Methodenartikel

Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse

DOI:

10.3791/53405

⸱

26 november 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 2Department of Periodontics, University of Illinois at Chicago

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om laser-capture micro-dissectie te gebruiken als een effectieve methode om pure populaties van celtypen te isoleren uit heterogene prostaatweefsels voor downstream RNA-analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prostaatklier bevat een heterogeen milieu van stromale, epitheliële, neuro-endocriene en immuuncellen. Een gezonde prostaat bestaat uit fibromusculair stroma dat discrete epitheel-beklede secretoire lumina omringt en een zeer kleine populatie van immuun- en neuro-endocriene cellen. In tegenstelling daarmee hebben gebieden met prostaatkanker een verhoogde dysplastische luminaal epitheel met een sterk verminderde of afwezige stromapopulatie. Gezien het grote verschil tussen stromale en epitheelcellen, is het van essentieel belang om de celtypen te scheiden voor elk type downstream moleculair onderzoek. Ondanks deze kennis vergelijken de meeste genexpressiestudies goedaardige prostaat met kanker zonder microdissectie, wat leidt tot stromabias in de goedaardige monsters. Laser-capture microdissectie (LCM) is een effectieve methode om verschillende celtypen fysiek te scheiden van een monstersnede. Het doel van dit protocol is om aan te tonen dat RNA met succes kan worden geïsoleerd uit LCM-verzameld menselijk prostaatepitheel en kan worden gebruikt voor downstream genexpressiestudies zoals RT-qPCR en RNAseq.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prostaat is een heterogeen weefsel samengesteld uit secretoire epitheel gerangschikt in glandular acini omgeven door fibromusculaire stroma voornamelijk samengesteld uit gladde spieren 1. De epitheliale compartiment omvat vijf verschillende maar georganiseerde celtypes: basale cellen, secretorische cellen, neuro-endocriene cellen, transit versterken en stamcellen 2. Bij prostaatkanker (PCa), die voortvloeit uit de luminale epitheliale cellen, de groei van het adenocarcinoom veroorzaakt een duidelijke geleidelijke afname van het stromale compartiment 3. Daarom zullen weefselmonsters zijn duidelijke verschillen in het aandeel van stromale en epitheliale celtype gebaseerd op de mate van PCa. Deze verschillen kunnen leiden tot vertekende aannames van de genexpressie gegevens van hele weefsels verkregen ongeacht microdissectie van het gewenste celtype. Daarom, om deze bias te verwijderen is het noodzakelijk om celtypen te scheiden voorafgaand aan RNA-extractie engenexpressie analyse.

Macrodissection of microdissectie kan worden fysiek gescheiden goed gekarakteriseerde epitheliale delen van de omliggende stroma 4 -6. Macrodissection wordt meestal gedaan met een scheermesje onder een dissectiemicroscoop en werkt goed voor het scheiden van grote prostaatkanker knobbeltjes stroma, maar niet kan verwijderen goedaardige epitheel van omliggende stroma (zie voorbeeld goedaardige prostaat histologie in figuur 1). Microdissectie met een laser (LCM) aanzienlijk arbeidsintensiever dan macrodissection, maar kan zeer nauwkeurig ontleden goedaardige epitheel 4.

Recente publicaties van ons lab hebben aangetoond dat RNA met succes door de LCM van beide formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) biopten of bevroren weefsel 4,7-9 kan worden gewonnen. De belangrijkste uitdagingen in LCM-RNA-extractie zijn 1) om nauwkeurig ontleden de gewenste gebieden van het weefsel, en 2) te behouden RNA integriteit tijdens de LCM en isolatie proces 4,10. RNA geïsoleerd uit zuivere celpopulaties kunnen worden gebruikt voor genexpressieanalyse door verscheidene werkwijzen zoals reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) 7,8, microarray 11 en diep -sequencing 12-14.

Het doel van dit protocol is het totaal RNA van LCM prostaat epitheel isoleren uit bevroren weefsel op stroomafwaartse genexpressie analyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle menselijke weefsels worden gebruikt voor deze experimenten werden verkregen via een Institutional Review Board goedgekeurd protocol en / of ontheffing aan de Universiteit van Illinois in Chicago.

