Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53407

⸱

19 december 2015

 ,  ,  , 
1Friedrich Miescher Laboratory, Max Planck Society, 2Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De moleculaire mechanismen van de decondensatie van sterk gecompacteerde mitotische chromatine zijn slecht gedefinieerd. We presenteren een celvrije test op basis van mitotische chromatineclusters geïsoleerd uit HeLa-cellen en Xenopus laevis eierextract die het decondensatieproces in vitro getrouw reconstrueert.

Samenvatting

Tijdens de celcyclus van gewervelde dieren ondergaat chromatine uitgebreide structurele en functionele veranderingen. Bij binnenkomst in de mitose condenseert het massief tot staafvormige chromosomen die individueel worden verplaatst door het mitotische spindelapparaat. Mitotische chromatinecondensatie levert chromosomen op die vijftig keer dichter zijn gecompacteerd dan in de interfase. Tijdens het verlaten van de mitose moeten chromosomen hun functionele interfasetoestand herstellen, die is omsloten door een nucleaire envelop en competent is voor replicatie en transcriptie. Het decondensatieproces is morfologisch goed beschreven, maar in moleculaire termen slecht begrepen: we missen kennis over de onderliggende moleculaire gebeurtenissen en in grote mate over de betrokken factoren en hun regulatie. We beschrijven hier een celvrij systeem dat de chromatine-decondensatie getrouw in vitro naspeelt, gebaseerd op mitotische chromatineclusters gezuiverd uit gesynchroniseerde HeLa-cellen en X. laevis-eicelextract. Ons celvrije systeem biedt een belangrijk hulpmiddel voor verdere moleculaire karakterisering van chromatine-decondensatie en de coördinatie ervan met processen die tegelijkertijd plaatsvinden tijdens het verlaten van de mitose, zoals herstel van de nucleaire envelop en poriecomplex.

Inleiding

Xenopus laevis ei extract is een krachtige en algemeen toegepaste gereedschap studeren complexe cellulaire gebeurtenissen in de eenvoud van een celvrije assay. Sinds hun eerste beschrijving van Lohka & Masui 1 zij zijn uitgebreid gebruikt om mitotische processen zoals chromatinecondensatie 2, assemblage van de spoel 3, afbraak nucleaire envelop 4, maar ook nucleocytoplasmatisch vervoer 5 of DNA-replicatie 6 bestuderen. De gebeurtenissen die plaatsvinden aan het eind van mitose, noodzakelijk voor hervorming van de interfase nucleus zoals envelope reformatie nucleaire en nucleaire porie complex montage veel minder begrepen vergelijking met de vroege mitotische gebeurtenissen, maar kan eveneens worden bestudeerd door Xenopus ei extract 7. We hebben onlangs een assay gebaseerd op Xenopus ei extract chromatine decondensatie studie eind mitose 8 vastgesteld, een onder onderzochte proces i wachtts gedetailleerde karakterisering.

In meercelligen wordt zeer gecondenseerde chromatine op mitotische vermelding om getrouw scheiding van het genetisch materiaal uit te voeren. Om de chromatine toegankelijk voor genexpressie en DNA-replicatie tijdens interfase, moet worden verdicht de-eind mitose. In vertebraten, chromatine tot vijftig maal meer samengeperst tijdens mitose opzichte interfase 9, in tegenstelling tot gisten wanneer de mitotische verdichting meestal lager, bijvoorbeeld, twee-voudig S. 10 cerevisiae. Gewervelde chromatine decondensatie is voornamelijk bestudeerd in de context van sperma DNA reorganisatie na ei bevruchting. Een moleculair mechanisme, waarbij nucleoplasmin, een overvloedige eicel eiwit, ruilt sperma-specifieke protaminen naar histonen H2A en H2B opgeslagen in het ei. Deze werkwijze werd opgehelderd middels Xenopus ei extract 11, 12. De uitdrukkingvan nucleoplasmin is beperkt tot eicellen 13 en mitotische chromatine niet van deze sperma-specifieke protaminen bevatten. Daarom chromatine decondensatie eind mitose is nucleoplasmin onafhankelijk 8.

Voor de in vitro decondensatie reactie gebruiken we extract gegenereerd uit geactiveerde X. laevis eieren en chromatine clusters geïsoleerd uit gesynchroniseerde HeLa-cellen. Behandeling van eieren met een calciumionofoor bootst de calcium introductie in de eicel die door sperma ingang tijdens de bevruchting. De calcium golf activeert de celcyclus hervatting en het ei, gearresteerd in de tweede metafase van de meiose, ontwikkelt tot de eerste interfase 14. Daarom ei extracten bereid vorm geactiveerd eieren vertegenwoordigen de mitotische afslag / interphase staat en bevoegd zijn om evenementen die specifiek zijn voor mitotische exit zoals chromatine decondensatie, nucleaire envelop induceren en porie complex reformatie. Voor de isolatie van mitotische chromatin clusters we gebruikten een enigszins aangepaste versie van het protocol gepubliceerd door Gasser & Laemmli 15, waarbij chromosoom clusters worden vrijgemaakt door lysis van HeLa-cellen in mitose gesynchroniseerd en geïsoleerd in polyamine bevattende buffers met gradiënt centrifugeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Mitotische Chromatin Cluster Isolatie van HeLa-cellen

