeveer 100-200 pi) in de polypropyleen 5 ml ronde bodem buizen gebruikt voor het verzamelen van gezuiverde cellen.

2. Celbereiding

1. Offeren een mannetje muis onder verdoving met behulp van _O 2 / isofluraan (inductie bij 5% dan gehandhaafd op 2%), gevolgd door CO ₂ stikken.
2. Accijnzen en decapsulate beide testes en gehakt met een klein schaartje in 500 ul van het sorteren van buffer in een 1,5 ml buis.
3. Flush kiemcellen van testes door zachtjes op en neer pipetteren in de 1,5 ml buis, eerst met een afgeknotte 100-1000 ul tip, en daarna met een intacte 100-1000 ul tip.
4. Verwijder puin en bosjes door een filtratie stap met behulp van een 40 um cel zeef en verzamel filtraat in de 50 ml conische buis previously bekleed met FBS in stap 1.
5. Was het filter eenmaal met sortering buffer tot een totaal volume van 3 ml en overdracht filtraat in de 15 ml conische buis vooraf bekleed in stap 1.
6. Voeg 16 ul van 50 mM EDTA pH 8 per milliliter celsuspensie (48 pi 3 ml) teneinde een uiteindelijke concentratie van 0,8 mM EDTA verkrijgen.
7. Om kiemcellen lossen, voeg langzaam 3 volumes ijskoude 100% ethanol met behulp van een 10 ml pipet zacht schudden (vortex bij lage snelheid), waarbij een melkachtige suspensie te produceren.
   Kritische stappen: langzaam toevoegen van ethanol essentieel en belangrijk voor de integriteit van het celpreparaat behouden. We merkten dat de snelle toevoeging van ethanol veroorzaakt cellysis resulteert in een belangrijke vermindering van sorteerefficiëntie. Voor een 3 ml celsuspensie moet 9 ml ethanol toegevoegd in ongeveer 1 minuut.
8. Incubeer cellen op ijs gedurende 15 minuten met af en toe mengen door inversie.
9. Centrifugeer celsuspensie op 800 g gedurende 5 minuten en verwijder de duidelijkesupernatant.
10. Voorzichtig resuspendeer de vaste kiemcellen in 2 ml buffer sorteren.
11. Voeg 4 pi SYTO16 DNA kleurstof (1 mM oplossing in DMSO) en incubeer gedurende ten minste 30 min (beschermd tegen licht).
    Opmerking: De beste resultaten worden verkregen sortering gebruikt SYTO16 omdat het een permeabele DNA kleurstof die gemakkelijk wordt opgenomen in de sterk verdichte kernen van spermatiden.

3. Cell Sorter Set Up

Opmerking: Hier, een 4-laser (405 nm - violet, 488 nm - blauw, 561 nm - geel-groen, 633 nm - red) 20-parameter BDFACSAria III celsorteerder wordt gebruikt. De BD FACSDiva 6.1.3 software wordt gebruikt voor het visualiseren en analyseren van de data. De instellingen kunnen variëren afhankelijk van het type sorteerder gebruikt.

