Methodenartikel

Generatie en cultuur van Blood uitgroei endotheelcellen van de humane perifere bloed

20K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53384

⸱

23 december 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol maakt de betrouwbare generatie en karakterisering van endotheliale cellen uit bloeduitgroei (BOEC's) mogelijk vanuit een klein volume volwassen perifeer bloed. BOEC's kunnen worden gebruikt als een surrogaat voor endotheelcellen van patiënten met vasculaire aandoeningen en als een substraat voor de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Samenvatting

Historisch gezien heeft de beperkte beschikbaarheid van primaire endotheelcellen van patiënten met vasculaire aandoeningen het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan endotheeldisfunctie bij deze personen belemmerd. De recente identificatie van bloeduitgroei-endotheelcellen (BOEC's), gegenereerd uit circulerende endotheelprogenitorcellen in volwassen perifeer bloed, kan deze beperking echter omzeilen door een endotheelachtige, primaire celsurrogaat te bieden voor patiëntafgeleide endotheelcellen. Naast hun waarde voor het begrijpen van de endotheelbiologie en ziektemodellering, hebben BOEC's potentiële toepassingen in endotheelceltransplantatietherapieën. Ze zijn ook een geschikt cellulair substraat voor de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) via nucleaire herprogrammering, wat een aantal voordelen biedt ten opzichte van andere celtypen. We beschrijven een methode voor de betrouwbare generatie, cultuur en karakterisering van BOEC's uit volwassen perifeer bloed voor gebruik in deze en andere toepassingen. Deze aanpak (i) maakt de generatie van patiëntspecifieke endotheelcellen mogelijk uit een relatief klein volume volwassen perifeer bloed en (ii) produceert cellen die zeer vergelijkbaar zijn met primaire endotheelcellen in morfologie, celsignalering en genexpressie.

Inleiding

Tot voor kort, de post-natale generatie van nieuwe bloedvaten werd aangenomen dat uitsluitend plaatsvinden door middel van een proces dat bekend staat als de angiogenese, gedefinieerd als de kiemen van nieuwe schepen van de endotheelcellen van reeds bestaande schepen. 1 Dit proces contrast van de vasculogenese of de de novo vorming van bloedvaten van endotheliale voorlopercellen, die werd gedacht dat uitsluitend voor tijdens embryogenese. 2 echter meer recente studies geïdentificeerd en geïsoleerd circulerende endotheliale progenitor cellen (EPC) in het perifere bloed van volwassenen. Deze cellen hebben het vermogen om te differentiëren in rijpe endotheelcellen in kweek en worden verondersteld om aan postnatale vasculogenese. 3,4

Protocollen voor de isolatie en expansie van deze EPC gewoonlijk uit de cultuur van perifere mononucleaire cellen (PBMNCs) in media die endotheliale groeifactoren, waaronder Vascular endotheliale groeifactor (VEGF) en fibroblast groeifactor-2. 5-8 EPC cultures produceren een verscheidenheid van totaal andere celtypen. Initial culturen (<7 dagen) worden gedomineerd door een monocytische celtype, in de literatuur bekend als "vroege" EPC. Ondanks hun naam, deze cellen tot expressie van de monocyt marker CD14, zijn negatief voor de progenitor marker CD34 en de expressie slechts minimale niveaus van de klassieke endotheliale markers CD31 en VEGF receptor 2 (VEGFR2). 5 Vervolg kweek ontstaat een tweede populatie van cellen, bekend als late uitgroei EPC of bloed uitgroei endotheelcellen (BOECs), die zo discreet kolonies van endotheel-achtige cellen verschijnen. In tegenstelling tot de monocytische vroege EPC, BOECs, die ook zijn genoemd endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs), uitgroei endotheelcellen of late-uitgroei endotheelcellen, vertonen geplaveide morfologie die kenmerkend is voor endotheliale monolagen en zijn zeer vergelijkbaar in oppervlaktemerker5 en genexpressie 9 endotheelcellen rijpen.

