Methodenartikel

Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie

DOI:

10.3791/53402

⸱

7 december 2015

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phagosomale pH beïnvloedt fagosoombeschikking, oxidatiemiddelproductie, fagosomale doding en ook antigeenpresentatie. Hier beschrijven we een ratiometrische methode voor het meten van tijdsverloop en eindpunt-pH-veranderingen in individuele fagosomen in levende fagocyten met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytose is een fundamenteel proces waarmee aangeboren immuuncellen overspoelen bacteriën, apoptotische cellen of andere vreemde deeltjes om te doden of neutraliseren ingeslikt materiaal, of het te presenteren als antigenen en start adaptieve immuunreacties. De pH van phagosomes is een kritische parameter reguleren splitsing of fusie met endomembranes en activering van proteolytische enzymen, gebeurtenissen die het mogelijk maken de fagocytische vacuole om te rijpen in een afbrekende organel. Bovendien wordt translocatie van H + nodig voor de productie van hoge niveaus van reactieve zuurstof species (ROS), die essentieel zijn voor efficiënt doden en signalering naar andere gastheer weefsels. Vele intracellulaire pathogenen ondermijnen fagocytische doden door het beperken van phagosomal verzuring, met de nadruk op het belang van de pH in phagosome biologie. Hier beschrijven we een ratiometrische methode voor het meten phagosomal pH in neutrofielen via fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) -gelabeld zymosan als fagocytische targets, en live-cell imaging. De assay is gebaseerd op het fluorescentie-eigenschappen van FITC dat wordt afgeschrikt door zure pH wanneer geëxciteerd bij 490 nm maar niet wanneer geëxciteerd bij 440 nm, waardoor kwantificatie van een pH-afhankelijke verhouding, in plaats van absolute fluorescentie van een kleurstof. Een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van in situ calibratie kleurstof en omschakeling van verhouding echte pH-waarden is ook voorzien. Single-dye ratiometrische werkwijzen worden in het algemeen beschouwd als superieur voor één golflengte of dual-dye pseudo-ratiometrische protocol, omdat zij minder gevoelig voor storingen zoals bleken, focus verandert, laser variaties en onregelmatige labeling, waarbij het gemeten signaal verstoren. Deze werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan pH in andere fagocytische celsoorten meten en zymosan kan worden vervangen door een andere amine-bevattende deeltjes uit inerte kralen levende micro-organismen. Tenslotte kan deze werkwijze worden aangepast voor toepassing van andere fluorescerende probes die gevoelig zijn voor verschillende pH-bereiken of andere phagosom makenal activiteiten, waardoor het een algemene protocol voor functionele beeldvorming van phagosomes.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytose, het proces waarbij aangeboren immuuncellen grote deeltjes inslikken, is geëvolueerd uit het eetmechanisme van eencellige organismen en omvat binding aan een doelwit, het omhulsel met een membraan en het afknijpen van het membraan om een vacuole in het cytosol te vormen, een fagosoom genaamd. Terwijl het fagosomale membraan afkomstig is van het plasmamembraan, transformeren actieve eiwit- en lipide-sortering, evenals fusie met endomembranen tijdens fagosoombevorming, het fagosoom in een uniek orgaan binnen de cel met degradatieve eigenschappen die het doden, neutraliseren en afbreken van het ingeslikte materiaal mogelijk maken1-3. Dit proces, fagosomale rijping genaamd, is afhankelijk van de levering van een groot aantal proteolytische en microbicidaal actieve enzymen, waaronder de nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH) oxidase die elektronen overbrengt naar fagosomen en daarbij de sterke oxidant O2- en zijn afgeleide reactieve zuurstofsoorten (ROS) produceert 2,4.