1. Voorbereidingen

  1. Celkweekoplossingen
    1. Bereid compleet Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met toevoeging van 10% foetaal kalfserum, 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM glutamine aan het DMEM. Bereid fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) bevattende 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4 2 H 2 O en 2 mM KH 2PO 4 in gedeïoniseerd water, en pas pH op 7,4 met 10 N NaOH.
      OPMERKING: PBS kunnen als 10x voorraad-oplossing in de tijd bij kamertemperatuur worden bewaard. Verdunnen met gedemineraliseerd water tot 1x voor gebruik. Filtreer de oplossing 1x opnieuw als deze wordt gebruikt in celcultuur.
    2. Bereid een 40 mM voorraad van thymidine-oplossing (celkweek geschikt) in DMEM medium. Los 0,97 g thymidine in 90 ml DMEM medium. Pas eindvolume van 100 ml. Store voorraad oplossing bij -20 °C. Los (LET OP! Werken onder chemische kap, handschoenen en mond bescherming) nocodazole aan een 5 mg / ml voorraad oplossing in DMSO.
  2. Mitotische Clusters Isolatie Solutions
    NB: Alle oplossingen in 1.2 beschreven moet op het ijs in het hele experiment worden gehouden na de bereiding / ontdooien.
    1. Autoclaaf gedeïoniseerd water gedurende 105 minuten bij 121 ° C. Los spermine tetrahydrochloride in geautoclaveerd gedeioniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van 200 mM (69,6 mg / ml). Store voorraad oplossing bij -20 ° C. Los spermidine trihydrochloride in geautoclaveerd gedeioniseerd water tot een uiteindelijke concentratie van 200 mM (50,8 mg / ml). Store voorraad oplossing bij -20 ° C.
    2. Bereid 5% (w / v) digitonine (LET OP! Werken onder chemische kap, handschoenen en bescherming van de mond) in heet, gedemineraliseerd water. Filter en bewaar monsters bij -20 ° C. Ontbinden fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (LET OP! Unde werkenr chemische kap, handschoenen en mond bescherming) tot een uiteindelijke concentratie van 200 mM (35 mg / ml) in 100% ethanol. Store voorraad oplossing bij -20 ° C.
    3. Ontbinden dithiothreitol (DTT) met gedemineraliseerd water tot een uiteindelijke concentratie van 1 M (154 mg / ml) (LET OP! Werken onder chemische kap, handschoenen dragen). Filter en bewaar stockoplossing bij -20 ° C.
    4. Bereid een 100-voudige proteaseremmer mix (LET werken onder chemische kap, handschoenen dragen!) Door het oplossen van 10 mg / ml AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml leupeptine, 0,1 mg / ml pepstatine en 0,2 mg / ml aprotinine in gedeïoniseerd water. Store voorraad oplossing bij -20 ° C.
    5. Bereid een 10x voorraadoplossing van buffer A die 150 mM Tris-Cl (pH 7,4), 800 mM KCl, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM spermine tetrahydrochloride en 5 mM spermidine trihydrochloride. WINKEL buffer A bij 4 ° C zonder spermine en spermidine trihydrochloride tetrahydrochloride, die moet worden toegevoegdpas net voor gebruik.
      OPMERKING: EDTA oplost Pas bij pH hoger dan 8, dus een hoog geconcentreerde KOH EDTA stockoplossing (0,5 M aanbevolen) wordt 5 N KOH tot pH boven 8 te ontbinden. Daarna omlaag titreren tot pH 7,4.
    6. Bereid een 20x voorraadoplossing van buffer bevattende 100 mM Tris-HCl (pH 7,4), 400 mM KCI, 400 mM EDTA-KOH (pH 7,4) en 5 mM spermidine trihydrochloride. Buffer Zoals kan onder dezelfde voorwaarden als buffer A. worden opgeslagen
      NB: Bereid de werkoplossingen I tot IV (zie de volgende stappen), glycerol gradiënt en de colloïdale silicadeeltjes oplossingen met silicadeeltjes (15 tot 30 nm diameter) bekleed met niet-dialyseerbaar polyvinylpyrrolidon (PVP) pas vlak vóór het isoleren procedure (PMSF en digitonine moet direct worden toegevoegd voor gebruik als PMSF is labiel in waterige oplossingen en digitonine neiging neer te slaan op lange termijn opslag op ijs).
    7. Bereid 100 ml oplossing I door toevoeging 0,5x buffer A,1 mM DTT, 1: 100 van de proteaseremmer mix en 0,1 mM PMSF in geautoclaveerd gedeioniseerd water. Bereid 50 ml oplossing II (voor cellysis) door toevoeging van 1 x buffer A, 1 mM DTT, 1: 100 van de proteaseremmer mix, 0,1 mM PMSF, 0,1% digitonine en 10% glycerol in geautoclaveerd gedeioniseerd water.
    8. Bereid 200 ml van oplossing III met 0,25x buffer A, 1 mM DTT, 1: 100 van de proteaseremmer mix, 0,1 mM PMSF en 0,05% digitonine in geautoclaveerd gedeioniseerd water. Bereid 40 ml oplossing IV uit 1x buffer, 1 mM DTT, 1: 100 van de proteaseremmer mix, 0,1 mM PMSF en 0,1% digitonine in geautoclaveerd gedeioniseerd water.
    9. Bereid 120 ml glycerol gradiënt door toevoeging van 25% glycerol en 0,1% digitonine om oplossing I.
    10. Bereid 150 ml colloïdale silicadeeltjes bevattende 60% v / v (volume per volume) van een suspensie die silica deeltjes (15 tot 30 nm diameter) bekleed met niet-dialyseerbaar polyvinylpyrrolidon (PVP), 15% glycerol, 2 mM spermidine trihydrochloride en 0,8 mM spermine tetrahydrochloride in oplossing IV.
    11. Bereid cluster opslagbuffer bevattende 250 mM sucrose, 15 mM Hepes (pH 7,4), 0,5 mM spermidine trihydrochloride, 0,2 mM spermine tetrahydrochloride, 1: 100 van de proteaseremmer mix, 0,3% BSA en 30% glycerol. De cluster opslagbuffer kunnen bij -20 ° C bewaard.
    12. Bereid squash fix oplossing die 10% formaldehyde (LET OP! Werken onder chemische kap, handschoenen dragen), 50% glycerol, tweeledig Mark's gemodificeerd Ringers buffer (MMR zie 4.5.) En 0,2 ug / ml DAPI (LET OP! Draag handschoenen). Bewaren bij 4 ° C in het licht beschermd reageerbuizen. Het is niet essentieel voor het experiment deze squash correctie recept gebruikt worden alternatieve recepten ook werken.