1. Steriliseer de FACS sorter door het uitvoeren 70% ethanol als mantelvloeistof tijdens het fluidics afsluitprocedure (menu "Cytometer" in de software) voorafgaand aan sortering. Selecteer "Cytometer" in de werkbalk van de software en kies "Fluidic shutdown ". Volg de door de processen genoemde stappen.
2. Bereiden en filter 1x PBS met een 0,22 urn filter om eventuele kristallen en verontreinigingen elimineren. Vul het omhulsel tank naar de bovenste lasnaad aan de binnenzijde van de tank.
3. Start de software en loggen. Start de FACS sorter opwarmen van de lasers ten minste 30 min voor het sorteren. Lopen twee fluïde startup processen voor het spoelen van de ethanol uit de fluïdica. Selecteer "Cytometer" in de werkbalk van de software en kies "Fluidic opstarten". Volg de met de werkwijzen genoemde stappen.
   Opmerking: Dit herstelt fluïdica normale mantelvloeistof (1x PBS).
4. Reinig de sortering blok en de afbuigplaten met gedestilleerd water en droog ze goed af. Sonificeer een 100 urn spuitmond geplaatst in een buis gedestilleerd water gedurende 2 min in een bad ultrasoonapparaat. Veeg het mondstuk grondig.
5. Plaats de 100 micrometer mondstuk in de stroom cel en draai de nozzle-vergrendeling met de klok mee naar de 12hr positie. Stel de huls druk tot 20 psi.
6. Schakel de stroom en de amplitude aan te passen aan streefwaarden verkrijgen van de frequentie (ongeveer 30), Drop 1 (ongeveer 150) en Gap (ongeveer 12) en een stabiele druppel breakoff patroon (enkele satelliet druppels) vast. Schakel demping.
7. Zorg ervoor dat de stroom is recht en raakt het midden van het afval aspirator door het veranderen van de hoek van het soort blok. Opmerking: Een 130 micrometer mondstuk bij 10 psi werd ook getest en geen duidelijke verschil werd gevonden.
8. Stel laser vertraging op 0 voor de blauwe, -77,39 voor de rode, 37,33 voor de violette en -39,85 voor de geel-groene lasers.
9. Set gebieden schalen om 1.14 voor de blauwe, 1.0 voor de rode, 0,75 voor de violette en 0.96 voor de geel-groene lasers.
10. Met behulp van een Test sorteren (in het venster "zijstroom" van de software), ervoor zorgen dat zij stromen worden niet waaieren. In het venster "Side Stream", stel de spanning schuifregelaars van elke zijde stroom, zodat ze op de middle test collectie buis. Als het centrum stroom is niet strak, pas de ² e, ³ e en ⁴ e daling instellingen naar het centrum stroom beperken.
11. Start de Cytometer Setup en Tracking (CS & T) toepassing in de software (menu "Cytometer").
12. Gebruik de cytometer opstelling en het bijhouden van kralen aan 1 druppel per 350 pi tot de karakterisering en het volgen van de cytometer prestaties met instructies van de fabrikant te automatiseren.
13. Stoppen met de toepassing CS & T. Solliciteer CS & T instelling, zorg ervoor dat de parameters stroom nog steeds mogelijk een stabiel druppel breakoff patroon, en zet de Sweet Spot knop zoals beschreven in de instructies van de fabrikant (in de "breakoff venster").
14. Optimaliseren van de Drop Delay waarde met fluorescerende kralen (zie tabel van Materialen).
    1. Installeer de collectie buizen in de houder. Open het soort blok deur. In het venster "Side Stream", schakel de spanning vervolgens selecteer "Test soort "en klik op de aanzuiger lade knop om de lade te openen en hebben toegang tot de collectie buizen.
    2. Optimaliseer de kant stromen, zodat zij in het midden van de buis. Waarden en sliders aanpassen als dat nodig is.
    3. Sluit het soort blok deur en zorg ervoor dat de meetklokje aan te passen aan de helderste kraal plek in het centrum te krijgen. Unselect afval lade, testen sorteren en spanning. Verwijder de verzamelbuizen.