Het genereren van endotheel-achtige cellen uit perifeer bloed biedt verschillende voordelen, in het bijzonder voor de studie van het endotheel dysfunctie geassocieerd met vasculaire aandoeningen zoals pulmonaire arteriële hypertensie (PAH) 10 of von Willebrand ziekte. 11 Vóór de beschikbaarheid van BOECs, endotheliale cellen kunnen slechts worden afgeleid uit geëxplanteerde organen op het moment van overlijden of orgaantransplantatie, of geïsoleerd uit de navelstrengader bij geboorte. Deze verminderde beschikbaarheid vertegenwoordigde een ernstige beperking voor het begrip van de biologie van endotheliale cellen van patiënten met cardiovasculaire aandoeningen, evenals de interacties tussen endotheliale cellen en hetzij bloedcellen of mural cellen. Verder isoleren en kweken van een zuivere populatie van endotheelcellen uit deze bronnen is technisch uitdagend en de cellen verkregen door deze werkwijzen vertonen slechts limited proliferatieve capaciteit. BOECs bieden een waardevol surrogaat voor de isolatie en kweek van patiënt afgeleide primaire endotheelcellen.

Naast hun toepassing in vitro, BOECs mogelijkerwijs bruikbaar bij autologe celtransplantatie therapieën. Deze toepassingen omvatten zowel endotheliale celtransplantatie neovascularisatie (zie 12 en referenties daarin) bevorderen, alsmede het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). 13 BOEC-afgeleide iPSCs kan worden gebruikt voor ziektemodel en hebben een enorm potentieel als uitgangspunt materiaal voor autologe celtherapie. BOECs herprogrammeren sneller en met een hoger rendement dan huidfibroblasten. Verder BOECs ook mogelijk voor het genereren van iPSCs die zonder karyotypische afwijkingen, die een essentieel kenmerk van elke techniek die geschikt is voor translationele toepassingen zal zijn. De mogelijkheid om iPSCs van een patiënt bloedmonster opwekkenlso elimineert de noodzaak van een huidbiopsie en het genereren van huidfibroblasten, waardoor de vorming van cellen vergemakkelijken van patiënten met wondgenezing stoornissen, of de zeer jonge.

Het protocol hieronder beschreven, goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Research Ethics Service Committee (oost), biedt een eenvoudige en betrouwbare methode voor het genereren van BOECs met meer dan 90% rendement van een relatief klein volume (60 ml) van perifeer bloed. Deze cellen zijn zeer proliferatieve en kan herhaaldelijk worden gepasseerd, waardoor het genereren van honderden miljoenen cellen uit een enkel bloedmonster.

Protocol

Een schema van de BOEC generatie protocol wordt getoond in figuur 1.

1. bloedafname en dichtheidsgradiëntcentrifugatie

  1. Voor elke donor, voeg 3 ml natriumcitraat aan elk van twee 50 ml conische centrifugebuizen. Verzamel 60 ml bloed door venapunctie en voeg 30 ml aan elke buis. Omkeren zachtjes 2-3 keer om te mengen. Met slechts 40 ml bloed in het protocol, met citraat volumes aangepast.
    LET OP: Het is essentieel dat bloedmonsters worden verwerkt binnen 2 uur van de collectie. Vertraagde verwerking van het bloed leidt tot een duidelijke vermindering van de uitgroei kolonie opbrengst.
  2. Bereid nieuwe conische buisjes met dichtheidsgradiëntcentrifugatie medium door eerst het omkeren van de fles een paar keer om te mengen. In een steriele kap, voeg 15 ml van dichtheidsgradiënt centrifugatie drager per 50 ml conische buis (1 tube per 10 ml bloed, 6 tubes per donor).
  3. Verdunnen het bloed 1: 1 met Dulbecco's fosfaat-Buffered Zoutoplossing (DPBS). Tilt de buis met de dichtheidsgradiënt centrifugatie medium tot een hoek van 20 ° maakt met het werkoppervlak. Met behulp van een pipet hulp en een 25 ml serologische pipet langzaam laag 21 ml verdund bloed op de top van het medium door het geleidelijk toevoegen van het bloed langs de wand van de gekantelde buis.
    OPMERKING: Hierdoor zal mengen van het bloed met de dichtheidsgradiënt laag minimaliseren en een strakkere buffy coat, evenals een verhoogde opbrengst te produceren.
  4. Centrifugeer monsters bij 400 xg gedurende 35 min bij kamertemperatuur met het gaspedaal en de rem uitgeschakeld.
  5. Gedurende deze centrifugatie periode begint de collageenbekleding beschreven in stappen 2,1 - 2,4. Zorgen dat deze stappen zijn alvorens tot stap 3.1 is voltooid.

2. Collageen Coating van T-75 kolf en Voorbereiding van Cultuur Medium

OPMERKING: Voer de volgende stappen in een celkweek kap.