2. Synchronisatie van Cellen

  1. Op Dag 1: Seed HeLa-cellen in vijf 75 cm 2 (250 ml) flesjes met media en incuberen in bij 37 ° C in 5% CO 2.
    NB: Dit zal ongeveer 18 x 10 6 cellen op in op de dag van chromatine cluster isolement.
  2. Op Dag 2: Wanneer de cellen ten minste 50% confluent (ongeveer de helft van het oppervlak is bedekt met cellen en er is nog ruimte voor cellen te kweken), voeg thymidine tot een uiteindelijke concentratie van 2 mM (thymidine blok) en cultuur cellen voor 24 uur bij 37 ° C in 5% CO2.
    NB: Dit zal de cellen te arresteren op de G1 / S-fase grens.
  3. Op dag 3: Zuig medium dat thymidine en voeg steriel PBS. Was de cellen door delicate spoelen met steriele PBS. Zuig PBS en voorzichtig voeg 15-20 ml vers warm compleet DMEM medium en kweken cellen voor 3 tot 4 uur bij 37 ° C in 5% CO 2 om ze los te maken van de G1 / S-fase blok.
  4. Op dag 3 (vervolg): Na het loslaten van de cellen bij de G1 / S-fase blok voeg nocodazole tot een uiteindelijke concentratie van 100 ng / ml. Verdun nocodazole door toevoeging van 2 pl voorraadoplossing (5 mg / ml) tot 98ul van verse DMEM medium, en voeg 1 pl verdund nocodazole per elke ml van celkweek. Kweekcellen gedurende ongeveer 12 uur bij 37 ° C in 5% CO2. Dit zal de cellen in mitose blokkeren.

