Laser-capture microdissectie van Human Prostatic Epithelium voor RNA-analyse

Summary

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Abstract

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Introduction

De prostaat is een heterogeen weefsel samengesteld uit secretoire epitheel gerangschikt in glandular acini omgeven door fibromusculaire stroma voornamelijk samengesteld uit gladde spieren ^1. De epitheliale compartiment omvat vijf verschillende maar georganiseerde celtypes: basale cellen, secretorische cellen, neuro-endocriene cellen, transit versterken en stamcellen ^2. Bij prostaatkanker (PCa), die voortvloeit uit de luminale epitheliale cellen, de groei van het adenocarcinoom veroorzaakt een duidelijke geleidelijke afname van het stromale compartiment ^3. Daarom zullen weefselmonsters zijn duidelijke verschillen in het aandeel van str....

Protocol

Alle menselijke weefsels worden gebruikt voor deze experimenten werden verkregen via een Institutional Review Board goedgekeurd protocol en / of ontheffing aan de Universiteit van Illinois in Chicago.

1. Afdeling Fresh Frozen Prostaat op PEN-glijbaan en op Charged Glasplaatje

1. De dag voor of een paar uur voor het snijden van het monster, schoon gereedschap (dat wil zeggen, kwast, tang, coplins, messen, PEN-omlijst dia's (indien nog niet RNase gratis), een ETOH veilige markering en een potlood) en de binnenkant van een RT cryostaat met RNase-ontsmetten oplossing met behulp van een spuitfles en lab-doekjes.
   1. Sta-RNase dec....

Results

In een eerdere studie toonde wij het ​​gebruik van LCM op epitheliale en stromale weefsels verzamelen om expressie profilering vergelijken door RT-qPCR van mRNA en microRNAs uit bevroren en FFPE prostaat weefsel van dezelfde patiënt ^4. LCM is tijdrovend, met name wanneer grote hoeveelheid RNA te verzamelen voor de volgende generatie sequencing analyse. Daarom is het cruciaal om de werkruimte te houden en gereedschappen RNase-free. Het wordt aanbevolen om de kwaliteit en cel-specificiteit controles in de opgev.......

Discussion

Genexpressie profilering van humane monsters kan lastig zijn, niet alleen voor de kwaliteit of kwantiteit van weefsel mogelijk, maar ook de verschillende zich in een bepaald weefsel specimen histologische entiteiten. Deze Vooral in de prostaat waarin goedaardige weefsels grotendeels stromale weefsels en delen van kanker zijn verstoken van stroma. LCM vergemakkelijkt fysieke scheiding van prostatische stroma en epitheel RNA een nauwkeuriger handtekening van de twee verschillende celtypen (Figuur 1A). In .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111