  1. Bereid een 50 ug / ml collageen oplossing door verdunnen voorraad Type I collageen in 10 ml 0,02M azijnzuur Voorbeeld:. stock voor collageen in een concentratie van 4,05 mg / ml, 123,5 ul collageen 10 ml 0,02 M azijnzuur. Filtreer steriel collageensuspensie vóór gebruik.
  2. Met behulp van een serologische pipet 7,5 ml collageenoplossing een T-75 kolf celkweek. Dit volume geeft 5 ug collageen / cm2 (of 375 ug / fles). Coat kolf gedurende 1 uur bij KT.
  3. Bereid het endotheel groeimedium voor BOEC genereren door aanvulling endotheliale basaal medium met groeifactor aanvullingen van de fabrikant. Voeg alle supplementen, maar het serum niet toe. Ter voorbereiding 15 ml BOEC generatie medium, voeg 2,5 ml gedefinieerd foetaal runderserum (FBS) aan 12,5 ml van endotheliale groei medium dat de groeifactor supplementen.
  4. Ga verder met de stappen in hoofdstuk 3. Na de 1 uur coating periode, zuigen de collageen-oplossing en was achtergebleven azijnzuur verwijderd door pipetterenin 10 ml DPBS. Zuig uit de DPBS en herhaal deze wasstap eens te meer. Als de cel suspensie verkregen bij stap 3,3 niet klaar is voor uitplaten op dit moment, voeg 5 ml BOEC generatie medium aan de kolf met het collageenbekleding van uitdroging houden.

3. Verzameling en Plating van PBMNCs

  1. Na de dichtheidsgradiënt centrifugatie beschreven in stap 1,4, zorgvuldig verzamelen bufferlaag met een steriele plastic overdracht pipet. Het verzamelen van de bufferlaag moet ongeveer 20 ml celsuspensie en plasma verkregen uit elke buis. Vermijden dat de dichtheidsgradiënt medium.
  2. Verdun de mononucleaire celsuspensie 1: 1 in DPBS en zwenken om te mengen. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min bij 300 xg met rem en gaspedaal maximaal.
  3. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer cellen door toevoeging van 1 ml BOEC generatie medium aan elk pellet en pipetteren en herhaaldelijk neer. Pool Celsuspensies eend bijvullen totale volume tot 10 ml met het resterende medium.
  4. Een schatting van het totale aantal cellen, monster 10 ul van celsuspensie krijgen en verdun 50x met 490 ul van Turk's oplossing, die rode bloedcellen lyseren. Graaf een 10 ui monster van de verdunde celsuspensie met een hemocytometer.
    OPMERKING: 60 ml van het bloed moet ongeveer 100-150 x 10 6 witte bloedcellen opleveren voor plating.
  5. Plate gehele celsuspensie in één collageen gecoate T-75 kolf top-up medium volume tot 15 ml / kolf en kweek bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. Cellen uitgeplaat op dit moment vertegenwoordigen passage 0.
    Opmerking: Het is mogelijk om de geïsoleerde PBMNCs vóór BOEC isolatie bevriezen om de BOECs afleiden later, of om de PBMNCs vervoeren naar een ander laboratorium waar de BOECs kan worden gegenereerd. Het is echter belangrijk op te merken dat het bevriezen PBMNCs de efficiëntie van BOEC isolatie kan verminderen. See paragraaf 8 hieronder voor methode.