3. Mitotische Clusters Isolatie

  1. Op dag 4: Isoleer mitotische clusters. Met behulp van een helder veld microscopie, controleer dan of de meerderheid van de cellen mitotische. Indien minder dan 50% van de cellen mitotische wachten tot meer cellen bereiken mitose. Verzamel mitotische cellen door tikken krachtig aan de zijkant van de kolf (of bespuiten met de pipet), dit resterende mitotische cellen los. Breng de celsuspensie 50 ml conische centrifugebuizen.
    OPMERKING: Mitotische cellen rond en kan gemakkelijk worden losgemaakt van de kolf beneden (net zoals cellen na behandeling met trypsine), in tegenstelling tot andere cellen in de celcyclus fasen, die plat en stevig aan de kolf.
  2. Oogst mitotische cellen door het draaien van de buizen bij 1500 xg gedurende 10 min (476, C of kamertemperatuur) en verwijdering van het supernatant daarna. Resuspendeer de celpellet in 8 ml PBS, pool in een 50 ml conische centrifugebuis, vul de centrifugebuis met PBS en spin opnieuw voor 10 min bij 1500 x g. Herhaal deze wasprocedure drie keer in totaal.
  3. Vanaf nu voeren alle stappen op ijs met koude oplossingen. Krachtig resuspendeer de pellet in 37 ml koude oplossing II. Breng de suspensie aan een koude 40 ml glas-glas homogenisator met behulp van een 25 ml pipet en lyseren cellen op ijs door douncing met een strakke stamper tot mitotic clusters vrij zijn van cytoplasmatisch materiaal. Het aantal slagen is sterk afhankelijk van de digitonine voorraad en kan variëren van 3 tot 20 keer.
    OPMERKING: homogenisatie kunnen vrij krachtige, maar volledig moet worden overwogen bij bijna alle mitotische cellen worden gelyseerd en de clusters worden gezien vrij van cytoplasmatisch materiaal te zijn (zie 3.4).
  4. Na een paar slagen te mengen 5-10 ul van de celsuspensie 1: 2 met trypaanblauw en controleren door MICRoscopy in een Neubauer kamer. Wanneer de cellen worden gelyseerd chromatine is gekleurd blauw en vrij van celmembranen (NB: mogelijk cytoplasma restanten zal ophopen rond de blauw gekleurde chromatine en gemakkelijk te onderscheiden zal zijn).
    OPMERKING: Mitotische cellen lyseren voordat interfase cellen, maar toch oppassen niet te overdrijven homogenisering om besmetting met interfase kernen en verminkte chromatine vermijden.
  5. Onmiddellijk laag het gehele cellysaat via koude stapgradiënten (met 5 ml 60% colloïdale silicadeeltjes oplossing op de bodem, bedekt met 19,5 ml glycerol gradiënt oplossing elk) in vijf polycarbonaat centrifugatie buizen (28,8 x 107,0 mm, verdient het aanbeveling Plaats de buizen op ijs alvorens ze koelen) met een pipet 10 ml. Niet cellen blijven in oplossing II lang, dus is het raadzaam de buizen en het verloop bereiden vooraf (bijvoorbeeld tijdens de wasstappen).
  6. Centrifugeer de hellingen van 30 min bij 1000 xg bij 4 ° C in een vaste hoek rotor.
    OPMERKING: kernen en niet-gelyseerde cellen clusters samen gewonnen op het grensvlak van de glycerol en het colloïdale silicadeeltjes lagen.
  7. Verwijder de vloeistof boven de interfase met een pipet breng de rest aan de koude homogenisator. Re-massa te homo- mengsel van 3-15 slagen (wederom afhankelijk van de digitonine voorraad) met de krappe stamper om aggregaten te elimineren en cytoskelet vezels uit de clusters te verwijderen. Na elke paar slagen controleren van de efficiëntie van homogenisering. Meng 1 ul van het monster met 1 pl squash fix aangevuld met DAPI en onderzoek onder de fluorescentiemicroscoop.
    Opmerking: Het aantal slagen cruciaal is, de aanwezigheid van aggregaten cluster betekent dat het aantal slagen onvoldoende, terwijl verminkte chromatine en kernen puin geven aan dat de homogenisering te sterk.
  8. Verdeel de oplossing onder vier nieuwe polycarbonaat centrifugeren buizen (28,8 x107,0 mm) (ong. 10 ml oplossing per buis) en vul ze volledig met 60% colloïdale silicadeeltjes oplossing (ong. 30 ml colloïdale silicadeeltjes oplossing per buis).
    OPMERKING: Voorkom overbelasting van de colloïdale silicadeeltjes gradiënt aangezien clusters gemakkelijk kunnen worden gevangen als er teveel cytoplasmatische puin in de gradiënt.
  9. Spin gedurende 5 min bij 3000 xg, gevolgd door 30 min bij 45.440 xg bij 4 ° C in een vaste hoek rotor.
    Opmerking: Zoals voorheen zal interfase kernen de toegang tot de gradiënt (indien homogenisering niet te zwaar is uitgevoerd die kernen loskomt uit cytoplasmatisch materiaal) maar de clusters accumuleert ongeveer 1,5 cm vanaf de bodem van de buis, vaak als een losse bal gehouden.
  10. Verwijder de vloeistof boven de clusters met een pipet, zwembad de rest in één buis, resuspendeer goed en herverdelen twee polycarbonaat centrifugeren buizen (28,8 x 107,0 mm). Verdun de suspensie cluster 1: 4 met een oplossing III in elke buis en meng. Mark the plaats waren de pellet wordt en spin 1000 g gedurende 15 min bij 4 ° C in een vaste hoek rotor.
  11. Resuspendeer de pellets in Solution III, te bundelen in een 50 ml conische centrifugebuis en vul met Solution III. Centrifugeer op slechts 300 x g gedurende ongeveer 10 minuten. Niet centrifugeren bij hogere snelheid - is het misschien onomkeerbare aggregatie van clusters veroorzaken.
  12. Nawassen met oplossing III in 1,5 of 2 ml reageerbuisjes (resuspendeer de pellets en vul de buizen volledig up) en gecentrifugeerd bij 300 x g. Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet. Resuspendeer pellet voorzichtig in 250 ul cluster opslag buffer (als u meerdere pellets gebruiken 250 ul voor alles samen en bundelen hen). Verdunnen 5-10 ul van het monster 1: 2 met trypaanblauw en tellen mee in de Neubauer kamer. Eventueel meer verdund tot een concentratie van ongeveer 500 clusters / ul te verkrijgen.
  13. Duw de schorsing door een 100 micrometer cel zeef ervoor zorgen om cluster aggregatie verwijderens als gevolg van onjuiste resuspensie. De clusters kunnen worden bewaard maanden -80 ° C. Om te voorkomen dat meerdere opnieuw invriezen passende monsters en snap bevriezen in vloeibare stikstof.

4. Voorbereiding van de buffer voor interfase Xenopus laevis Egg Extract

OPMERKING: Xenopus laevis kikkers worden onderhouden en behandeld in overeenstemming met het bepaalde in het Verdrag van de Raad van Europa over de bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere doeleinden (EU geratificeerd in 1998) richtlijnen en voorschriften en de Duitse wet met betrekking tot het gebruik van gewervelde dieren bij onderzoek.

