Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren

Summary

Lipide polyesters vormen de structurele componenten van twee celwandmodificaties, de plantencuticula en suberine-bevattende diffusiebarriers. In deze video beschrijven we een methode om cutine te depolymeriseren uit volledig ontvette bladeren. De methode kan worden toegepast op het onderzoeken van mutanten die beperkt zijn in de biosynthese van cutine of suberine.

Abstract

Terrestrische planten produceren extracellulaire alifatische biopolyesters die de celwanden van specifieke weefsels wijzigen. Epidermale cellen synthetiseren cutine, een polyester van glycerol en gemodificeerde vetzuren die het raamwerk vormt van de cuticula die luchtplantoppervlakken bedekt. Suberine is een verwante lipide-polyester die wordt afgezet op de celwanden van bepaalde weefsels, inclusief de wortelendodermis en de periderm van knollen, boomschors en wortels. Deze lipidepolymeren zijn zeer variabel in samenstelling tussen plantensoorten en verschillen vaak tussen weefsels binnen een enkele soort. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om de monomeersamenstelling van cutine in Arabidopsis thaliana bladeren te bestuderen door middel van natriummethoxide (NaOMe)-gekatalyseerde depolymerisatie, derivatisering en daaropvolgende gaschromatografie-massaspectrometrie (GC/MS) analyse. Deze methode kan worden gebruikt om de monomeren van onoplosbare polyesters te onderzoeken die zijn geïsoleerd uit volledig ontvette plantweefsels met cutine of suberine. De methode kan niet alleen worden toegepast om de samenstelling van lipidepolymeren te karakteriseren in soorten die niet eerder zijn geanalyseerd, maar ook als analytisch hulpmiddel in voorwaartse en omgekeerde genetische benaderingen om de functie van kandidaatgenen te beoordelen.

Introduction

Vaatplanten afhankelijk extracellulaire lagen die als waterdichte barrières tussen plantenweefsels en de externe omgeving. Deze lipofiele celwand geassocieerde structuren beperken pathogene infectie en regelen het passieve transport van gassen, water en opgeloste stoffen in en uit plantenweefsels ^1. Dergelijke barrières zijn de plant cuticula, een synapomorphic structuur unieke planten ^2, en anders-suberine bevatten diffusiebarrières. De cuticula is een oleofiele laag gesynthetiseerd door epidermale cellen en bonden ze via een pectinaceous laag op de extracellulaire zijde van de celwand ^3-5. Het omhult de primaire antenne organen van hogere planten, functioneren als een essentiële interface tussen plantenweefsels en milieu.

Cutine, de structurele matrix van de cuticula en suberine zijn twee onoplosbaar glycerolipide polyesters geassocieerd met oplosmiddel-uittrekbare wassen ^2,4. Deze polymere lipids bestaan ​​uit verzadigde en onverzadigde vetzuurderivaten en zowel structureel en functioneel vergelijkbaar. Ze zijn echter onderscheiden door karakteristieke verschillen in chemische samenstelling en depositie sites.

Suberine een alifatische polyester zich in de celwanden van bepaalde externe en interne weefsels vormen van een secundaire wand. Suberized weefsels onder periderms van wortels, knollen en boomschors, wortel endodermis, zaadhuid lagen, en genezen wonden ^2. Anders cutine, de suberin polyester bevat typisch alcoholen, verzadigde en mono-onverzadigde dicarbonzuren, en een groot deel van zeer lange keten monomeren (C≥20).

Cutin is het meest voorkomende lipide polyester vaatplanten ⁶ en bestaat uit glycerol en C16-C18 vetzuur veresterde derivaten, zoals hydroxy en hydroxy-gesubstitueerde epoxy-vetzuren ^4. Hoewel de samenstelling van polymeren cutinvarieert in tracheophyte species, de meest overheersende primaire monomeren 10, 16-dihydroxy-16: 0, 18-hydroxy-9,10-epoxy 18: 0 en 9,10,18-tri- 18: 0-vetzuren. Interessant Arabidopsis blad en stengel cutin bestaat hoofdzakelijk uit 18: 2 dicarbonzuur ^7,8.