De luminale pH van fagosomen heeft een diepgaande invloed op verschillende gebeurtenissen die noodzakelijk zijn voor fagosoombewerking. Ten eerste beïnvloedt de pH het verkeer van endomembranen in het algemeen, aangezien pH-afhankelijke conformationele veranderingen van transmembraan verkeersregulatoren de rekrutering van verkeersdeterminanten zoals Arfs, Rabs en vesiculaire coat-eiwitten veranderen, die op hun beurt bepalen welke vesicles met fagosomen kunnen fuseren 5-8. Ten tweede wordt de ionische samenstelling van het fagosomaal lumen ook getransformeerd naarmate fagosomen rijpen, en sommige ionentransporters, zoals de Na+/H+ uitwisselingskanaal of ClC-familie Cl-/H+ antiporters, die de fagocytische functie bevorderen, zijn afhankelijk van H+ translocatie 9,10. Evenzo is ROS-productie nauw verbonden met de fagosomale pH. ROS en zijn toxische oxidatieve bijproducten worden al lang erkend als cruciaal voor fagosomale killing in neutrofielen 4,11,12 en zijn aangetoond een kritische rol te spelen in andere fagocyten, inclusief macrofagen, dendritische cellen (DC's) en amoebe 13-16. De NADPH oxidase is een elektrogisch enzym dat H+ in het cytosol vrijgeeft terwijl NADPH wordt geconsumeerd, en dat de gelijktijdige overdracht van H+ vereist door begeleidende HVCN1-kanalen naast de getransporteerde elektronen in het fagosomaal lumen, om de enorme depolarisatie te verlichten die anders zou leiden tot zelfinhibitie van het enzym 17-21. Ten slotte hebben verschillende proteolytische enzymen een optimale activiteit bij verschillende pH, zodat tijdsafhankelijke fagosomale pH-veranderingen van invloed kunnen zijn op welke enzymen actief zijn en wanneer. De belangrijkheid van de fagosomale pH wordt benadrukt door organismen zoals Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis en Salmonella typherium die de fagocytische killing ten minste gedeeltelijk onderbreken door de fagosomale pH te veranderen 22-24.

Bij zoogdieren zijn de belangrijkste fagocyten neutrofielen, macrofagen en dendritische cellen, en afhankelijk van het celtype kunnen tijdsafhankelijke fagosomale pH-veranderingen sterk variëren en verschillende rollen lijken te spelen. In macrofagen is een sterke en snelle acidificatie, gemedieerd door de ATP-afhankelijke protonenpomp vacuolaire ATPase (V-ATPase), een van de belangrijkste factoren die killing mediëren 25-27, vergelijkbaar met de mechanismen die aanwezig zijn in amoebe die fagocytose als eetmechanisme gebruiken 28. In deze cellen wordt gedacht dat activering van zure proteasen een sleutelrol speelt. In tegenstelling daarmee vertrouwen neutrofielen meer op ROS en HOCl geproduceerd door myeloperoxidase (MPO)11, en blijft de pH neutraal of alkalisch gedurende de eerste 30 minuten, alleen later zuur wordend 29,30. Het is gesuggereerd dat een neutrale pH de activiteit van oxidatieve proteasen zoals bepaalde cathepsinen bevordert. Bij DC's is de fagosomale pH controversieel, waarbij sommigen acidificatie rapporteren en anderen neutrale of alkalische pH 31,32, maar ROS en pH kunnen de mogelijkheid van deze cellen om antigenen aan T-cellen te presenteren, een van hun hoofdfuncties, diepgaand beïnvloeden 33.

Belangrijk is dat hormonen, chemokinen en cytokinen signaalgebeurtenissen kunnen veroorzaken die rijping en veranderingen in fagocytgedrag induceren en op hun beurt de fagosomale pH beïnvloeden 34,35. Evenzo kunnen geneesmiddelen, bijvoorbeeld het antimalariamiddel chloroquine, dat ook wordt overwogen voor antikankertherapieën 36, de fagosomale pH en daarmee immuunresultaten beïnvloeden. Daarom kunnen een verscheidenheid aan celbiologen, immunologen, microbiologen en geneesmiddelontwikkelaars geïnteresseerd zijn in het meten van fagosomale pH bij het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de effecten van een specifieke genetische verstoring, bioactief verbinding of micro-organisme op aangeboren en adaptieve immuunresponsen.

Hier beschrijven we een methode voor het meten van fagosomale pH in neutrofielen die ons in staat stelde de belangrijkheid van het HVCN1-kanaal in het reguleren van de fagosomale pH van neutrofielen te tonen 19. De methode is gebaseerd op de ratiometrische eigenschap van fluoresceïne isothiocyanaatje (FITC) waarvan de fluorescentie-emissie bij 535 nm pH-gevoelig is wanneer geëxciteerd bij 490 nm maar niet bij 440 nm 37. Wanneer deze kleurstof chemisch gekoppeld is aan een doelwit, in dit geval zymosan, kan deze worden gevolgd met behulp van brede veldfluorescentiemicroscopie, waarbij cellen worden afgebeeld terwijl ze fagocyteren, en fagosomale pH-veranderingen worden gemeten in realtime terwijl het

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: Alle dierlijke manipulaties werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Research Committee van de Universiteit van Genève.