4. lange termijn Cell Culture

  1. Veranderen medium elke 2 dagen door toevoeging van 15 ml vers medium BOEC opwekking (5: 1 mengsel van endotheliale celgroei medium en gedefinieerd FBS). Voor het weekend, kan medium veranderingen worden uitgesteld om de 3 dagen.
    OPMERKING: uitgroei kolonies moet verschijnen tussen de 7 en 14 dagen van de cultuur.
  2. Controleer de BOEC kolf op dagen 7-14 voor het verschijnen van kolonies uitgroei. Identificeren kolonies als cirkelvormige groepen cellen vertonen een klassieke endotheliale kasseien morfologie.
  3. Zodra een kolonie of meerdere kolonies worden geïdentificeerd in de kolf, verder met medium veranderingen en laat kolonies te groeien tot ongeveer 1000-2000 cellen per kolonie vóór passage. Bepaal het aantal cellen per kolonie door middel van een ruwe visuele schatting.
    Opmerking: Als richtlijn is het gebruikelijk om passage oorspronkelijke uitgroei kolonies één week na de identificatie van het eerste kolonie uitgroei.
  4. Passage cellen door spoelen flesjes tweemaal met 10 ml van DPBS. Voeg 5 ml 1X trypsine-EDTA en incuberen in een 37 ° C incubator gedurende 5 min. Na 5 min, neutraliseren trypsine met 10 ml medium (met FBS) en breng cellen in suspensie bij herhaaldelijk pipetteren.
  5. Centrifugeer suspensie bij 300 xg gedurende 5 min, resuspendeer in 15 ml vers medium BOEC opwekking en plaat gehele celsuspensie in een nieuwe T-75 kolf (die passage 1, P1). Nr collageenbekleding vereist.
  6. Verder medium veranderingen zoals hierboven beschreven totdat de cellen confluent (ongeveer 3-5 x 10 6 cellen per fles). Eenmaal confluent passage cellen zoals beschreven in stap 4.3.
    LET OP: Vanaf passage 2 vanaf, cellen niet meer nodig BOEC generatie middelgrote en kan gekweekt in endotheelcelgroei middelgrote en 10% standaard warmte geïnactiveerd FBS zijn. Collageen coating kan worden gebruikt als optionele stap gaan, omdat er aanwijzingen dat de aanwezigheid van collageen BOEC prolifer kan verbeterenatie tarieven.
  7. Voor verdere passage, plaat niet minder dan 750.000 cellen per T-75 kolf zo laag cel dichtheden kan de BOECs te stoppen uitdijende.

5. invriezen en ontdooien BOEC Culturen

  1. Trypsinize cellen zoals beschreven in paragraaf 4.3 en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer in 10 ml medium. Dit betekent endotheliale celgroei medium vereisen; DMEM met 10% FBS standaard voldoende. Verzamel een 10 ui monster van de celsuspensie om een ​​handmatige celtelling uitvoeren aan hemocytometer.
  2. Centrifugeer opnieuw en resuspendeer in 2x10 6 cellen / ml in ijskoude cryopreservatie medium (40% DMEM met 50% FBS en 10% DMSO). Voeg 0,5 ml (10 6 cellen) aan elk flesje, plaats flesjes in een ijskoude isopropanol cryopreservatie vaartuig en in een -80 ° C vriezer gedurende ten minste 2 uur alvorens naar vloeibare stikstof. Niet-cellen reactie bij -80 ° C gedurende meer dan 24 uur.
  3. Cellen ontdooien, voeg 10 ml voorverwarmd medium om een ​​15 ml conische centrifugebuis.
    OPMERKING: Bij het ontdooien passage 1 cellen ontdooien in endotheliale celgroei medium aangevuld met 20% FBS gedefinieerd voor de eerste 2 dagen na ontdooien. Dit leidt tot een stabielere celisolatie toekomst.
  4. Cellen verwijderen uit vloeibare stikstof en ontdooien in een 37 ° C waterbad onder zacht roeren totdat er slechts een kleine ijskristallen achterblijft in de flacon. Voeg de inhoud van het flesje druppelsgewijs de conische centrifugebuis en spin neer op 300 xg gedurende 5 min.
  5. Zuig supernatant en resuspendeer de cel pellet in 10 ml EGM-2mV + 10% FBS. Toevoegen aan T-75 kolf en vul medium tot 15 ml.

6. Karakterisering van BOECs door flowcytometrie

  1. Zodra de BOEC kolonies in hoofdstuk 4 beschreven zijn toegestaan ​​om uit te breiden, trypsinize cellen zoals beschreven in paragraaf 4.4 en resuspendeer in een concentratie van 10 6 cellen per ml in vlekken buffer (DPBS with 2% FBS en 2 mM EDTA).
  2. Combineer 10 5 cellen met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen gericht tegen CD45, CD14, CD34, CD31 (gebruik allemaal op 1:20 verdunning) of VEGFR2 (verdund 1:10) (zie tabel 1 voor meer informatie). Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker.
  3. Was de cellen met 1 ml kleuring buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 min. Zuig supernatant en resuspendeer in 400 ul vlekken buffer voor analyse. Laat cellen bij 4 ° C en beschermd tegen licht voorafgaand aan de analyse.
  4. Voer cytometrische analyse van een cytometer uitgerust om de fluorescent geconjugeerde antilichamen die in de test te detecteren.
  5. Gebruik een ongekleurde BOEC monster aan de celpopulatie te identificeren op de cytometer door het aanpassen van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing spanningen, alsmede de spanningen voor de FITC en APC kanalen.
  6. Bepaal gating drempels gebruikt isotype gekleurde cellen per fluorochroom. Beoordelen positiviteit voor elke celoppervlak marker op basis van de Presence een piek verschuiving in fluorescentie-intensiteit versus isotype controle voor de fluorochroom geanalyseerd.