Plant opperhuid vormen ook een aanzienlijke variabiliteit in dikte variërend van enkele nanometers tot enkele micrometers ^9. Aangezien cuticula isolatie is een moeizame en tijdrovende stap, met name voor zeer dunne leaf cuticles zoals die van Arabidopsis thaliana ⁸ zijn werkwijzen die cuticula isolatie omzeilen ontwikkeld en gevalideerd ^7,8. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de monomeersamenstelling van cutin in Arabidopsis thaliana bladeren van natriummethoxide (NaOMe) gekatalyseerde depolymerisatie en daaropvolgende gaschromatografie / massaspectrometrie (GC / MS) analyse bestuderen. Dit protocol biedt een robuuste methode voor het bepalen van de composition van plantaardige lipiden polyesters geheel ontvette weefsels, en is aangepast van eerder gerapporteerde protocollen ^7,10,11. Hele weefselmonsters zijn eerste gehomogeniseerd en uitputtend gedelipideerd, het verwijderen van solvent-extraheerbare lipiden waaronder cuticulair en epicuticular wassen, membraanlipiden, en triacylglycerolen. Celwand verrijkte resten worden vervolgens gedepolymeriseerd in hun samenstellende methylester monomeren van natrium methoxide-gekatalyseerde methanolyse. Fatty acid methyl esters worden geëxtraheerd na aanzuren, en gederivatiseerd hun overeenkomstige trimethylsilyl of acetyl derivaten te verkrijgen. Gederivatiseerde residuen zijn zeer volatiel en kan worden geëlueerd van een gaschromatografiekolom bij een redelijke temperatuur zonder dat de structurele conformatie in GC / MS-analyse.

Protocol

Opmerking: Dit protocol werd aangepast van Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) ^7,10,11. Stappen 1-5 zijn in figuur 1.

1. Tissue delipidering

Opmerking: Spoel altijd alle glaswerk en petten met chloroform, laten droog onder zuurkast, voor gebruik.

LET OP: Voer weefsel homogenisatie en al oplosmiddel overdracht stappen onder zuurkast; draag altijd laboratoriumjas, handschoenen en splash veiligheidsbril om direct contact met chemische stoffen te voorkomen en om de monsters te beschermen tegen besmetting.

1. Verwarm waterbad en warmte blok naar 85 ° C.
2. Weeg ongeveer 0,5 g van elk blad monster in pre-gewogen 20 mm x 125 mm glazen reageerbuizen met polytetrafluorethyleen (PTFE) -faced schroefdoppen. Bestaan ​​uit vier herhalingen per monster.
3. Plaats 2-propanol in een erlenmeyer (ongeveer 125 ml, 25 ml per g sample). Voeg 2,6-di-tert-butyl-4-methylfenol (ook bekend als gebutyleerd hydroxytolueen, BHT) tot een eindconcentratie van 0,01% (w / v).
   Opmerking: BHT toevoegen van een 5% (w / v) voorraadoplossing in methanol (BHT minimaliseert oxidatie van onverzadigde vetzuren).
4. Verwarm 2-propanol-oplossing tot 85 ° C in een waterbad.
5. Voeg 12 ml hete 2-propanol oplosmiddel om elke monsterbuis en verwarm gedurende 15 min bij 85 ° C in warmteblok. Deze stap inactiveert lipasen die kunnen worden vrijgesteld van cellen verstoord.
6. Laat buizen afkoelen tot kamertemperatuur en maal weefsel grondig met homogenisator totdat een homogene suspensie wordt verkregen.
7. Plaats de monsters in een orbitale schudder en schud gedurende 1-2 uur bij 100 rpm en kamertemperatuur.
8. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g en verwijder het supernatant.
9. Voeg een gelijk volume 2-propanol en schud gedurende 12 uur bij kamertemperatuur geroerd.
10. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g en verwijder het supernatant.
11. Voeg 12 ml CHCl _{3: CH3OH} (2: 1, v / v) tot residu (25 ml per g monster) en schudden gedurende de nacht bij 100 rpm en kamertemperatuur.
12. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g en verwijder het supernatant.
13. Voeg 12 ml _{CHCl3: CH3OH} (1: 2, v / v) tot residu schudden overnacht bij 100 rpm en kamertemperatuur.
14. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g en verwijder het oplosmiddel.
15. Laat monsters drogen onder zuurkast overnacht bij kamertemperatuur.
16. Lucht-droog het residu en plaats in een vacuümexsiccator boven watervrij _CaCl2 of CaSO ₄ tot constant gewicht bereikt (3-5 dagen).