  1. Bereid DTT en een 100-voudige proteaseremmer mix volgens 1.2.3 en 1.2.4. Los cytochalasine B tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml in DMSO, aliquot (10 of 20 ul aanbevolen) en bewaar bij -20 ° C.
  2. Los cycloheximide tot een uiteindelijke concentratie van 20 mg / ml in ethanol, monster (500 plaanbevolen) en bewaar bij -20 ° C. Los het calcium ionofoor A23187 tot een eindconcentratie van 2 mg / ml in ethanol, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
    LET OP: PI, kan DTT, cytochalasine B, cycloheximide en A23187 herhaaldelijk worden ingevroren en ontdooid.
  3. Bereid 20x Mark's Modified Ringers buffer (BMR) met 2 M NaCl, 40 mM KCI, 20 mM MgCl2, 40 mM CaCl2, 2 mM EDTA en 100 mM Hepes, aan te passen pH tot 8,0 met 5 N KOH.
    LET OP: De 20x BMR kan over lange tijd worden bewaard bij kamertemperatuur. Afhankelijk van de hoeveelheid eieren, één bereiding van interfase ei extract 1 liter 1x MMR per geïnjecteerd kikker en een extra 5-10 liter voor de wasstappen nodig. Opnieuw instellen van de pH van 1x MMR tot 8,0 met 5 N KOH. 1x MMR bereid zijn om de kikkers in O houden / N x 1 moeten zijn bij RT. 1x MMR voorbereid voor de bereiding extract moet koud worden bewaard totdat het wordt gebruikt, maar het is niet essentieel voor het experiment dat 1x MMR echt koud.
  4. Bereid 1 liter sucnam buffer bevattende 250 mM sucrose, 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2 en 10 mM Hepes pH 7,5. Sucrosebuffer zou de dag worden bereid voor gebruik steriel water komt en bij 4 ° C bewaard.
  5. Bereid de dejellying oplossing pas op de ochtend van het experiment door het oplossen van 2% L-cysteïne in 0.25x MMR. Stel de pH tot 7,8 met 5 N KOH. Bewaar bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt.

5. Protocolfor interfase Xenopu s laevis Egg Extract

  1. Injecteren 120 IE drachtige merrie serum gonadotropin (PMSG) in de dorsale lymfe zak van elke kikker 3-10 dagen voor het experiment (5 ml spuiten, 27 G ¾ '' naalden).
    OPMERKING: Deze injectie zal de ovulatie opwekken. Het bedrag van de eieren een kikker legt varieert nogal. Een goed tot kikker kunnen produceren eieren bezetten een volume van maximaal 7 ml na de-jellynated wat overeenkomt met maximaal 3,5 ml ruw extract. Echter van mening dat sommige kikkers niet kunnen leggen of zal lay slechte eieren.
  2. Injecteer 500 IE humaan choriongonadotrofine (hCG) per kikker de avond vóór het experiment (5 ml injectiespuiten, 27G ¾ '' naalden). Dit zal het loslaten van de eieren te induceren. Houd de kikkers voor 13-17 uur bij 18 ° C in afzonderlijke tanks met 1,2 l 1x MMR (pH 8).
  3. Verzamel de eieren door ze gieten in 600-1000 ml glazen bekers.
    OPMERKING: Neem alleen de goede partijen eieren die individueel worden gelegd, vergelijkbaar in grootte en duidelijk gepigmenteerd met een donkere en een lichte gekleurde half. Heeft eieren die strings of die blik gezwollen en wit vormen geen rekening. Deze moeten worden geregeld gedurende de gehele procedure met een kunststof pasteurpipet. Voor een gedetailleerde beschrijving van goed versus slecht eieren zie Gillespie et al. 6
  4. Was eieren intensief, ongeveer 4 keer, met 1x MMR door decanteren van de bovenstaande vloeistof als de eieren zijn neergestreken en het bijvullen van de beker met verse buffer achteraf.
    LET OP: Deeieren stabiel voordat ze worden dejellynated en de wasbuffer kan direct worden aangebracht op de eieren.
  5. Dejellynate de eieren door incubatie in 2% cysteïne-oplossing. Veranderen buffer eenmaal na 2-4 min door decanteren van de buffer en zorgvuldig vullen van de beker met verse buffer. Considerdejellying voltooid wanneer het volume van de eieren drastisch afneemt en de eieren worden en meer dicht gepakt.
    OPMERKING: De dejellying moet ongeveer 5-7 minuten en moet worden gestopt wanneer zichtbaar, maar uiterlijk na 10 min.
  6. Was eieren ongeveer 4 keer met 1x MMR door decanteren en het vullen van de buffer supernatant.
    Opmerking: De eieren zijn kwetsbaarder na dejellynated en dus moeten de wasstappen zorgvuldiger gebeuren. De MMR dient eerder gespoeld aan de wand van het bekerglas in plaats van direct op de eieren.
  7. Activeren eieren in 100 ml 1 x MMR door toevoeging van 8 ul van de calciumionofoor (2 mg / ml in ethanol). Stop activering wanneer dier cap samentrekking zijnkomt zichtbare of na 10 minuten.
    NB: Het dier dop krimp kan worden geïdentificeerd door de verdichting van de zwarte helft van het ei.
  8. Was zorgvuldig 4 keer met 1x MMR door decanteren en het vullen van de buffer supernatant.
  9. Incubeer eieren voor 20 minuten in 1 x MMR bij kamertemperatuur.
  10. Bereid het centrifugeren buisjes gedurende de incubatietijd: Plaats 50 gl sucrose buffer, 50 ui 100-voudig proteaseremmer mix, 5 ui 1 M DTT, 12,5 pl cycloheximide (translatie te voorkomen, met name van cycline B) en 2,5 gl cytochalasine B (naar voorkomen dat actine polymerisatie) in 5 ml centrifugatie buizen (13 x 51 mm). Als alternatief, meer dan 30 ml van eieren, 14 ml buizen (14 x 95 mm) worden gebruikt, in dit geval verhoging volumes met 2,4 maal.
  11. Was de eieren tweemaal met koude sucrose buffer (hevel en bijvullen buffer in de glazen beker) en breng ze in centrifugeren buizen met een plastic Pasteur pipet met brede opening (afgesneden het smalle uiteinde).
  12. Pakeieren door spinnen gedurende 1 min bij 130 x g. Zet de tubes in 15 ml conische centrifugebuizen hiervoor (zet de 14 ml buizen in 50 ml conische centrifugebuizen, respectievelijk). Het doel is om zoveel buffer verwijderen mogelijk verdunning van het extract te voorkomen. Na het centrifugeren, verwijder overtollig buffer met een plastic Pasteur pipet en uiteindelijk te vullen meer eieren bovenop.
  13. Spin in een 6 x 5 ml swing rotor gedurende 20 min bij 21.000 xg bij 4 ° C.
  14. Verwijder lage snelheid extract met een spuit 5 ml van een 16 G 1 ½ '' naald tussen gele dooier bovenop en donkere gebroken ei puin in de bodem. Hiervoor drukt de naald door de wand van de centrifugebuis net boven de laag van gebroken eieren puin in de bodem. Houd de tube tegen een weerstand bij het duwen met de naald.
    LET OP: Een gevulde 5 ml centrifugebuis geeft tussen 1,8-2,5 ml extract.
  15. Per 1 ml extract voegen 10 pi 100-voudig proteaseremmer mix, 1 uivan 1 M DTT, 2,5 ui cycloheximide (20 mg / ml) en 0,5 pl cytochalasine B (10 mg / ml). Houd het extract op ijs.
    Opmerking: Het extract kan direct worden gebruikt voor experimenten of monsters verdeeld, snel bevroren en bewaard in vloeibare stikstof gedurende enkele maanden. Bevriezen van het extract zal haar activiteiten te verminderen. Voor delicate experimenten zoals immunodepletie is het sterk aanbevolen om verse extract onmiddellijk te gebruiken.

