Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie

Paula Nunes; Daniele Guido; Nicolas Demaurex

doi:10.3791/53402

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie

13.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53402

⸱

7 december 2015

Paula Nunes¹ , Daniele Guido¹ , Nicolas Demaurex¹

¹Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

In dit artikel

Samenvatting

Phagosomale pH beïnvloedt fagosoombeschikking, oxidatiemiddelproductie, fagosomale doding en ook antigeenpresentatie. Hier beschrijven we een ratiometrische methode voor het meten van tijdsverloop en eindpunt-pH-veranderingen in individuele fagosomen in levende fagocyten met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Samenvatting

Fagocytose is een fundamenteel proces waarmee aangeboren immuuncellen overspoelen bacteriën, apoptotische cellen of andere vreemde deeltjes om te doden of neutraliseren ingeslikt materiaal, of het te presenteren als antigenen en start adaptieve immuunreacties. De pH van phagosomes is een kritische parameter reguleren splitsing of fusie met endomembranes en activering van proteolytische enzymen, gebeurtenissen die het mogelijk maken de fagocytische vacuole om te rijpen in een afbrekende organel. Bovendien wordt translocatie van H ⁺ nodig voor de productie van hoge niveaus van reactieve zuurstof species (ROS), die essentieel zijn voor efficiënt doden en signalering naar andere gastheer weefsels. Vele intracellulaire pathogenen ondermijnen fagocytische doden door het beperken van phagosomal verzuring, met de nadruk op het belang van de pH in phagosome biologie. Hier beschrijven we een ratiometrische methode voor het meten phagosomal pH in neutrofielen via fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) -gelabeld zymosan als fagocytische targets, en live-cell imaging. De assay is gebaseerd op het fluorescentie-eigenschappen van FITC dat wordt afgeschrikt door zure pH wanneer geëxciteerd bij 490 nm maar niet wanneer geëxciteerd bij 440 nm, waardoor kwantificatie van een pH-afhankelijke verhouding, in plaats van absolute fluorescentie van een kleurstof. Een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van in situ calibratie kleurstof en omschakeling van verhouding echte pH-waarden is ook voorzien. Single-dye ratiometrische werkwijzen worden in het algemeen beschouwd als superieur voor één golflengte of dual-dye pseudo-ratiometrische protocol, omdat zij minder gevoelig voor storingen zoals bleken, focus verandert, laser variaties en onregelmatige labeling, waarbij het gemeten signaal verstoren. Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan pH in andere fagocytische celsoorten meten en zymosan kan worden vervangen door een andere amine-bevattende deeltjes uit inerte kralen levende micro-organismen. Tenslotte kan deze werkwijze worden aangepast voor toepassing van andere fluorescerende probes die gevoelig zijn voor verschillende pH-bereiken of andere phagosom makenal activiteiten, waardoor het een algemene protocol voor functionele beeldvorming van phagosomes.

Inleiding

Fagocytose, het proces waarbij aangeboren immuuncellen grote deeltjes inslikken, is geëvolueerd uit het eetmechanisme van eencellige organismen en omvat binding aan een doelwit, het omhulsel met een membraan en het afknijpen van het membraan om een vacuole in het cytosol te vormen, een fagosoom genaamd. Terwijl het fagosomale membraan afkomstig is van het plasmamembraan, transformeren actieve eiwit- en lipide-sortering, evenals fusie met endomembranen tijdens fagosoombevorming, het fagosoom in een uniek orgaan binnen de cel met degradatieve eigenschappen die het doden, neutraliseren en afbreken van het ingeslikte materiaal mogelijk maken^1-3. Dit proces, fag....