2. Depolymerisatie: methanolyse met natriummethoxide (figuur 2)

LET OP: Voer de stappen 2,3-2,4, 2,7-2,8, 2,10-2,11, 2,13-2,15 en 2,17-2,18 onder zuurkast; draag altijd laboratoriumjas, handschoenen en een splash veiligheidsbril.

1. Verwarm de hitte blok naar 60 ° C.
2. Weeg reageerbuizen met het droge residu (belangrijk voor de verdere berekeningen).
3. Voeg interne standaarden aan elke buis: 25 ωL methyl heptadecanoate (1 mg / ml voorraad) en 25 ul ω-pentadecalacton (1 mg / ml voorraad).
4. Voeg 0,9 ml methylacetaat, 1,5 ml natriummethoxide en 3,6 ml methanol aan elke buis en cap hen. Als alternatief stelt een reactiemengsel met de drie reagentia en voeg 6-ml aliquots aan elk monster.
5. Heat monsters gedurende 2 uur bij 60 ° C en vortex periodiek 15 min intervallen.
6. Laat monsters afkoelen tot kamertemperatuur.
7. Voeg 10 ml methyleen- dichloride (CH ₂ Cl ₂₎ en 1,5 ml ijsazijn aan de vetzuurmethylesters te extraheren.
8. Voeg zoutoplossing (0,5 M NaCl) aan elke buis en cap vullen.
9. Vortex monsters gedurende 1 minuut en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g.
10. Breng de organische fase (lager) tot middelgrote buizen te reinigen (16 x 125 mm reageerbuizen met polytetrafluorethyleen (PTFE) -faced schroefdop).
11. Voeg zoutoplossing (0,5 M NaCl) aan elke buis en cap vullen.
12. Vortex monsters gedurende 1 minuut en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 x g.
13. Verwijder waterige (bovenste) fase en herhaal stappen 2,11-2,12.
14. Verwijder alle waterige (bovenste) fase.
15. Voeg watervrij natriumsulfaat (Na ₂ SO ₄₎ aan het oplosmiddel, cap de buizen en vortex gedurende 1 min; monsters kunnen nu worden gelaten tot de volgende dag. Op dit moment monsters gedurende de nacht onder de afzuigkap worden gelaten.
16. Centrifugeer gedurende 2 min bij 800 xg om de Na ₂ SO ₄ zout in de bodem verdichten.
17. Breng de organische fase naar een klein glazen wegwerp buis (13 x 100 mm glazen reageerbuizen met polytetrafluorethyleen (PTFE) -faced schroefdop).
18. Damp het oplosmiddel tot droog onder stikstof en verder met de derivatiseringsstap. Indien niet onmiddellijk verwerkt, opslag ingedampt monsters bij -20 ° C (monsters kan eenLSO opgeslagen voordat de verdamping stap).

3. Voorbereiding van derivaten voor gaschromatografie

LET OP: Voer stap 3.1.2 en 3.1.5 - 3.1.8 onder een zuurkast; draag altijd laboratoriumjas, handschoenen en een splash veiligheidsbril.