6. Bereiding van Buffers voor in vitro reconstitutie van chromatine decondensatie

  1. Bereid de energiemix voorraadoplossing van 25 mM ATP, 25 mM GTP, 127,5 mg / ml creatine fosfaat en 2,5 mg / ml creatine kinase in buffer bevattende 250 mM sucrose, 1,2 mM Hepes, 5,9 mM KCl en 0,3 mM MgCl2. Aliquot en bewaar bij -80 ° C. Gebruik vers na het ontdooien niet opnieuw invriezen.
  2. Ontbinding van 0,2 g / ml glycogeen in gedemineraliseerd water. Bewaren bij -20 ° C. Los 6-dimethyl- aminopurine (DMAP) tot een eindconcentratievan 0,25 M in DMSO. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. Gebruik vers na het ontdooien niet opnieuw invriezen.
  3. Bereid 30% (w / v) sucrose in PBS, filtreer en bewaar bij 4 ° C. Bereid 4% VikiFix oplossing met 80 mM PIPES pH 6,8, 1 mM MgCl2, 150 mM sucrose en 4% paraformaldehyde (PFA) (LET OP! Werken onder chemische kap, handschoenen en bescherming van de mond).
    LET OP: De PFA is moeilijk om dan op te lossen is het raadzaam om het te doen als volgt: Voor 1 l Viki-Fix lossen 24,2 g buizen en 40 g PFA in afzonderlijke bekers, zowel in heet (bijna kokend) gedemineraliseerd water. Beide zullen oplossen door de toevoeging van 10 N NaOH, maar wees voorzichtig om niet te veel toe te voegen. Voeg 51,4 ​​g sucrose en 1 ml 1 M MgCl2 het PFA oplossing. Voeg de PIPES oplossing van het andere mengsel. Vullen tot 1 l uiteindelijke volume en pH op neutraal door toevoeging van NaOH.
  4. Los 10 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in water (LET OP! Draag handschoenen). Opslaan inhet donker bij -20 ° C.