    4. Optimaliseren van de drop delay volgens de instructies van de fabrikant.
       1. In het kort, schud krachtig kralen flesje en verdun 1 druppel kralen in 0,5 ml PBS.
       2. Met behulp van instructies van de fabrikant, zet de daling vertraging met de Drop Delay experiment sjabloon beschikbaar zijn in de software. U kunt ook de functie Auto Drop Vertraging de daling vertraging instellen.
       3. Laad de buis van fluorescerende kralen en stel het debiet tot de drempel bedraagt ​​~ 3000 tot 4000 events / seconde. Stel het soort precisie "Initial" en de uiteindelijkely naar "Fijnafstemming" in het venster "Sort layout". Selecteer het optische filter en sorteren kralen. Pas de Drop Vertraging tot ~ 100% zijn gesorteerd naar links.
          Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de cellen van belang soort in een zijstroom. De korrels en het optische filter worden gebruikt nabij een 100% druppeltje afwijking te bereiken.
15. Plaats een FSC 1.5 ND (neutrale dichtheid) filter aan de linkerkant van het FSC-detector blok. Stel het venster uitbreiding tot 2,00 microseconden en de FSC Area scaling tot 1,00 (in het tabblad "Laser" in het venster "Cytometer").
16. Voordat u steekproef buis, plaats een steekproef filter lijn van 50 pm aan het einde van het monster lijn om klonteren te voorkomen. Om dit te doen, selecteer "Wijzig Sample Filter" in het menu "Cytometer".
17. Test de samenstelling van het fluïdummonster om een ​​goede scheiding te bereiken zonder fanning tussen zijstroom en te voorkomen dat de cellen te plakken aan de Polypropylene buizen.
    1. Laad de steekproef buis, zet de afbuigplaten en selecteer "Test soort" met de lade gesloten. Kijk naar kant stromen als scheiding gebeurt zonder al te veel waaien.
       Opmerking: Fanning is waarschijnlijk te wijten aan een hoge eiwitconcentratie in het monster buffer.
18. Laad het monster buis in de FACS instrument. Selecteer een monster roeren van 300 opm en een monstertemperatuur van 4 ° C. Selecteer "Data Acquire" in de "Acquisitie Dashboard".
19. Eventueel Verdun het monster met een geschikte incidentie maximaal 5000 events / sec bereikt (met een maximale stroomsnelheid van 3,0). Strikt aan deze grenzen teneinde de zuiverheid van de gesorteerde cellen te behouden.
20. Te analyseren en sorteren van de cellen, het optimaliseren van de FSC drempelwaarde om vuil te verwijderen zonder zich te bemoeien met de bevolking van belang. In logaritmische schaal, stel de spanning van de foto-multiplier tube (PMT) detector met de 530/30-filter om ervoor teervoor dat het fluorescentiesignaal van de totale bevolking past binnen de schaal en de poort van de positieve populatie (Figuur 1, poort 1).
21. Maak een Forward Scatter-gebied (FSC-A) / Side Scatter-gebied (SSC-A) plot van de SYTO16 positieve populatie en pas het FSC-A tot ongeveer 110 V in lineaire schaal, en het SSC-A tot ongeveer 150 V in logaritmische schaal te visualiseren alle gebeurtenissen onder uitsluiting zeer grote cellen en celaggregaten.
22. In de "Sort Layout" venster, zet de "Sort Precision Mode" tot "4-way zuiverheid '(Opbrengst masker: 0, zuiverheid Masker: 32, Phase Mask: 0). Selecteer "Continuous" in het menu "Doel Events" voor continue sorteren.
23. Naar populaties sorteren in het veld die overeenkomt met de buizen (de "sorteren Layout" venster). Plaats populaties met hogere frequenties in het midden en met lagere frequenties aan de uiteinden. Stel de spanning platen tot 2.500 V. Tijdens het sorteren, houden het monster collectie tUbes op ijs.