1. Trimethylsilyl derivaten
   1. Verwarm de hitte blok tot 100 ° C.
   2. Voeg 100 gl pyridine en 100 pl BSTFA (N, O-bis-trimethylsilyl trifluoroacetamide) aan elke buis en cap hen.
   3. Warmte monsters bij 100 ° C gedurende 10 min.
   4. Laat monsters afkoelen tot kamertemperatuur.
   5. Damp monsters onder stikstof bij kamertemperatuur. Voorkomen van warmte aan monsters monomeren zijn zeer volatiel in dit stadium.
   6. Voeg 500 ul van 1: 1 (v / v) heptaan: tolueen.
   7. Vortex monsters gedurende 1 minuut en centrifugeer gedurende 2 min bij 800 x g.
   8. Samples toevoegen aan GC flacons en ga naar GC / MS analyse.
2. Acetylderivaten
   Opmerking: acetylering, als volgt (niet in video getoond) passen stappen 3.1.1-3.1.3 hierboven; stappen 3.1.4-3.1.8 zijn hetzelfde:
   1. Verwarm de hitte blok naar 60 ° C.
   2. Voeg 100 gl pyridine en 100 pi azijnzuuranhydride (Ac ₂ O) aan de buizen.
   3. Heat monsters 1 uur bij 60 ° C.

4. GC / MS-analyse

1. Gebruik een HP-5 capillaire kolom (30 mx 0,25 mm x 0,25 pm laagdikte) of gelijkwaardig (dwz., 5% difenyl, 95% dimethylpolysiloxaan). Programmeer de GC met helium gasstroom ingesteld op 1,5 ml / min en de oventemperatuur geprogrammeerd vanaf 150 tot 300 ° C bij 3 ° C / min.
2. Gebruik split injectie (split verhouding 01:10) en stel massaspectrometer de modus scannen via 40-600 amu (electron effect ionisatie).
3. Maak een reeks tafel waaronder oplosmiddel (blanco), WT en mutant herhalingen, die elk met behulp van de aangegeven cutine analysemethode.
4. Load oplosmiddelen Monsterflesjes op de carrousel, voeg hexaan tot injectiespuit spoelen flacons in de autosampler indien nodig, en start de sequentie. Nadat de sequentie is voltooid, totaal ionenchromatogram sporen voor alle monsters.

5. Data Analysis

1. Identificeren lipide polyester monomeren door elke piek van de massa spectrum aan gepubliceerde massaspectra vergelijken of door te zoeken een commerciële bibliotheek indien beschikbaar.
2. Voor elk geïdentificeerd piek in de totale ionenstroom chromatogram, gebruik maken van hun respectieve retentietijden om de gebieden op de integratie van de resultaten tabel van de GC / MS-software (Aanvullende Figuur 1) te vinden.
3. Voor elk monomeer (kolommen AB), voeg het gebied waarden gevonden in de integratie tabel (Hulp Figuur 1, kolom D) aan de corresponderende kolom voor elke repliceren monster in de Excel tabel monomeren (Hulp File 2, kolommen CF), die een spreadsheet aan Arabidopsis kwantificerencutine TMSi derivaten. Gebruik Aanvullende File 3 als geacetyleerde derivaten in plaats daarvan worden bereid.
4. Voeg de aspecten van de interne standaard (IS) aan de IS kolommen (HK). Voor de monomeren die niet zijn gederivatiseerd, namelijk vetzuurmethylesters (FAME) en dicarbonzuur dimethylesters (DCA DMEs), gebruikt 17: 0 FAME (IS1) als IS voor kwantificering (paars-grijze cellen in het monomeer tabel; Aanvullende bestanden 2/3). Voor gehydroxyleerde monomeren, met inbegrip van primaire alcoholen, ferulinezuur en ω-hydroxy zuren, gebruiken 15: 0 15-hydroxy FAME (IS2) als IS van de keuze voor verbinding kwantificering (groen-shadded cellen in het monomeer tabel; Aanvullende Files 2/3) .
5. Voeg droog blad gewicht voor elke repliceren naar kolommen AX-BA (Aanvullende File 2) of AQ-AT (Aanvullende File 3); alternatief, scannen bladeren om oppervlakten te berekenen en toe te voegen gebied waarden aan de monomeer tafel om monomeer ladingen per eenheid uit te drukkenoppervlakte.