7. Karakterisering van BOECs door Immunofluorescente Microscopy

  1. Plate BOECs in een 24-well platte bodem weefselkweekplaat zonder dekglaasjes bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen in 500 gl van endotheliale celgroei medium + 10% warmte geïnactiveerd FBS per putje en laten hechten en groeien 37 ° C, 5% CO 2-cellen tot ten minste 70-80% van het oppervlak van elk putje (raming confluentie door visuele inspectie onder een lichte Microsope).
  2. Was de cellen in elk putje gedurende 5 min met 1 ml van DPBS.
  3. Fix cellen O / N bij 4 ° C met 500 pi 4% paraformaldehyde oplossing in DPBS.
  4. Was de cellen gedurende 3 x 5 minuten met 1 ml per putje DPBS. Toevoegen en verwijderen van de DPBS met behulp van een pipet en een afzuiger, respectievelijk.
  5. Permeabilize cellen gedurende 3 x 10 min met 0,2% polysorbaat 20 in DPBS.
  6. Incubeer cellen gedurende 1 uur bij KT in blokkerende buffer bevattende 10% FBS in DPBS.
  7. Stain cellen bij 4 ° CO / N in 300 gl antilichaamverdunning buffer (0,1% runderserumalbumine in DPBS) met primaire antilichamen gericht tegen CD34 (10 ug / ml), CD144 (1: 300) of vWF (1: 250) . Zie tabel 1 voor de volledige details.
  8. Afwassen ongebonden primaire antilichamen voor 5 x 10 min met DPBS.
  9. Incubeer cellen gedurende 1 uur bij KT met de juiste fluorescent gelabelde secundaire antilichaam, zoals uiteengezet in tabel 1 (alle bij 1: 200).
  10. Afwassen ongebonden secundaire antilichamen voor 5 x 10 min met DPBS.
  11. Incubeer de cellen met 1 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in DPBS gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
  12. Was de cellen met DPBS voor een verdere 3 x 5 min.
  13. Afbeelding cellen bij 100x vergroting met behulp van een omgekeerde microscoop uitgerust met een externe lichtbron voor fluorescentie excitatie en beelden vast te leggen met behulp van een hechtened digitale camera voor verdere analyse offline.

8. invriezen en ontdooien PBMNCs

  1. Aan het einde van fase 3,2 na centrifugeren, zuig het medium handmatig verstoren de celpellet bij herhaaldelijk pipetteren op en neer met een P1000 pipetpunt. Voeg 1 ml van bevriezing medium, 90% serum en 10% DMSO, zorg ervoor om voorzichtig te mengen om een ​​celsuspensie te produceren. Breng de celsuspensie om een ​​cryovial en bevriezen en ontdooien zoals beschreven in hoofdstuk 5.

Resultaten

Isolatie van buffy coat mononucleaire cellen uit 60 ml bloed levert doorgaans 100-150x10 6 totale witte bloedcellen. Als uitgeplaat in één T-75 kolf groot aantal cellen in de niet-gelyseerde celsuspensie bemoeilijkt afzonderlijke hechtende cellen oplossen via helderveld microscopie. Herhaalde medium wijzigingen leveren klaring van niet-hechtende cellen en maken de visualisatie van de hechtende populatie van monocytische "vroege" EPC. Op dag 7, de T-75 ongeveer 7x10 6 van deze langwerpige hechtende cellen bevatten. Vanaf dag 7-14 dient kolonies BOECs verschijnen binnen het vat (Figuur 2A). Kolonies verschijnen eerst 3 tot 5 naburige cellen. Uitgroei kolonieaantal kan variëren van 1 tot 10 kolonies per 60 ml bloed. In het algemeen jongere donoren (dwz, 20-25 jaar oud) hebben de neiging om een groter aantal uitgroei kolonies, die ook eerder in kweek verschijnt produceren.BOECs verspreiden van deze centrale groep cellen om circulaire kolonies bestaande uit enkele honderden cellen vormen. Cellen in deze kolonies vertonen een klassieke endotheliale kasseien morfologie.