1. Voorbereiding van Fagocytische Doelen

  1. Voeg 20 mg gedroogd zymosan tot 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vortex en warmte in een kokend waterbad gedurende 10 min. Koel en centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 min.
  2. Verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml PBS en ultrasone trillingen gedurende 10 min in een waterbad ultrasoonapparaat. Breng 500 pi van twee 1,5 ml buizen. Centrifugeer bij 11.000 g gedurende 5 min.
  3. Herhaal het wassen met 500 pi PBS. De gekookte zymosan worden in porties verdeeld, ingevroren en bewaard bij -20 ° C.
  4. Was zymosan tweemaal in 500 pl vers bereide 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 zoals hierboven (stap 1,2).
  5. Resuspendeer in 490 ul na de laatste wasbeurt. Voeg 10 ul van 10 mg / ml FITC opgelost in dimethyl sulfoxide (DMSO), vortex, dek af met folie en incubeer onder schudden gedurende 4 uur bij KT.
  6. Ongebonden kleurstof te verwijderen, zoals hierboven beschreven wassen (stap 1,2), eerst met 0,5 ml DMSO + 150 pl PBS, vervolgens 0,5 ml DMSO + 300 pl PBS, vervolgens 0,5 ml DMSO + 450 pl PBS, vervolgens PBS alleen.
  7. Telling zymosan behulp van een hemocytometer. Voeg 1 pl zymosan tot 500 gl PBS, vortex, voeg 10 ul aan de rand van de hemocytometer kamer, waar het de dekglaasje geplaatst over het centrale rooster. Monteer de hemocytometer op een helder-veld microscoop uitgerust met een 20x doelstelling.
  8. Focus op de linker bovenhoek met 16 pleinen en tellen alle zymosan deeltjes in dit gebied met behulp van een hand telapparaat. Herhaal dit met de rechter bovenhoek. Bereken de zymosan concentratie met behulp van de volgende vergelijking: Zymosan concentratie = count / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Gelabelde zymosan worden in porties verdeeld, ingevroren en bewaard bij -20 ° C.
  9. Opsoniseren de gelabelde zymosan with een konijn anti-zymosan antilichaam bij 1: 100 verdunning. Vortex en incubeer 1 uur in een 37 ° C waterbad. Wassen met 500 pi PBS zoals hierboven (stap 1,2).
    Opmerking: Sonicatie wordt sterk aanbevolen, vooral na opsonisatie, zoals zymosan neiging klonten die later nog moeilijker kan vormen. Opsonisatie met 65% v / v rat of humaan serum kan worden gebruikt als alternatief.
  10. Count zymosan met behulp van een hemocytometer, zoals beschreven in de stappen 1,7-1,8, en verdun tot 100 x 10 6 deeltjes / ml. Opsonisatie met andere fagocytische stimulatoren, zoals complement of geen opsonisatie, kunnen als alternatief worden uitgevoerd.