Results

De in dit manuscript beschreven protocol is ingesteld op lipide polyester monomeren bepalen, het minimaliseren van de bijdrage van niet-cutin lipiden ¹⁰ Figuur 1 geeft een overzicht van de assay, die in totaal duurt 8 (dwz cutin of suberin.) -. 10 dagen (van initiële weefsel oogsten te verkrijgen GC gegevens), afhankelijk van hoe lang monsters drogen.

De geselecteerde base gekatalyseerde methanolyse (figuur 2) gebruikt om polyesters te depolymeriseren is eerder gevalideerd voor Arabidopsis zaden, die zowel cutin en suberine bevatten. Weefsels worden eerst gehomogeniseerd en uitputtend gedelipideerd om oplosmiddel-extraheerbare lipiden te verwijderen. Het residu opbrengst na extractie, als percentage van het oorspronkelijke vers gewicht, is meestal 6% voor A. thaliana Col-0 bladeren. Celwand verrijkte residu gedroogd in een vacuümexsiccator en vervolgens gedepolymeriseerd in hun samenstellende methylester monomeren doorbase-gekatalyseerde transmethyleringsmetabolisme. Twee uur incubatie werd gekozen als de kritische tijd vereist voor correcte depolymerisatie en terugwinning van lipide componenten polyester. Langere incubatietijden resulteerde in toename van 2-hydroxyzuren; deze potentieel afkomstig van vlies sfingolipiden ^10.

Een chromatogram als wildtype Arabidopsis leaf cutin wordt getoond in figuur 3, voor O -TMSi etherderivaten (figuur 3A) en O-acetyl derivaten (figuur 3B). Elke piek werd geïdentificeerd door vergelijking met massaspectra uit de literatuur ^7,8 en een openbare database ¹² .Onze video protocol laat zien hoe TMSi derivaten te bereiden, maar monsters kunnen ook worden geacetyleerd om hydroxylgroepen derivatiseren. Gesilyleerde derivaten zijn goed voor identificatiedoeleinden omdat ze diagnostische massaspectra. Echter, geacetyleerde derivaten stabieler en een goed alternatief voor silyleringmonomeren eenmaal zijn geïdentificeerd ^10. Om de uitvoering van dit protocol in laboratoria die alleen hebben GC gekoppeld aan vlamionisatiedetector (FID), GC / FID sporen die overeenkomt met geacetyleerde derivaten van WT blad cutin monomeren en een homoloog reeks vetzuurmethylester normen worden ook getoond (Aanvullende figuur 4).

Deze methode is de kwalitatieve en kwantitatieve verschillen tussen de monsters, vandaar de waarde mutant analyse detecteert. De bedragen van de individuele monomeren worden bepaald met behulp van de interne standaard methode van kwantificering, waardoor vergelijkingen van monomeer overvloed tussen de monsters. Het moet duidelijk echter dat de piekgrootte (totaal ion tellingen) niet kunnen weerspiegelen molverhoudingen van de monomeren in het polyester. We zijn inclusief bewerkbare tabellen van monomeren monomeer bedragen in Arabidopsis blad cutine berekenen vetzuurmethylesters en TMSi derivaten (Aanvullende File 1), of aas Tyl derivaten (Aanvullende File 2) van alcoholen. Deze tabellen kunnen moeten worden aangepast wanneer monsters worden geëxtraheerd uit verschillende organen of plantensoorten.

Als voorbeeld hebben we onderzocht Arabidopsis thalia na Columbia (Col-0) wildtype bladeren en twee eerder gekarakteriseerde null-mutant allelen van de CYP86A2 / ATT1 gen att1-1 (m-1) en att1-2 (m-2 ) ^13,14. Cytochroom P450 monooxygenases van de CYP86A onderfamilie coderen vermeende ω-oxydases en neem deel aan suberine en cutin monomeer biosynthese. Onze resultaten (Figuur 4) tonen een significante reductie van de ladingen van drie grote lipide monomeren in de mutant bladeren in vergelijking met WT bladeren. In overeenstemming met voorspelde functie van enzymen, 16: 0, 18: 2 en 18: 1 dicarboxylaten werden specifiek aangetast ATT1 mutanten.