Het verdient de voorkeur doorgang oorspronkelijke kolonies wanneer ze ongeveer 1.000 cellen per kolonie bevatten. Uitgroei kolonies meestal deze omvang te bereiken 7 dagen na hun oorspronkelijke uiterlijk in de cultuur. Zodra de oorspronkelijke kolonies worden gepasseerd naar een nieuwe T-75 kolf, moeten zij prolifereren een confluente monolaag (3-5x10 6 cellen per kolf) binnen 5 dagen of minder (figuur 2B) te vormen. In een klein percentage van isolaties (<10%), uitgroei kolonies niet verschijnt, of niet voldoende verspreiden na deze eerste passage stap. BOECs dat lage proliferatie vertonen na hun eerste passage gaan zelden naar een stabiele BOEC isolaties geworden en vaak stoppen prolifererende binnen twee tot drie passages. De monocytischeEBV vroeg vervat in de BOEC culturen niet-proliferatief en worden gewoonlijk verwijderd uit de culturen binnen 1-2 passages. De klaring van deze vroege cellen is te wijten aan celdood, het falen van de eerste cellen opnieuw te hechten na passage en verdunning van de niet-proliferatieve begin EPC herhaalde passage.

Passage 1 cellen kan ofwel verder in de cultuur worden gepasseerd of omlaag voor later gebruik ingevroren. Zodra een stabiele isolatie wordt geproduceerd, kunnen cellen worden gepasseerd met een snelheid van 1 confluente kolf tot 3-5 nieuwe T-75 kolven tot passage 8 of 9 alvorens ruststroom. Ook celdichtheid kritisch gehele cultuur. In onze ervaring, zou niet minder dan 750.000 cellen worden uitgeplaat in een T-75 kolf, lagere celdichtheden kunnen groeistop veroorzaken. Ondanks de hoge proliferatieve potentieel van BOECs cellen moet ook niet worden toegestaan ​​om overconfluent worden (dwz.,> 5x10 6 cellen per fles), omdat dit kan leiden tot convers ion van BOECs een niet-proliferatief fenotype.

Wij stellen voor dat elke cel wordt bestempeld als een BOEC juiste celoppervlak en intracellulaire kleuring moeten geven voor endotheliale markers. Karakterisering van BOECs kan worden bereikt door flowcytometrie (figuur 3) of fluorescentiemicroscopie (figuur 4), na kleuring van normale endotheelcellen markers. BOECs zijn positief voor de endotheliale oppervlakte markers CD31 en VEGFR2 en zijn negatief voor de monocyten marker CD14 en de pan-leukocyten marker CD45. BOECs posess ook Weibel-Palade lichamen en dus uiten Von Willebrand Factor (vWF) als discrete, punctata cytoplasmakleuring. In tegenstelling tot andere volwassen endotheliale celtypes, zoals longslagader of aorta endotheelcellen, BOECs uiten ook de stamvader en activatie marker CD34 op hun oppervlak.

ftp_upload / 53.384 / 53384fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van BOEC generatie protocol. Perifere bloed mononucleaire cellen worden geïsoleerd uit veneus bloed door dichtheidsgradiënt centrifugatie en gekweekt op met collageen beklede platen in endotheel groeimedium dat gedefinieerd FBS. BOEC kolonies verschijnen binnen 7-14 dagen van de cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-1
Figuur 2. Helderveld beelden van representatieve BOEC kweken. (A) uitgroei kolonies verschijnen in kweken tussen dag 7 en 14 koloniën aanwezig als verzamelingen van endotheel-achtige cellen, die zijn gerangschikt in een geplaveide monolaag en prolifereren radiaal vanuit een centraal punt. Rondom de uitgroei kolonies zijn de hechtende monocytic cellen die deel uitmaken van de overgrote meerderheid van de cellen in het begin van culturen. Deze cellen, eerder beschreven als "vroege" endotheliale voorlopercellen, hebben een as-achtige morfologie en drukken de monocytisch marker CD14. (B) Na passage, de zeer proliferatieve BOECs overnemen culturen, zoals de non-proliferatie monocytcellen ofwel sterven af ​​of niet opnieuw te bevestigen na de passage. Schaalbalk 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3. Karakterisering van BOECs door flowcytometrie. BOECs werden getrypsiniseerd en gekleurd met fluorescent-geconjugeerde isotype controle antilichamen (grijs gevuld piek) of antilichamen gericht tegen specifieke oppervlakte markers (rode lijn). Oppervlaktemerkers voor cytometrische karakteriseringomvatten de hematopoietische markers CD45 en CD14, de endotheliale markers CD31 en VEGFR2 en de progentior en endotheliale activering marker CD34. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 4. Immunofluorescente kleuring van BOECs voor endotheelcellen markers. Vertegenwoordiger immunofluorescentie beelden van BOECs immunostained met antilichamen gericht tegen endotheliale celoppervlak marker CD144 (VE-cadherine, rechtsboven paneel) en het bloed glycoproteïne von Willebrand Factor (vWF, rechtsonder paneel) . Overeenkomstige panelen tonen nucleaire DAPI kleuring worden getoond aan de linkerkant. Schaalbalk 50 pm. voor CD144. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.