2. Live Video Microscopie

  1. Isoleer primaire muis neutrofielen zoals in detail beschreven elders 38.
    1. U kunt ook gebruik maken van elke fagocytische celtype. Blijf neutrofielen op ijs in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium aangevuld met 5% foetaal kalfserum (v / v), 200 U penicilline / streptomycin, bij een concentratie van 10 x 10 6 cellen / ml tot aan gebruik. Andere celtypen kunnen 1-4 dagen voor worden gezaaid.
  2. Voeg 2 x 10 5 (20 pl) van neutrofielen naar het midden van een 35 mm glazen bodem schaal verspreid de druppel door toevoeging van 50 pl medium en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten om de cellen te hechten.
  3. Voeg 1 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) verwarmd tot 37 ° C met de specifieke MPO remmer 4-aminobenzoëzuur hydrazide (ABH-4, 10 uM). Niet-specifieke MPO remmers, zoals natriumazide (5 mM), kunnen eveneens worden gebruikt, maar zijn onlangs voorgesteld om bijkomende niet-specifieke effecten op pH 39 uitoefenen.
  4. Monteer de schotel op een groothoek fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 37 ° C verwarmingssysteem en een 40x olie doelstelling. Incubeer cellen zonder beeldvormende gedurende 10 minuten om de cellen en apparatuur in evenwicht.
  5. Pas de microscoop instellingen om een ​​helder-veld transmissie verwerven [PHAse of differentiële interferentie contrast (DIC) indien beschikbaar] bij 440 nm of 490 nm excitatie en 535 nm emissie elke 30 sec.
  6. Pas belichtingstijd en verkrijging frequentie volgens microscoopsysteem teveel fotobleken en fototoxiciteit en afhankelijk van de experimentele vragen die gesteld voorkomen. Begin beeldacquisitie.
  7. Na 2 min, voeg 10 x 10 6 (50 ui) FITC-geopsoniseerd zymosan naar het midden van de schaal. Pas target: cel verhoudingen, afhankelijk van het type fagocyt en doel gebruikt.
  8. Verder beeldvorming voor 30 min. Na 30 minuten stoppen met de time-lapse acquisitie en start een timer. Verplaats het podium en vastleggen 10 of meer foto's in verschillende gebieden van het oog op het andere fagosomen, allemaal binnen 5 min.

3. kalibratie en controle-experimenten

  1. Bereid de pH ijkoplossingen (recepten worden beschreven in tabel 1) voorafgaand aan de dag van het experiment en vries in 10 ml aliquots.Ontdooi de ijkoplossingen en warm tot 37 ° C in een waterbad. Controleer de pH met een pH-meter en noteer de werkelijke pH van oplossingen.
  2. Monteer een peristaltische pomp aan de glazen bodem schaal voorafgaand aan het verwerven en uitvoeren van live video-microscopie, zoals hierboven (punt 2) beschreven.
  3. Aan het eind van de 30 min verwervingsperiode zet de pomp om de oplossing binnen de schaal te verwijderen, voeg 1 ml van de eerste ijkoplossing en stop de pomp.
  4. Wacht tot het signaal stabiliseert, meestal 5 min. Herhaal dit met elke kalibratie oplossing.
    1. Voer tenminste één kalibratie experimentele per dag en kalibreren beginnen met de hoogste pH en werken sequentieel de laagst, en vanaf de laagste pH en na elkaar werken naar de hoogste.
  5. Als controle, voeg 100 ul van 100 uM NADPH oxidase inhibitor difenyl propionium jodide (DPI) verdund in HBSS met cellen in 900 pi HBSS in het glas onderste schaal, enincubeer 10 min.
  6. Start acquisitie en voeg zymosan zoals hierboven (stap 2.7). Na 15 min van fagocytose, voeg 10 ul van 10 uM V-ATPase inhibitor concanamycin A (ConcA) verdund in HBSS en verder imaging gedurende nog 15 min.