"Src =" / files / ftp_upload / 53.386 / 53386fig1.jpg "/>
Figuur 1. Overzicht van lipide polyester analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Mechanisme van de NaOMe-gekatalyseerde transmethylering reactie. De nucleofiele anionen methoxide vallen de cabonyl koolstof van lipide polyesters een onstabiel tetraëdrische tussenproduct (A), dat gemakkelijk uiteenvalt in vetzuurmethylesters en anionen alkoxide (B) te vormen. Deze alkoxiden zijn conjugaat bases, en reageren met methanol, het regenereren van de katalytisch actieve methoxide anionen, waardoor extra depolymerisatie reacties (C) het behoud. Als water aanwezig is in hetsysteem, zal het reageren met natriummethoxide tot natriumhydroxide, een sterke base die onomkeerbaar gehydrolyseerd esters ongewenste vrije vetzuren te produceren te vormen. Methylacetaat wordt toegevoegd als een co-oplosmiddel ^{15 tot} kleine hoeveelheden natriumhydroxide binnen het systeem (D) te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Vertegenwoordiger totaal ionenchromatogram van wild-type Arabidopsis thaliana blad cutine monomeren. (A) O trimethylsilyl (TMSi) ether en (B) acetaat hydroxyl-derivaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Cutin monomeersamenstelling van Arabidopsis thaliana WT en twee nul mutant allelen van de CYP86A2-gen. (Mutant-1 = att1-1, mutant-2 = att1-2) Foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde (n = 4) . Aangepast van ^13, met toestemming van © Blackwell Publishing (2007). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1. Peak integratie resultaten tabel van de GC / MS-software. Pieken die overeenkomen met die monomeren en interne standaarden worden geïdentificeerd door hun retenti op tijd (kolom C) en het gebied waarden zijn in tabelvorm in kolom D. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende File 2. Tabel van Arabidopsis cutine monomeren (trimethylsilyletherderivaten van hydroxy vetzuurmethylesters). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende File 3. Tabel van Arabidopsis cutine monomeren (O-acetyl derivaten van hydroxy vetzuurmethylesters).com / files / ftp_upload / 53.386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "target =" _ blank "> Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4. GC / FID sporen (AB) vetzure methylester (FAME) retentie-index standaarden (pieken worden aangeduid met elkaar verzadigde FAME ketenlengte); en (C) geacetyleerd A. WT blad thaliana cutine monomeren. Aantallen op peak toegekend: 16: 0 FAME (1), ferulate (2), 18: 3 FAME (3), 18: 18/01: 2 FAME (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ) 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-DIOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dicarbonzuurdimethylester; FAME: fatty acid methyl ester; IS1: interne standaard 1, 17: 0 FAME; IS2: interne stAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In tegenstelling tot andere biopolymeren zoals DNA en proteïnen, worden plantaardige lipiden polyesters niet via een template. In plaats daarvan, de samenstellingen afhankelijk van de specificiteit van de in de weefsels die deze extracellulaire polymeren maken enzymen. Als zodanig, chemische analyses van de samenstellende componenten essentieel lipide polyestersamenstelling begrijpen.

Chemische werkwijzen voor splitsen esterbindingen bevatten verzepen, hydrogenolyse, zuur-gekatalyseerde transmethylering en base-gekatalyseerde transmethylering ^2. Elk van hen heeft voordelen en nadelen. Verzeping produceert vrije vetzuren hydroxy zuren die secundaire reacties kunnen ondergaan. Hydrogenolyse met lithiumaluminiumhydride _(LiAlH4) ¹⁶ werd gebruikt voor analyse cutine ^7. Hydrogenolyse vermindert gefunctionaliseerde koolstoffen alcoholen en de oorspronkelijke structuren moeten worden afgeleid door deuteriolysis met lithium aluminium deuteride (LiAlD _4). Denadeel van deze benadering is dat hoge resolutie GC / MS om de mate van deuteriation van de vetzuren polyolen verkregen opdrachten hun structuren te vergelijken. Zuur gekatalyseerde omestering met methanol boortrifluoride _(BF3) is veelvuldig bij cutin en suberine depolymerizations ^8,17,18, maar het reagens beperkt houdbaar en kunnen artefacten vanwege reacties ¹⁵ kant voeren. Methanol zwavelzuur levert ook methylesters van de monomeren, maar met grotere hoeveelheden van 2-hydroxy vetzuren, die vermoedelijk geen echte lipide polyester componenten, in vergelijking met andere methoden ^10.