7. Protocol voor in vitro reconstitutie van chromatine decondensatie

  1. Spin lage snelheid interfase extract gedurende 12 min bij 386.000 xg in een vaste hoek van 20 x 0,2 ml of 355 000 xg in een 10 x 2,0 ml rotor.
  2. Verwijder voorzichtig de lipide laag bovenop met behulp van een vacuümpomp of een pipet en neem de supernatant (daarna genoemd hoge snelheid extract) vermijden membraan verontreiniging van de bodem laag en de pellet gooi.
    Opmerking: Om mogelijke membraan verontreiniging te verminderen is het raadzaam om het extract tweemaal draaien of het extract verdund met 20% van het volume sucrosebuffer vóór centrifugatie. Echter, verdunning en additionele centrifugatiestappen het extract activiteit te verminderen.
  3. Pipet 18 ul van hoge snelheid extract in een 1,5 ml reageerbuis, voeg 0,7 pl mitotische cluster (bedrag kan enigszins worden gevarieerd volgens chromatine voorraad concentratie), 0,5 pi glycogeen, 0,5 pienergiemix en 0,3 ui DMAP. Gebruik tips met brede opening aan het reactiemengsel zodra het chromatine wordt toegevoegd aan afschuiving van de decondensing chromatine voorkomen.
    Opmerking: De reactie kan in aanwezigheid of afwezigheid van membranen (zie figuur 3) worden uitgevoerd. Om chromatine decondenseren in aanwezigheid van membranen, voeg 2 pl dreven membranen bereid volgens de methode beschreven door Eisenhardt et al protocol. 16
  4. Incubeer het reactiemengsel gedurende maximaal 2 uur (of minder vroegere tijdstippen van het decondensatie te bestuderen) bij 20 ° C.
  5. Bevestig het monster door het toevoegen van ijskoude 0,5 ml Viki-Fix bevattende 0,5% glutaaraldehyde en 0,1 mg / ml DAPI en incubatie gedurende 20-30 minuten op ijs.
    Opmerking: Als de monsters verder worden verwerkt voor immunofluorescentie, dient de fixatie worden gedaan zonder glutaaraldehyde, die vaak interfereert met het antilichaam kleuring. Maar als alleen de DAPI kleuring worden geanalyseerd, het toevoegen van glutaraldehyde zal een mooiere chromatine structuur te behouden.
  6. Incubeer round dekglaasjes (diameter 12 mm) gedurende 5 min met poly-L-lysine oplossing voor de affiniteit van de dekglaasjes verhogen chromatine. Droog de dekglaasjes op filtreerpapier daarna.
  7. Monteer vlakbodem centrifugatie buizen (6 ml, 16/55 mm) door er de dekglaasjes met de beklede site naar boven op de bodem van de centrifugebuis. Voeg 800 ul van de 30% sucrose kussen en laag de vaste monster bovenop.
  8. Spin gedurende 15 min bij 2500 xg bij 4 ° C.
    LET OP: De vlakke bodem centrifugeren buisjes passen aan rotors die 15 ml conische centrifugebuizen nemen.
  9. Schenk de bovenstaande vloeistof, verwijder de dekglaasjes van de buizen door porren voorzichtig de onderkant van het centrifugeren buis met een 16 G 1 ½ '' injectienaald. Hiertoe tape het deksel van de naald en de naald zich samen op hun bodems en snijd de voorkant van het deksel, zodat de naald steekt ongeveer 3mm uit. Wanneer het dekglaasje wordt opgetild door de naald op een site, gebruiken pincet om het dekglaasje verwijderen.
  10. Snel was de dekglaasje door dompelen in gedemineraliseerd water, droog hem voorzichtig door het aanraken van zijn kant om een ​​papieren filter en plaats het op de microscoop dia op een daling van de montage media. Verzegelt het met nagellak, droog en in het donker te houden.
    Opmerking: De monsters zonder glutaraldehyde gefixeerd kan worden opgeslagen in PBS in een 24-wells plaat en vervolgens voor immunofluorescentie kleuring. Indien opgeslagen voor meerdere dagen, toe te voegen 0,05% natriumazide (LET OP! Draag handschoenen) aan de PBS om besmetting met bacteriën te voorkomen.
  11. Analyseer de monsters met fluorescentiemicroscopie van de DAPI signaal (via bijvoorbeeld een confocale microscoop met een 405 nm laser).

8. Voorbereiding van de buffer voor immunofluorescentiekleuring van In Vitro Gereconstitueerd decondensatie chromatine Samples

  1. Bereid PBS volgens 1.1.1. Los NH4Cl een vinAl concentratie van 50 mM in PBS. Bewaar deze oplossing bij 4 ° C. Los 5 ug / ml DAPI in PBS (vers bereiden). Voeg 0,1% Triton X-100 PBS. Bewaar bij 4 ° C. Bereid blokkeerbuffer vóór gebruik vers door verdunning 3% runderserumalbumine (BSA) in PBS + 0,1% Triton X-100.

9. Protocol voor immunofluorescentiekleuring van In Vitro Gereconstitueerd decondensatie chromatine Samples

NB. Alle volgende incubaties van de dekglaasjes worden gemaakt in een 24-wells plaat met minstens 250 ui oplossing per goed, als niet anders vermeld In vitro decondensed chromatine monsters zijn gevoeliger dan vaste cellen zijn daarom voorzichtig bij het ​​toevoegen of verwijderen van oplossingen. Het wordt aanbevolen om plastic Pasteur pipetten gebruiken gesneden hoekig. Voor was- en secundaire antilichaam incubatie plaats de plaat bij RT op schommelen of draaiend platform, niet sneller dan 100 toeren per minuut bewegen.