Discussie

We presenteren een gedetailleerd protocol dat de robuuste en efficiënte afstamming van BOEC's van mononucleaire cellen uit volwassen perifeer bloed (PBMNC's) mogelijk maakt. Ons protocol omvat twee belangrijke verfijningen die vooruitgang vertegenwoordigen ten opzichte van eerdere methoden voor de isolatie van BOEC's.14-16 Dit omvat de afwezigheid van heparine in het initiële PBMNC-kweekmedium en het gebruik van gedefinieerd, embryonaal stamcel-gekwalificeerd serum. Deze laatste verfijning is van bijzonder belang. Embryonaal stamcel (ESC)-gekwalificeerd serum is een meer consistente graad van serum en, hoewel het nog niet bekend is welke component(en) in het serum zijn verrijkt die de isolatie van BOEC's bevorderen, is de impact van dit gedefinieerde serum op de efficiëntie van de BOEC-generatie duidelijk in onze handen. Bovendien hebben we ook succes gehad bij het isoleren van BOEC's met behulp van menselijk serum, waardoor de generatie van BOEC's voor klinische translatie mogelijk wordt. In onze handen resulteert dit verfijnde protocol in de succesvolle isolatie van stabiele BOEC-culturen van meer dan 90% van de donoren, waardoor het een van de meest betrouwbare BOEC-generatiemethoden is die tot nu toe zijn gerapporteerd. Hoewel het gebruik van bepaalde sera cruciaal is voor de generatie van BOEC's, vertegenwoordigt het ook een primaire beperking van het huidige protocol. Toekomstige verbeteringen van de techniek kunnen de generatie van deze cellen in serumvrije, gedefinieerde kweekomstandigheden omvatten.

Kritische stappen in het protocol omvatten het verwerken van bloedmonsters zo snel mogelijk na de verzameling, het volledig oogsten van de buffycoatcellen na dichtheidsgradiëntcentrifugering en het tijdig overbrengen van de initiële kolonies van P0 naar P1. Deze overbrengingsstap is cruciaal voor het vestigen van een stabiele isolatie. Net als andere endotheelcellen lijken BOEC's erg gevoelig te zijn voor de beplantingsdichtheid. Als de beplantingsdichtheid na het overbrengen te laag is, zullen de BOEC's niet prolifereren. Omgekeerd, als de kolonies te overconfluent zijn voordat ze worden overgebracht, zullen de cellen ook stoppen met prolifereren en de neiging hebben om zich om te vormen tot een langwerpige, mesenchymatische celfenotype. Als er weinig kolonies verschijnen tussen dag 7 en 14, of als de kolonies klein zijn, kan het oplossen van problemen het verhogen van de celdichtheid omvatten door P0-kolonies in een T-25 fles over te brengen in plaats van een T-75.