De NaOMe-gekatalyseerde omestering werkwijze beschreven in dit protocol produceert vetzuurmethylesters die zijn gederivatiseerd door silylering van hydroxylgroepen, die kenmerkend massaspectra voor identificatie of door acetylering meer stabiele derivaten van hydroxylgroepen verschaffen for kwantificering. Een nadeel van deze techniek is dat hydrolyse concurreert met transesterificatie wanneer water aanwezig in de reactie. Water reageert met NaOMe (de katalysator) en produceert NaOH, die op zijn beurt hydrolyseert vetzuurmethylesters aan vrije vetzuren (figuur 2D) werd verkregen. Dit is een ongewenste nevenreactie omdat twee pieken voor elk vetzuur aanwezig zijn: methyl ester en een TMSi esterderivaat, waardoor de analyse bemoeilijkt. Met behulp van watervrije reagentia en het toevoegen methylacetaat als een co-oplosmiddel om te concurreren met verzeping dus cruciaal stappen hydrolyse (figuur 2D) te voorkomen.

Cutine en suberine bevatten tussen 1 en 26% glycerol ^4. Dit zal echter monomeer niet worden gedetecteerd door de in dit protocol beschreven experimentele omstandigheden. Glycerol is sterk hydrofiel en, anders dan vetzure methylester monomeren wordt in het waterige oplosmiddel stappen wassen worden verwijderd. Deze beperking ookpplies andere cutin depolymerisatie werkwijzen, maar glycerol kan worden bepaald in de waterige laag verkregen na omestering onder toepassing van een enzymatische methode. Alternatief kan gekwantificeerd worden met mildere omstandigheden (bijv., 0,05 M NaOMe) zonder verdere extractie met water om alle sporen monomeren, zoals glycerol ^19,20 .Hoewel bruikbaar voor het doel van glycerol kwantificering milde omstandigheden geven meestal onvolledige depolymerisatie van cutin en suberine.

Als een GC gekoppeld met een vlamionisatiedetector (FID) beschikbaar is, kunnen alle replicaten worden geanalyseerd instrument voor kwantitatieve doeleinden, na toppen van een representatief monster zijn geïdentificeerd met GC / MS. Als alternatief kunnen monomeren in het GC / FID sporen worden geïdentificeerd als hun retentie indices zijn bekend. De vlamionisatiedetector heeft bijzonder hoge gevoeligheid en een breed scala van evenredigheid wat essentieel voor het kwantificeren van grote en kleine monsterbestanddelenin enkele runs. Bovendien is robuust en gemakkelijk te onderhouden en te bedienen ^15.