4. Cell Sorting

1. Onmiddellijk voor het sorteren, filter cellen met behulp van een 50 urn filter in een eerder beklede 5 ml polypropyleen buis met ronde bodem.
2. Was het filter uitgebreid met 1-2 ml van het sorteren buffer.
3. Sorteer vaste kiemcellen met behulp van een 488 nm-laser uitgerust celsorteerder na de gating schema beschreven in figuur 1. Verzamel gezuiverde fracties in 5 ml polypropyleen ronde bodem buizen eerder bekleed in paragraaf 1 op ijs.
   1. Zorg ervoor dat 100-200 gl FBS gehouden in de verzamelbuizen om kleven van de gesorteerde cellen naar de buiswand te voorkomen.
   2. Zorg ervoor dat de concentratie van SYTO16 is verzadigen met fluorescentie schommelingen tijdens het sorteren periode te voorkomen. SYTO16 wordt verzadigen wanneer er geen verdere variatie van cel kleuring intensiteit bij de Alexa Fluor 488 parameter (DNA-kleuring) in het sorteercentrum graphics. Indien nodig, voeg 1 plSYTO16 naar de sorteerruimte buis verzadiging te bereiken.
   3. Geef het totale events een grafische weergave van de volgende parameters: aantal gebeurtenissen vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Selecteer de positieve DNA kleuring cellen met Gate 1, zie figuur 1.
      1. Weergave cellen van poort 1 op een afbeelding met behulp van SSC-A vs FSC-A als parameters
         1. Selecteer de cellen met poort 2, zoals getoond in figuur 1.
         2. Weergave cellen van Gate 2 op een grafische met FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als parameters.
         3. Selecteer cellen met Gate 5 en Gate 6 op Gate 2 grafisch, zoals aangetoond in figuur 1.
         4. Weergeven afzonderlijk Gate 5 en Gate 6 op graphics met Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als parameters.
         5. Selecteer spermiogenese stappen 1-9 spermatiden op de Poort 5 grafische en spermiogenese stappen 10-12 spermatiden op de Poort 6 graphics, zoals getoond in figuur 1.
      2. Beeldschermcellen van poort 1 een grafische behulp FSC-A vs Alexa Fluor 488-A als parameters
         1. Selecteer cellen met Gate 3 en Gate 4, zoals getoond in figuur 1.
         2. Weergeven afzonderlijk Gate 3 en Gate 4 op de graphics met Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A als parameters.
         3. Selecteer spermiogenese stappen 13-14 spermatiden op de Gate 3 grafische en spermiogenese stappen 15-16 spermatiden op de Poort 4 grafisch, zoals getoond in figuur 1.

Resultaten

Gating strategie gebruikt met flowcytometrie

Figuur 1 geeft de gating strategie gebruikt flowcytometrie vier zeer zuiver spermatide populaties sorteren. In het kort, cellen met positieve DNA kleuring (Alexa Fluor 488-A) worden eerst geselecteerd met Gate 1. Spermatiden van spermiogenese stappen 1-12 worden geselecteerd (Gate 2) op een dot plot die de granulosity (SSC-A) versus grootte (FSC -A) vanaf Gate 1. Ve...

Discussie

Spermatogenese cellen altijd uitdagend om te studeren gezien de complexiteit van de seminiferus epitheel, en het beperkte succes van in vitro kweek. In de loop der jaren vele benaderingen zuiveren kiemcellen van verschillende species ontwikkeld. Sedimentatie technieken met behulp van de zwaartekracht zuiveren met Percoll of runderserumalbumine hellingen bieden meestal een goede opbrengst van intacte kiemcellen, maar gebrek aan een goede definitie tussen sommige celtypen, zoals de meiose tetraploïde cellen en sp...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isoflurane	ABBOT	05260-05	Voor muisanesthesie vóór euthanasie
Fetaal bovien serum	Wisent	90150	Voor buiscoating
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	Voor bereiding sorteerbuffer
HEPES	Sigma	H	Voor bereiding sorteerbuffer
100% Ethanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	Voor celfixatie
SYTO 16	Life Technologies	S7578	DNA-kleuring
5 ml polypropyleen rondbodembuizen	BD Falcon	352063	Verzamelen gesorteerd cellen
15 ml polypropyleen kegelbodembuizen	PROgene	1500
50 ml polypropyleen kegelbodembuizen	PROgene	5000
TEC4 anesthesie verdamper	Ohmeda	1160526	Voor muiseuthanasie
CO2 gastank	Praxair	C799117902	Voor muiseuthanasie
O2 gastank	Praxair	O254130501	Voor muiseuthanasie
Zelfgemaakte muis gaskamer			Voor muiseuthanasie
40 µm Falcon celzeef	Corning Incorporated	352340
50 μm monsterlijnfilters	BD Biosciences	649049
Vortexmixer	Labnet international, inc.	S0200	Voor celfixatie
Dynac centrifuge	Clay Adams	101
Celltrics 50 µm filters	Partec	04-004-2327
488 nm laser-uitgeruste celsorteerder	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescerende Beads	BD Biosciences	345249
Sorteerbuffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS is verhit ingeactiveerd. Maak verse oplossing, 0,22 μm gefilterd en bewaar bij 4°C.