Eenmaal de techniek is beheerst, kunnen de resulterende BOEC's worden gebruikt in verschillende toepassingen, waaronder in vitro studies van de biologie van endotheelcellen, ziektemodellering en medicijnscreening, evenals in vivo celtransplantatietherapieën. Een belangrijke overweging voor de ontwikkeling van elk celtherapieproces is om cellen te gebruiken die vrij zijn van pathogene mutaties. We hebben eerder aangetoond dat BOEC's die zijn geïsoleerd volgens ons protocol genomen bezitten die vrij zijn van copy number variaties en dus representatief zijn voor het individu waaruit ze zijn verzameld. Bovendien hebben we ook aangetoond dat de meerderheid van de BOEC-afgeleide iPSC-lijnen vrij is van copy number variaties.13 Dit contrasteert met eerdere rapporten van copy number variatie in fibroblast-afgeleide iPSC's. Tot op heden blijven deze cellen de enige iPSC's waarvoor deze mate van genomische trouw is gerapporteerd. Deze eigenschap is belangrijk voor het veld van iPSC-biologie en het gebruik van iPSC's in ziektemodellering, medicijnscreening en toekomstige celtransplantatietherapieën.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies gefinancierd door de British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, het Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research, inclusief (i) het BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) het BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust en (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, en ondersteunde het Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO wordt gefinancierd door een BHF Intermediate Fellowship. FNK wordt gefinancierd door een BHF PhD-beurs.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor bloedafname
60 ml spuit met luer-lok tipBD309653
19G Surflo gevleugelde infuussetTerumoSV-19BL
50 ml kegelvormige centrifugebuisStarLabE14502 per donor
NatriumcitraatMartindale Pharmaceuticals270541
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor buffy coat isolatie
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco’s PBS (zonder Ca2+ en Mg2+)Sigma-AldrichD8537
Steriel verpakte plastic transfer pipettenAppleton WoodsKC231
Turk’s SolutionMillipore1.093E+09
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor celcultuur, passageren en bevriezen van cellen
Type 1 Collageen (afkomstig van rattenstaart)BD Biosciences35-4236
Dulbecco’s PBS (zonder Ca2+ en Mg2+)Sigma-AldrichD8537
0,02M Azijnzuur Sigma-AldrichA6283bereide in reagent grade water
Endotheel Groei Medium-2MV
(bevat Bullet Kit, maar geen serum)		LonzaCC-3202Opmerking: Het is essentieel dat het medium geen heparine bevat.  
Gebruik niet EGM-2.
Fetaal Runderserum (VS), GedefinieerdHycloneSH30070
10x Trypsin EDTAGibcoT4174Verdun tot 1x in PBS voor gebruik
Heat Inactivated FBSGibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Mr. Frosty BevriescontainerSigma-AldrichC1562
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor flow cytometrische karakterisering
FITC-geconjugeerd muis anti-mens CD14BD Biosciences555397Muis IgG1k, Clone: WM59
Verdunning: 1:20
FITC-geconjugeerd muis anti-mens CD31BD Biosciences555445Muis IgG1k, Clone: WM59
Verdunning: 1:20
APC-geconjugeerd muis anti-mens CD34BD Biosciences555824Muis IgG1k, Clone: 581/CD34
Verdunning: 1:20
FITC-geconjugeerd muis anti-mens CD45BD Biosciences560976Muis IgG1k, Clone: HI30
Verdunning: 1:20
 APC-geconjugeerd muis anti-mens VEGFR2R&D SystemsFAB357AMuis IgG1, Clone: 89106
Verdunning: 1:10
FITC-geconjugeerd muis IgG1k isotype controleBD Biosciences555748Clone: MOPC-21
Verdunning: 1:20
APC-geconjugeerd muis IgG1k isotype controleBD Biosciences555751Clone: MOPC-21
Verdunning: 1:20
APC-geconjugeerd muis IgG1k isotype controleR&D SystemsIC002A
Verdunning: 1:10		Clone: 11711
EDTA, 0,5M oplossingSigma-AldrichE7889
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Voor immunofluorescente microscopie 
Corning Costar 24-well weefselcultuurplaatSigma-AldrichCLS3527
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
BSASigma-AldrichA7906
Polysorbaat 20Sigma-AldrichP2287
Monoklonaal muis anti-mens CD34 antilichaamR&D SystemsMAB72271Clone 756510, IgG1, gebruik bij 10 μg/ml
Polyklonaal geiten anti-mens VE-cadherin (CD144)R&D SystemsAF938Antigeen affiniteit-gezuiverde IgG, gebruik bij 1:300
Monoklonaal konijn anti-mens Von Willebrand Factor (vWF)Abcamab154193Clone EPSISR15, gebruik bij 1:250
Ezel anti-muis IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaatLife TechnologiesA-21202Polyklonaal, 2 mg/ml, gebruik bij 1:200
Ezel anti-geit IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 488-conjugaatLife TechnologiesA-11055Polyklonaal, 2 mg/ml, 1:200
Ezel anti-konijn IgG (H+L) secundair antilichaam, Alexa Fluor 568-conjugaatLife TechnologiesA-10042Polyklonaal,  2 mg/ml, 1:200
DAPI (4′,6-Diamidino-

Referenties

  1. Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
  2. Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  4. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
  5. Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
  6. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
  8. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334(2014).
  10. Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
  11. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
  12. O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31(2012).
  13. Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
  14. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
  15. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
  16. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van perifeer bloeddichtheidsgradiëntcentrifugatiecollageencoatingkweekmedium voor de generatie van BOECcelkweekprotocolendotheelcelmarkersCD144-immunofluorescentieVon Willebrand-factor kleuringcryopreservatiemethode
Generatie en cultuur van Blood uitgroei endotheelcellen van de humane perifere bloed
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.