De beschreven protocol zorgt voor een betrouwbare en reproduceerbare isolatie, identificatie en kwantificatie van plantaardige lipiden polyester monomeren, waardoor de chemische karakterisering van mutanten die verschillen in de samenstelling van één of meer lipide polyester monomeren. De procedure is schaalbaar, kan gemakkelijk worden aangepast voor zowel kleine als grote hoeveelheden van verschillende plantaardige materialen, zoals wortels, zaden, bladeren, stengels en bloemen verwerken. Massaspectrumgegevens van lipide polyester monomeren van vele soorten zijn ^{bijvoorbeeld gepubliceerd., 21-26} en vormen waardevolle middelen om onbekende monomeren te identificeren bij de aanpassing van dit protocol om andere weefsels en / of soorten. Deze methode is van toepassing op het onderzoek van de biosynthese, regelgeving, en de verdeling van lipiden polyesters in hogere planten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicaliën
2-propanol	Fisher Scientific	BPA451-4	Solvent voor delipidatie
Watervrij natriumsulfaat	Fisher Scientific	S421500
Azetzuuranhydride	Sigma Aldrich	320102	Derivatiseringsmiddel
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoraceetamide)	Sigma-Aldrich	15222	Derivatiseringsmiddel
Butylhydroxytolueen (BHT)	Sigma-Aldrich	101162	Antioxidant
Calciumchloride, watervrij	Fisher Scientific	C614-3	Droogmiddel
Calciumsulfaat, watervrij (DRIERITE- 8 MESH met indicator)	Acros Organics	219090020	Droogmiddel
Chloroform (Trichloromethaan)	Fisher Scientific	C6074	Organisch oplosmiddel
IJsazijn	Fisher Scientific	BP2401212	Acidificatiemiddel
Helium dragergas, gecomprimeerd	Air Liquide	ALPHAGAZ1-UN1046	Dragergas, GC/MS
Heptaan	Fisher Scientific	H3501	Organisch oplosmiddel
Hexaan	Fisher Scientific	H3024	Organisch oplosmiddel
Methanol	Fisher Scientific	A4124	Organisch oplosmiddel, transmethylering reactief
Methylacetaat	Sigma-Aldrich	296996	Organisch oplosmiddel
Methylheptadecanoaat	Sigma-Aldrich	H4515	Interne standaard (1mg/mL stock)
Methyleen dichloride (Dichloromethaan)	Fisher Scientific	D374	Organisch oplosmiddel
Stikstof, gecomprimeerd	Air Liquide	ALPHAGAZ1-UN1044	Dragergas, GC-FID
Pentadecanolacton	Fluka	76530	Interne standaard (1 mg/ml stock)
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	Co-oplosmiddel voor derivatisering
Natriumchloride	Fisher Scientific	BP358212	Zoutoplossing
Natriummethoxide (25 wt.%)	Sigma-Aldrich	156256	Nucleofiel
Tolueen	FIsher Scientific	T2904	Organisch oplosmiddel
Plantengroei benodigdheden
Pro-Mix PGX	Premier Tech Horticulture Ltd		Pro-Mix PGX wordt aanbevolen om Arabidopsis planten te kweken (Eddy, R. en Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue-methoden voor Arabidopsis-groei.
PermaNest Humidity Dome	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	GD2211-24
Perma-Nest Plant Trays (22x11in)	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	N/A
Vierkante kas potten, 3,5 inch	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	P86
Algemeen doel plantenmest, Plant-Prod 20-20-20	Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON	N/A
Glebaarderij
13 x 100 mm glazen testbuis met Teflon-gecoate schroefdop	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-13100
16 x 125 mm glazen testbuis met Teflon-gecoate schroefdop	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-16125
20 x 125 mm glazen testbuizen met Teflon-gecoate schroefdop	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-20125
GC-vial caps	National Scientific	C400051A
GC-vial micro-inserts	National Scientific	C4011631
GC-vials	National Scientific	C40001
Wegwerp pasteur pipets	Fisher Scientific	1367820B
Kolven	Fisher Scientific
Apparatuur
Allegra X15R centrifuge	Beckman Coulter
Analytische balans	Fisher Scientific
Belly dancer			Een shaker kan voor dit doel worden gebruikt als Belly Dancer niet beschikbaar is
DB-5 capillaire GC-kolom	J&W Scientific, CA, USA;		30 m x 0,25 mm x 0,25 μm filmdikte
Desiccator
Isotemp 202 waterbad	Fisher Scientific
ISQ LT enkele quadupole massaspectrometer	Thermo Scientific
Hitteblok	Fisher Scientific
Stikstofevaporator
Polytron homogenisator	Birkmann
Trace 1300 gaschromatograaf	Thermo Scientific
Twee-traps regelaar	Air Liquide	Q1-318B-580
Vacuum desiccator	Fisher Scientific
Vortexmixer	Fisher Scientific