1. Afdeling Fresh Frozen Prostaat op PEN-glijbaan en op Charged Glasplaatje

  1. De dag voor of een paar uur voor het snijden van het monster, schoon gereedschap (dat wil zeggen, kwast, tang, coplins, messen, PEN-omlijst dia's (indien nog niet RNase gratis), een ETOH veilige markering en een potlood) en de binnenkant van een RT cryostaat met RNase-ontsmetten oplossing met behulp van een spuitfles en lab-doekjes.
    1. Sta-RNase decontaminatie oplossing te zitten voor 5 minuten voor weg te vegen, spoelen met depcH 2 0 te verwijderen overgebleven RNase-ontsmetten oplossing en een laatste spoeling met 70% EtOH (bereid met depcH 2 0).
      Opmerking: Het is essentieel om een ​​RNase-free werkplek te handhaven. Alle coplins, gereedschappen, bevroren montage medium, bladen en slides gebruikt mag alleen worden gebruikt voor RNase vrij werken nooit in een standaard niet-RNase-vrije omgeving. Alle instrumenten moeten worden behandeld met RNase decontaminatie oplossing vóór elk experiment.
  2. Koel cryostaat tot -24 ° C.
  3. Plaats de volgende gereinigd RNase-free instrumenten binnen cryostaat minstens 30 minuten afkoelen voordat snijden: slide Coplin gevuld met 100% ethanol, gereedschappen, kleine bevroren weefselcassettes en montage klem.
  4. Ophalen bevroren prostaatweefsel van cryo en plaats in een droge-ijs gevulde schuim emmer voor transport. Plaats weefsel in cryostaat in evenwicht temperatuur cryostaat gedurende tenminste 30 min.
    Opmerking: menselijke prostaat weefsels voor laser-capture micro-dissectie kan zowel vers bevroren of zijn formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE). De tijdsdruk en voorbereiding glijbaan zijn iets anders tussen weefsel bronnen. Hier beschrijven we de stappen voor ingevroren secties.
  5. Werken met een tissue tegelijk en spuit bevroren fixeermiddel in de bottom van de cassette en snel te monteren de bevroren prostaatweefsel in de bevroren montage medium met behulp van de gekoelde pincet.
  6. Plaats de cassette met weefsel op chiller in cryostaat 5 min op bevroren montage medium in te stellen.
  7. Squirt een kleine hoeveelheid bevroren montage medium op de boorkop en zorgvuldig druk gemonteerd weefsel onderkant naar boven op de bevroren montage medium. Laat in de cryostaat gedurende 5 min om de bevroren fixeermiddel volledig stollen.
  8. Plaats de klem in de houder en draai.
  9. Vergrendelen de hendel in de vergrendelde stand en plaats een nieuw blad op de cryostaat. Voor stroomafwaartse moleculaire eindpunten dat een amplificatiestap omvatten (dwz qPCR) is het raadzaam om een nieuw blad gebruiken voor elke patiënt om contaminatie te voorkomen (of beweegt het blad naar oppervlakte van het blad te gebruiken voor het volgende monster).
  10. Ontgrendelen van de handgreep en het weefsel voorzichtig vooruit met de hand of met een voetpedaal om zelfs en het weefsel bloot te leggen met 50 μm gedeelten totdat de gewenste belichting weefsel bereikt.
  11. Pas cryostaat tot 5 urn, gesneden één of twee gedeelten en plaats ze op glasplaatje gebracht voor hematoxyline en eosine (H & E) kleuring (zie stap 2).
  12. Plaats onmiddellijk de dia in de koude 100% ethanol gedurende 2 minuten.
  13. Verwijder de geladen glasplaatje uit ethanol en laat het drogen op kamertemperatuur alvorens tot H & E kleuring (stap 2).
  14. Plaats RT PEN frame dia op een frame supporter.
  15. Pas cryostaat tot 10 pm en plaats delen op het RT PEN kader dia's. Een tot vier secties kan plaatsvinden op elke dia afhankelijk weefselgrootte.
  16. Onmiddellijk duik de dia in de koude 100% ethanol gedurende 2 minuten.
  17. Verwijder de PEN frame dia's uit ethanol en bewaar de dia in een dia doos in een exsiccator doos in een -80 ° C vriezer tot klaar voor LCM. Drie dagen is de maximale bewaartermijn voor een optimale RNA herstel.
  18. Ga verder met Stap 2 voor alleen de geladen glas gleede. Ga verder met stap 3 voor PEN frame glijbaan.