  1. Quench monsters door incubatie dekglaasjes met 1 ml NH4Cl in PBS gedurende 5 min. Block stalen door incuberen met 1 ml blokkeerbuffer gedurende minimaal 30 min.
  2. Monteer een vochtkast de incubatie met het primaire antilichaam: Zet een vochtige doekje op de bodem van een afsluitbare doos en het deksel van de 24-well plaat omgekeerd op het vochtige doekje. Plaats parafilm in het deksel en voeg 70 ul van de antilichaamoplossing per monster op de parafilm. Voor het antilichaam oplossing, verdunde antiserum of affiniteit gezuiverde antilichamen 1: 100 in blokkerende buffer.
  3. Plaats de dekglaasjes omgekeerd op de antilichaam-oplossing en incubeer ze gedurende 1-2 uur. Plaats de dekglaasjes naar de 24-well plaat met het monster naar boven en was monsters drie keer gedurende 10 minuten met 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS.
  4. Incubeer dekglaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in 250 pl fluorescent-gelabeld secundair antilichaam verdund in blockingbuffer concentratie aanbevolen door de fabrikant. Bescherming tegen licht. Was three tijden gedurende 10 min met 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS.
  5. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten met 1 ml van 5 ug / ml DAPI in PBS. Was driemaal gedurende 5 minuten met 1 ml 0,1% Triton X-100 in PBS.
  6. Snel was de dekglaasje door dompelen in gedemineraliseerd water, droog hem voorzichtig door het aanraken van zijn kant om een ​​papieren filter en plaats het op de microscoop dia op de top van een daling van de montage media. Verzegelt het met nagellak, droog en houden bij 4 ° C in het donker tot gebruik. Analyseer de monsters door fluorescentiemicroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Tijd afhankelijkheid van de decondensatie reactie

Figuur 1 toont een typisch tijdsverloop van de decondensatie assay. De cluster chromosomen zichtbaar aan het begin van de reactie decondenses en overgaat in een enkele, rond en glad kern. Als het ei extract wordt vervangen door sucrosebuffer het chromosoom cluster blijft gecondenseerd, die suggereren dat decondensatie activiteit aanwezig in het ei extract.

Chromatine decondensatie is een energie a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Xenopus laevis ei extracten zijn een zeer nuttig instrument om getrouw weer cellulaire processen in vitro en dit systeem werd met succes gebruikt in de karakterisering van de celcyclus en celdeling gebeurtenissen 2, 3,5,6,17. Door grote winkels nucleaire componenten afgezonderd in het ei tijdens oögenese, ei-extracten zijn een uitstekende bron van cellulaire componenten. Vergeleken met andere benaderingen, zoals RNAi op zoogdierweefsel cellijnen of genetische manipulatie, het een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation en de ERC (AN377 / 3-2 en 309.528 CHROMDECON om WA) en een PhD Fellowship van de Boehringer Ingelheim Fonds om AKS figuur 1 & 2 worden herdrukt van Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., RuvB-achtige ATPasen functie in chromatine decondensatie aan het einde van de mitose, 305-318, 2014, met toestemming van Elsevier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
spermine tetrahydrochlorideFluka analytical85610-25G
spermidine trihydrochlorideSigma S2501-5G
high-purity digitoninMillipore300410-1GMtoxisch
PMSFApplichemA0999,0100toxisch
thymidineCalbiochem6060
nocodazoleCalbiochem487928toxisch
37% formaldehyde solutionRoth7398-1toxisch
trypan blue solution (0.4%)SigmaT8154toxisch
1,4-dithiothreitol (DTT)Roth6908.2
AEBSF hydrochlorideApplichemA1421,0001
pepstatinRoth2936.1/2/3
leupeptinRothCN334
aprotininRothA162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)GE Healthcare17-0891-01
glutamineGibco25030-024
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
75 cm² tissue culture flasksGreiner Bio-one658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)Gibco10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)Wheaton357546
Neubauer chamberAssistent441/1
 Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)Nalgene3118-0050
100 µm cell strainer, nylonBD Falcon352360
cytochalasin BApplichemA7657,0010toxisch
cycloheximideRoth8682.3toxisch
L-cysteinMerck1,028,381,000
hCG available as OvogestMSD1431593
PMSG available as IntergonanMSD1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)EnzoALX-450-002-M010toxisch
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")Braun4665120
ATPServa10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20RothK056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium saltCalbiochem2380
creatine phosphokinaseSigmaC3755-35KU
DMAPSigmaD2629-1G
DAPI Roche10236276001
PFASigmaP-6148toxisch
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)Beckman Coulter343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)Biozym729065
50% glutaraldehyde solution, grade ISigma alderichG7651-10 mltoxisch
0.1% (w/v) poly-L-lysine solutionSigmaP8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)Greiner Bio-one145211
Vectashield mounting mediumVector laboratoriesH1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)Beckman Coulter343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)Biozym729055
12 mm coverslipsThermo Scientific0784 #1

Referenties

  1. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  2. de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
  3. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  4. Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
  5. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  6. Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
  7. Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
  8. Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
  9. Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
  10. Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
  11. Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
  12. Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
  13. Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
  14. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
  15. Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
  16. Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
  17. Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
  18. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  19. Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
  20. Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
  21. Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
  22. Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
  23. Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
  24. Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Mitotische uittredingXenopus-eiextractmitotische chromatineclustersHeLa-cellenherassemblage van de kernenvelophogesnelheidsextractcentrifugatie op sucrosekussenparaformaldehydefixatie
Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.