4. Analyse

  1. Analyse van de time-lapse filmpjes en phagosome snapshots.
    Opmerking: de volgende instructies zijn specifiek voor ImageJ. Stap-voor-stap instructies sterk kunnen variëren, afhankelijk van de software gebruikt, maar in dit hoofdstuk beschreven functies zijn beschikbaar in de meest professionele software voor beeldanalyse.
    1. Open de beelden met professionele software voor beeldanalyse. Aftrekken van de achtergrond in de 490-kanaal door het tekenen van een klein plein ROI met het kwadraat polygoon selectietool in een gebied waar er geen cellen, en te klikken op Plugins> BG aftrekken van ROI. Upload dan dezelfde ROI op de 440 kanaal door te klikken op Bewerken> Selectie> Herstel Selectie en herhaal.
    2. Maak een 32-bits-verhouding beeld van de 490 kanaal gedeeld door de 440-kanaal door te klikken Process> Afbeelding Calculator ..., de juiste beelden te selecteren in het Image1 en Image2 drop-down menu's, dan kiezen voor 'Divide' in de Operation drop-down menu , en het controleren van het resultaat check-box 32-bit (float).
    3. Verander de kleurcodering look-up tafel met een verhouding-compatibele kleurcodering door te klikken op Afbeelding> Lookup Tables> Rainbow RGB. Image de verhouding drempel tot 0 en oneindigheid pixels te elimineren door te klikken op Afbeelding> Aanpassen> Drempel .... Stel de schuifbalken zodat zymosan verschijnt in rood en klik op Toepassen, zorg ervoor dat de set achtergrond pixels om NaN is ingeschakeld.
    4. Combineer deze verhouding stapel met de heldere-veld kanaal in een multi-channel samengestelde door te klikken op Afbeelding> Kleur> Kanalen samenvoegen, en de heldere-veld afbeelding in de grijze kanaal dropdown menu en de verhouding afbeelding in het groene kanaal dropdown menu te selecteren, en selecteren van deHoud bronafbeeldingen check-box. Scan de time-lapse filmpjes of foto's om te bepalen welke phagosomes worden geanalyseerd. De helder-veld channel nuttig voor.
    5. Trekken regio's van belang (ROI) met de ovale polygoon selectietool rond fagosomen, en voeg ze toe aan de ROI manager door te klikken op Analyseren> Extra> ROI Manager> toevoegen. Meet hun zymosan intensiteitsverhouding door te klikken op Meer> Multi-Measure en de-selecteren van de één rij per slice check-box.
    6. Voor time-lapse filmpjes, spoor phagosomes een voor een door het tekenen van een ROI, het typen van Ctrl + M op elk tijdstip te meten, en het verplaatsen van de ROI wanneer dat nodig is om de intensiteit waarden in de tijd te volgen. Kopieer de metingen uit het raam resultaten in een spreadsheet-software.
      Opmerking: Analyse van 15 (5 tijdsverloop per experiment x 3) onafhankelijke experimenten is ideaal, maar min of meer nodig zijn, afhankelijk van de waargenomen variabiliteit. Opslaan van de ROI wordt altijd aanbevolen. Sommige software pakketten kunt image registratie en dynamische updates van ROI, het vergemakkelijken van dit deel van de analyse.
  2. Conversie van fluorescentie pH-waarden
    1. Meet de 490/440 ratio voor phagosomes in de kalibratie time-lapse filmpjes zoals beschreven in paragraaf 4.1.
    2. In een spreadsheet, trek de ratiowaarden tijd, en bereken de gemiddelde verhouding van alle waarden phagosomes binnen het gezichtsveld (gewoonlijk 5-20) van 5 tijdstippen in het midden van de periode die overeenkomt met elke pH kalibratie oplossing. (Zie ook de rode vakjes in figuur 5A).
    3. Plot deze gemiddeld 490/440 verhouding waarden tegen de werkelijk gemeten pH. Combineer tenminste 3 onafhankelijke kalibraties in één grafiek. Gebruik statistische of numerieke software een lineaire regressie (best passende curve) uitvoeren, meestal een sigmoïdale vergelijking.
      Opmerking: Bijvoorbeeld, in figuur 5B de gebruikte vergelijking is een Boltzmann sigmoïdale [Y = bodem + ((boven-beneden)/ (1 + EXP ((V50-X) / Helling))], waarbij Y waarden zijn de 490/440 ratio's, X zijn de pH-waarden en de Boven, Onder, zijn V50 en de helling parameters berekend door de software.
    4. Met de verkregen vergelijking om verhoudingswaarden transformeren naar pH.
      Opmerking: Bijvoorbeeld, in figuur 5B de vergelijking verkregen voor de ijkcurve in aanwezigheid van natriumazide is 490/440 Ratio = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . Oplossen voor pH geeft de volgende vergelijking: pH = 6,993-,9291 * [LN ((1,178 / (Verhouding-1,103)) - 1))].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende resultaten zijn representatief voor een experiment waarbij de phagosomal pH van primaire muis neutrofielen geïsoleerd uit het beenmerg van wildtype of Hvcn1 - / - muizen werden vergeleken. Voor een succesvolle experiment is het belangrijk om voldoende phagosomes binnen het gezichtsveld te verkrijgen gedurende de gehele duur van de time-lapse film, terwijl het vermijden teveel fagosomen, wat later moeilijker segment in de beeldanalyse wordt. Figuur 1 toont voorb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel er meer tijd dan andere methoden, zoals spectroscopie en FACS, dat een soortgelijke strategie voor het gebruik van een pH-gevoelige kleurstof gekoppelde doelwitten in dienst maar meet de gemiddelde pH van een populatie phagosomes, microscopie biedt verschillende voordelen. Eerste is dat de interne en externe gebonden, maar niet geïnternaliseerd, kunnen deeltjes gemakkelijk te onderscheiden zijn, zonder dat aan andere chemicaliën, zoals trypaanblauw of antilichamen toe te voegen, respectievelijk blussen of het eti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs worden financieel ondersteund door de Swiss National Science Foundation via een operationele subsidie N° 31003A-149566 (voor N.D.), en The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust via een Young Investigator Subsidie (voor P.N.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Zymosan A powderSigma-AldrichZ4250Er bestaan verschillende leveranciers