2. hematoxyline en eosine-Y (H & E) Stain voor histologisch Mark-up

Opmerking: Dit als om het weefsel op de geladen glasplaatje en NIET de PEN-kader glijbaan voor LCM.

  1. Hydrateren secties in de geladen glasplaatje dompelen van de schuif door gegradeerde ethanol als volgt: dompel de dia tweemaal in 100% ethanol gedurende 3 min, tweemaal in 95% ethanol gedurende 3 minuten, eenmaal in 70% ethanol gedurende 3 min en twee keer in gedestilleerd H 2 O 3 min.
    1. Bereid zure alcoholoplossing: 99 ml 70% ethanol + 1 ml 1% HCl en 0,1% natriumbicarbonaatoplossing: 0,1 g natriumbicarbonaat in 100 ml gedestilleerd H2 O
  2. Dompel de dia in Hematoxyline Gill II (0,4%) gedurende 5 minuten.
  3. Afwassen overtollige vlek in stabiele lopende kraan H 2 O 3 min.
  4. Dompel de dia 10 keer in zuur alcohol
  5. Was de dia in stromend leidingwater H 2 O 3 min.
  6. Dompel de diain 0,1% natriumbicarbonaat oplossing 30-60 seconden de paarsachtige kleur blauw.
  7. Was de dia in stromend leidingwater H 2 O 3 min.
  8. Spoel de dia in 95% ethanol met 10 dips.
  9. Dompel de dia in Eosine-Y 2-3 keer gedurende 15 sec totaal.
  10. Dehydrateer de schuif door gesorteerde ethanol als volgt: dompel de dia twee keer in 95% ethanol, twee keer in 100% ethanol, en twee keer in xyleen (zorg ervoor dat het weefsel wordt duidelijk welke grondige uitdroging aangeeft).
  11. Monteer de dia met niet-waterige permanente harde montage medium en dekglas.
  12. Laat de dia drogen 30 min.
  13. Grote afbeelding van een hoge-resolutie scan dia met elke hele dia scanner en printen op 8 "x 11" papier.
  14. Schets aandachtsgebieden (meestal gedaan door een bevoegd patholoog) met een marker. Deze opmaak is de gids voor de LCM procedure.

3. toluïdineblauw kleuring van PEN-kader Slides

Opmerking: Thwordt gedaan op dezelfde dag als het LCM. Gebruik depcH 2 O water voor alle oplossingen. Voltooi alle stappen in RNase-vrij gebied. Alle coplins moeten worden gereinigd met RNase-ontsmetten oplossing.

  1. De dag van LCM verwijder de PEN-kader slides van -80 ° C vriezer en hydrateren door zachtjes dompelen dia's in 90% EtOH gedurende 2 minuten dan 75% EtOH gedurende 2 minuten.
    1. Bereid 0,5% toluïdineblauw door oplossen in de moleculaire biologie kwaliteit water vervolgens filteren steriliseren door een 0,2 um filter en bewaar bij kamertemperatuur. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor maximaal 6 maanden. NB: Het wordt sterk aangeraden om de oplossing te bereiden voorafgaand aan de filtratie een paar uur kan duren.
  2. Vlekken op de prostaat weefsel door voorzichtig te dompelen dia's in 0,5% toluïdineblauw voor 5-30 sec. Destain het weefsel door wassen glijdt 2 keer depcH 2 O 15 seconden gevolgd door 75% EtOH gedurende 30 sec tot 3 min. Opmerking: vlek en destain tijd worden ingesteld om een ​​goede kleuring te garanderen. Prostate neiging heeft om te vlek.
  3. Transfer PEN frame dia's RNAase-vrij droog container op ijs.

4. Laser-capture Micro-dissectie (LCM)

  1. Onmiddellijk voorafgaand aan LCM, droge dia een dia warmer bij 42 ° C gedurende 15 min. Droog alleen de dia die zal worden verwerkt en bewaar de rust op het ijs totdat klaar voor hen.
  2. Schakelen LCM en de computer in deze volgorde, microscoop macht, de laser-toets, de laser schakelaar en start de computer. Start de Laser Microdissection software.
  3. Gebruik de software om de microscoop om de dia's en het verzamelen buizen Load Control. Klik op "unload monsterhouder", laadt de dia met de secties op de microscoop diahouder met het weefsel naar beneden en plaats de houder dia in de juiste sleuf in de microscoop, klik op "doorgaan".
    1. Klik op "unload collectie buizen", label en laad 0,5 ml buizen op de buis houder en plaats deze in de juiste sleuf in het instrument. Eenscaps zijn beveiligd, voeg 35 ul van Lysis buffer om de collectie caps en proberen te bellen te voorkomen. Klik vervolgens op "OK".
      Opmerking: als verdamping is een probleem, verdunnen als volgt de buffer: 25 ul lysisbuffer met 10 ul depcH2O.
  4. In de software, selecteer de positie waar de dia heeft in de diahouder geplaatst. Selecteer de collectie dop om de LCM specimen verzamelen.
  5. Visualiseren en de focus van de dia via de computer op 10X. Gebruik de software om de laser te kalibreren door het selecteren van "Laser" en vervolgens "kalibreren". Pas de macht, diafragma en de snelheid van de laser, het selecteren van "laser" dan "control" zodat de laserbundel met de complete en efficiënte geselecteerde gebied snijden. Herhaal aanpassingen totdat de laser snijdt volledig door het weefsel.
  6. Met behulp van de 8 "x 11" patholoog mark-up als een gids, de "tekenen vorm" instrument om de gewenste gebieden van epithe omschrijvenlium in het uitzicht en vermijd verzamelen elke stroma.
    Opmerking: meerdere gebieden kunnen worden gekozen binnen een uitzicht, maar niet verplaatsen naar een andere weergave zonder eerst te snijden door te klikken op de "cut vorm" tool.
    1. Als een gebied niet volledig te snijden door de laser de "bewegen en snijd" tool om handmatig te gaan over. Verplaats de doelstelling nieuwe inzichten en herhaal lasersnijden tot slede volledig ontleed of de gewenste hoeveelheid weefsel is verzameld (typisch 100 benigne klieren op 150-500 ng RNA). (zie voorbeeld in figuur 1A).
  7. Verwijder voorzichtig buizen uit de collectie houder en sluit de doppen, die bewust van de lysisbuffer en weefsel in de doppen. Kort centrifugeer 30 sec vloeistof en weefsel te verzamelen op de bodem van de buis. Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 30 min en bewaar bij -80 ° C tot klaar voor RNA-isolatie.