Fluoresceïne isothiocyanateSigma-AldrichF7250Er bestaan verschillende leveranciers
Anti-zymosan antilichaam (Zymosan A Bioparticles opsoniserend reagens)Life TechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 is een gelijkwaardig product. Als alternatief kan 25% serum worden gebruikt als een opsoniserend reagens.
4-Aminobenzoëzuurhydrazide (4-ABH)Santa Cruzsc-204107Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers
Difenyleenjodiumchloride (DPI)Sigma-AldrichD2926Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers
Concanamycin A (ConcA)Sigma-Aldrich27689Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers
NigericineSigma-AldrichN7143Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers
MonensinEnzoALX-380-026-G001Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Life Technologies14200-075Giftig, gebruik handschoenen, er bestaan verschillende leveranciers
Hank's balans zoutoplossingLife Technologies14025092Ringer's gebalanceerde zoutoplossing of andere heldere fysiologische buffers kunnen worden vervangen.
Natriumcarbonaat (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795Er bestaan verschillende leveranciers
2-(N-Morpholino)ethansulfonzuur (MES)Sigma-AldrichM3671 Er bestaan verschillende leveranciers
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethansulfonzuur (HEPES)Sigma-AldrichH3375Er bestaan verschillende leveranciers
N-Methyl-D-glucamine (NMDG)Sigma-AldrichM2004 Er bestaan verschillende leveranciers
Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA)Sigma-Aldrich3777Er bestaan verschillende leveranciers
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)Sigma-AldrichT1503 Er bestaan verschillende leveranciers
Kaliumchloride (KCl)Sigma-AldrichP9333Er bestaan verschillende leveranciers
Natriumchloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Er bestaan verschillende leveranciers
Magnesiumchloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266Er bestaan verschillende leveranciers
Absoluut ethanol (EtOH)Sigma-Aldrich2860Er bestaan verschillende leveranciers
Glazen bodem 35 mm petrischaal (Fluorodish)World Precision InstrumentsFD35-100Ibidi µ-clear schalen of dekglasjes met geschikte beeldvormingskamers kunnen worden vervangen
Soniërende waterbadO. Kleiner AGEen sonicator kan worden gebruikt in plaats daarvan, er bestaan verschillende instrumentleveranciers
HemocytometerMarienfeld GmbHEr bestaan verschillende instrumentleveranciers
Widefield live imaging microscoopCarl Zeiss AGEr bestaan verschillende instrumentleveranciers, maar de microscoop moet in staat zijn om 440/535 en 490/535 respectievelijk op te nemen/emissie. Spinning disk confocale set-ups met brightfield mogelijkheden kunnen worden vervangen, maar zymosan heeft de neiging vaker uit focus te gaan.  
Peristaltiekpomp (Dynamax RP-1)RaininEr bestaan verschillende instrumentleveranciers
pH-meterSchott Gerate GmbHEr bestaan verschillende instrumentleveranciers
Handmatige tellerMilian SAEr bestaan verschillende instrumentleveranciers

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
  4. Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
  5. Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
  6. Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
  7. Weisz, O. A. Acidification and protein traffic. Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).
  8. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  9. De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
  10. Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
  11. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
  12. Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
  13. Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
  14. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
  15. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
  17. Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
  18. El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
  19. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
  20. Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels. Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).
  21. Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
  22. Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
  23. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
  24. Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
  25. Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
  26. Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
  27. Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
  28. Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
  29. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  30. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  31. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
  32. Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
  33. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
  34. Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
  35. Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670(2013).
  36. Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
  37. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  38. El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
  39. Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
  40. Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
  41. Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
  42. Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
  43. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FITC gelabeld ZymosanNeutrofiel FagocytoseLive cell ImagingpH kalibratieRatio imagingFagosomale RijpingReactieve Zuurstofsoorten

Gerelateerde artikelen