5. Totaal RNA isolatie met Fil-ter gebaseerde Kit en Kwaliteit Analyse

  1. Ontdooi de buizen op ijs en breng het volume van de oplossing tot 100 ul.
  2. Pre-nat het microfilter van de RNA isolatie kit door toepassing 30 ul ofLysis oplossing naar het midden van de filter en laat het inwerken whileperforming de volgende twee stappen (minimaal 5 min).
  3. Voeg 3 ul van LCM Bewaarvloeistof (verschaft in de kit) aan het lysaat en door vortexen gemengd gedurende 5 sec. Centrifugeer gedurende 30 seconden om de vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis.
  4. Centrifugeer de pre-bevochtigd filter voor ~ 30 sec op topsnelheid om vloeistof te verwijderen.
  5. Voeg 1,25 delen (in dit geval 129 pl) van 100% ethanol aan het lysaat mengsel voorzichtig vortex of pipet op en neer. ** Deze methode zal zowel grote als kleine RNA soorten te herstellen.
  6. Laad het monster op de vooraf bevochtigde microfilter en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut aan het RNA aan het filter binden. Daarna wassen microfilter met 180 gl "wasoplossing 1, R21; Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 min.
    Let op: Vanaf dit punt alle centrifugaties moet worden gedaan bij 13.000 xg, of maximum snelheid.
  7. Was filter tweemaal met 180 gl "wasoplossingen 2 en 3", respectievelijk aangegeven door de kit protocol. Centrifugeer 30 sec, gooi dan de stroom door en draai de filter gedurende 1 minuut om resterende vocht te verwijderen en het filter drogen.
  8. Transfer filter om een ​​nieuwe collectie buis.
  9. Warm elutieoplossing tot -95 ° C (bij de kit).
  10. Breng 10 pl voorverwarmde elutieoplossing naar het midden van het filter, sluit de dop en opslaan gedurende 5 min bij RT. Centrifugeer 1 minuut aan het RNA te elueren, en herhaal deze stap eenmaal onder verkrijging ~ 20 pi RNA.
  11. Voer de DNase I behandeling van 15 minuten bij 37 ° C.
  12. Kwantificeren RNA door spectrofotometer met absorptie bij 260 nm. De verhouding van de optische dichtheid bij een golflengte van 260 nm en 280 nm wordt gebruikt om de zuiverheid van de beoordelenRNA (zie tabel 1) 15.

6. Gene Expression Analysis

Opmerking: genexpressie van lange RNA soorten (zoals mRNA en lncRNAs) wordt getoond in stap 6.1 en korte RNA soorten (zoals microRNA's) wordt getoond in stap 6.2. Verschillende kits beschikbaar voor RT-qPCR en de hoeveelheid RNA vereist varieert per kit (zo weinig als 10 ng). RNA sequentie analyse wordt beschreven in 6.3.

  1. Reverse transcriberen (RT) het RNA in cDNA mengen 5 pl 20 ng / pl RNA monster met 5 ui van de RT master mix (RT buffer, dNTP's, willekeurige primers, RT enzym RNase inhibitor). Incubeer het reactiemengsel gedurende 25 min bij 25 ° C, daarna 120 minuten bij 37 ° C en 5 minuten bij 85 ° C.
  2. Verdun de RT-reactie 1:10 met RNase vrij water en het gebruik van 2,5 ul per 10 ul qPCR reactie met primers of primer / probe-sets voor de genen van belang.
    Opmerking: Om de analyse van gedeeltelijk afgebroken RNA vergemakkelijken Het is raadzaam om primers gebruiken for kortere amplicons (minder dan 100 bp) 16. (Tabel 2B)
    1. Voor microRNA expressie analyse uitvoeren van de RT-reactie door het mengen van 5 ul van 2-10 ng / ul RNA-monster met 5 pi van de RT-master mix.
      Let op: iedere commercieel verkrijgbare PCR-gebaseerde microRNA detectie technologie vereist het gebruik van eigen en specifieke RT primers.
  3. Alternatief of in aanvulling op RT-PCR gebruikt next generation sequencing (RNA-seq of klein RNA-seq) verschillende soorten RNA te kwantificeren. Gewoonlijk gebruiken 500 ng RNA voor deze procedure (Tabel 3) en het uitvoeren van de werkwijze zoals aangegeven door de fabrikant en detectie instrument.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In een eerdere studie toonde wij het ​​gebruik van LCM op epitheliale en stromale weefsels verzamelen om expressie profilering vergelijken door RT-qPCR van mRNA en microRNAs uit bevroren en FFPE prostaat weefsel van dezelfde patiënt 4. LCM is tijdrovend, met name wanneer grote hoeveelheid RNA te verzamelen voor de volgende generatie sequencing analyse. Daarom is het cruciaal om de werkruimte te houden en gereedschappen RNase-free. Het wordt aanbevolen om de kwaliteit en cel-specificiteit controles in de opgev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genexpressie profilering van humane monsters kan lastig zijn, niet alleen voor de kwaliteit of kwantiteit van weefsel mogelijk, maar ook de verschillende zich in een bepaald weefsel specimen histologische entiteiten. Deze Vooral in de prostaat waarin goedaardige weefsels grotendeels stromale weefsels en delen van kanker zijn verstoken van stroma. LCM vergemakkelijkt fysieke scheiding van prostatische stroma en epitheel RNA een nauwkeuriger handtekening van de twee verschillende celtypen (Figuur 1A). In ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco en Avani Vaishnav voor hun hulp bij het optimaliseren van deze methodologie door de jaren heen en Yang Zhang en Dr. Jian Ma aan de Universiteit van Illinois in Urbana-Champaign voor de RNA seq-analyse. Dit werk werd ondersteund door NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) en een Prevent Cancer Foundation-beurs (Zhou).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RNase-AWAY MBP7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides Leica11600289
Glasplakjes, Superfrost PlusFisherBrand12-550-15
Ethanol 200 proofDecon labs.2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)SigmaD-5758
CryostatLeicaCM3050
Coplins (Kleurvat)IHCWORLDM900-12
Coplins (Kleurrek)IHCWORLDM905-12
Aperio ScanScopeAperio(Leica)ScanScope® CS
Toluidine BlauwFluka89640-5G
Laser Microdissection SystemLeicaLMD7000
0,5 ml Dunne wandbuizen voor LCMThermo ScientificAB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation KitAmbionAM1931Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDropThermo ScientificND-1000
Qubit 2.0 FluorometerLife TechnologiesQ32866Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4368814Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxnsExiqon203301
TaqMan microRNA RT kitApplied Biosystems4366597Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxyline kleuring Ricca Chemical Company3536-16
Eosin-YRichard Allan Scientific 7111

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
  2. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12, 19-47 (2005).
  3. McNeal, J. E., Haillot, O. Patterns of spread of adenocarcinoma in the prostate as related to cancer volume. The Prostate. 49, 48-57 (2001).
  4. Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
  5. Long, Q., et al. Global transcriptome analysis of formalin-fixed prostate cancer specimens identifies biomarkers of disease recurrence. Cancer research. 74, 3228-3237 (2014).
  6. Long, Q., et al. Protein-coding and microRNA biomarkers of recurrence of prostate cancer following radical prostatectomy. The American journal of pathology. 179, 46-54 (2011).
  7. Giangreco, A. A., et al. Differential expression and regulation of vitamin D hydroxylases and inflammatory genes in prostate stroma and epithelium by 1,25-dihydroxyvitamin D in men with prostate cancer and an in vitro. model. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. , (2014).
  8. Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
  9. Mihelich, B. L., et al. miR-183-96-182 cluster is overexpressed in prostate tissue and regulates zinc homeostasis in prostate cells. The Journal of biological chemistry. 286, 44503-44511 (2011).
  10. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC cell biology. 11, 95(2010).
  11. Gregg, J. L., Brown, K. E., Mintz, E. M., Piontkivska, H., Fraizer, G. C. Analysis of gene expression in prostate cancer epithelial and interstitial stromal cells using laser capture microdissection. BMC cancer. 10, 165(2010).
  12. Hart, M., et al. Comparative microRNA profiling of prostate carcinomas with increasing tumor stage by deep sequencing. Molecular cancer research : MCR. 12, 250-263 (2014).
  13. Smalheiser, N. R., Lugli, G., Thimmapuram, J., Cook, E. H., Larson, J. Endogenous siRNAs and noncoding RNA-derived small RNAs are expressed in adult mouse hippocampus and are up-regulated in olfactory discrimination training. Rna. 17, 166-181 (2011).
  14. Song, C., et al. Expression profile analysis of microRNAs in prostate cancer by next-generation sequencing. The Prostate. 75, 500-516 (2015).
  15. Deng, M. Y., Wang, H., Ward, G. B., Beckham, T. R., McKenna, T. S. Comparison of six RNA extraction methods for the detection of classical swine fever virus by real-time and conventional reverse transcription-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17, 574-578 (2005).
  16. Kong, H., et al. Quantitative assessment of short amplicons in FFPE-derived long-chain RNA. Scientific reports. 4, 7246(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA isolatiebevroren weefselcryostaatsnedentoluidineblauwkleuringRNA vrije omgevinglysisbuffer incubatieRT qPCR analyseRNAseq analyse

Gerelateerde artikelen