Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix. Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen. Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Men neemt aan dat de invasieve aard van kankercellijnen correleert met hun metastatisch potentieel. De meeste traditionele testen bekijken deze invasieve kenmerken echter niet in een driedimensionale omgeving en de resulterende gegevens lijden onder verminderde biologische toepasbaarheid. Hier wordt een benadering gepresenteerd om de invasieve capaciteit van cellijnen te visualiseren in een fysiologisch relevante omgeving. De kankercelsferoïde-invasietest maakt eerst gebruik van de zwaartekracht om sféroïden te genereren in druppels media die aan de deksel van een celcultuurschaal hangen. Vervolgens worden deze sféroïden ingebed in een 3D-matrix die bestaat uit een mengsel van basement membraanmaterialen en type I collageen. Vervolgens wordt de emigratie van kankercellen uit de sféroïden in de omringende matrix in de loop van de tijd gemonitord. De hier beschreven methode kan worden aangepast om invasie te onderzoeken na co-cultuur van verschillende celtypen, inclusief geneesmiddelen/remmers of veranderingen in extracellulaire matrix (ECM) bestanddelen.
Inleiding
Er is vastgesteld dat de kankercel beweeglijkheid is voorspellend voor metastatische potentieel, gezien het feit dat dergelijk gedrag vergemakkelijkt invasie door het basaal membraan en de toegang tot de bloedsomloop 1. Het meeste onderzoek op motiliteit is gericht op hoe cellen gedragen in een tweedimensionale omgeving (2D), maar het wordt algemeen erkend dat de beweging van cellen in een driedimensionale (3D) matrix representatiever hoe deze zelfde cellen ook daadwerkelijk gedragen in vivo 2. 3D-cultuur systemen worden steeds meer gebruikt om cellulaire gedragingen die variëren van cel morfologie, om de groei kinetiek en drugs gevoeligheid 3 bestuderen. De wens om te controleren kankercel invasie in het kader van een 3D milieu heeft geleid tot de synthese van de eerder vastgestelde technieken waarbij het genereren van 3D celaggregaten (sferoïden) via de hangende druppel kweekmethode 4, gevolgd door het inbedden van deze bolletjes in een 3D extracellulair matrix (ECM), bestaande uit collageen en basaal membraan materialen 5. Deze methode beoogt een verbetering van de eerder bestaande technieken door een gestroomlijnde benadering die gemakkelijk kan worden gebruikt voor invasie vergelijken onder verschillende experimentele omstandigheden.
Meer traditionele manieren om celbeweeglijkheid beoordelen in vitro zijn de scratch wond test en de transwell assay 6. Eerstgenoemde assay toont celbeweeglijkheid in een 2D omgeving en dus onafhankelijk van een verscheidenheid aan functies essentieel voor in vivo invasie, bijvoorbeeld protease-activiteit 7. De transwell test kan beter model celinvasie wanneer de put inzetstukken bekleed met ECM substraten, maar slechts één parameter, namelijk het verschijnen van cellen op de tegenoverliggende membraanoppervlak wordt gemeten, en veel nuances van celinvasie dus niet gemakkelijk waarneembare. In tegenstelling tot deze technieken de kankercel sferoïde invasie assay (figuur 1 </ strong>) maakt het real-time monitoring van celinvasie in een omgeving die niet alleen fysiologisch relevant, maar maakt ook belangrijk cellijn-specifieke functies worden gevisualiseerd, zoals individuele versus collectieve celmigratie 8. Deze methode biedt ook voordelen ten opzichte van standaard 3D groei cultuur assays. De generatie van cellulaire aggregaten via de opknoping neerzetten aanvankelijk dwingt cel beweging, zodat de cellen worden gestimuleerd om binnen te vallen nadat deze beperking is opgeheven. Bovendien, zodra deze beperking is opgeheven, zal cel uitgang overgaan in een uniforme richting die dan gemakkelijk kan worden gekwantificeerd.
De meest populaire ECM materialen voor kankercel sferoïden assays Matrigel en type I collageen, waarbij elk van deze componenten heeft belangrijke en duidelijke rol bij het beïnvloeden metastatisch gedrag. Matrigel is een afgescheiden mengsel van eiwitten geproduceerd door Engelbreth-Holm Swarm muizen sarcoma-cellen en is verrijkt in basement membraaneiwitten zoals laminine, entactine, en collageen type IV 9. Daarom Matrigel wordt voortaan aangeduid als "basale membraan materiaal." Deze basaalmembraan materialen essentiële liganden die nodig zijn voor integrine adhesie tijdens kankercel invasie 10 naast vele andere eiwitten die een reeks effecten uitoefenen op celgedrag 11. In vergelijking, type I collageen, gewoonlijk bereid uit zuur digesties van pezen en andere dichte collagene structuren 12, is een veel eenvoudigere matrixmateriaal dat dient als een belangrijk structureel element van het bindweefsel stroma en ondersteunende weefsels en organen van het lichaam. Het is aangetoond dat de fysische eigenschappen van collageen een aantal kenmerken van celmotiliteit kan reguleren; bijvoorbeeld de aanpassing van de collageenvezels in het tumor-stroma-interface maakt kankercellen vervolgens migreren langs de fibrillen bij invasie in de stroma 13. In de test hier gepresenteerde zowel type I collageen en basaalmembraan materialen worden gebruikt als instrumenten om 3D kankercel-stroma interacties te bestuderen.
Het effect van remming of stimulatie van paden die bepalen invasie kunnen worden gecontroleerd nadat de cellen zijn ingebed in de 3D-matrix. Cellen kunnen worden voorbehandeld tijdens de groei in de hangende druppels of bij overdracht naar de 3D-kweek, afhankelijk of een langdurige behandeling vereist invasie moduleren. Voor kortere behandelingen, wordt aanbevolen dat het geneesmiddel wordt gemengd met de suspensie sferoïde na het verzamelen en de media die rond de 3D culturen adequate blootstelling aan het geneesmiddel aan de cellen te vergemakkelijken. Vervolgens kan normaal of tumorgeassocieerde stromale cellen worden gemengd met het matrixmateriaal om hun rol bij het moduleren van tumorcel invasie te evalueren of te bepalen hoe paracriene en autocriene signalering invloeden celgedrag. Dit idee werd aangetoond in een studie waarin de co-cultuur van de colop kanker en endotheelcellen in opknoping daalt tot een vasculaire netwerk binnen de sferoïden 14. Tenslotte kan de ECM bestanddelen worden veranderd, zoals kankercel invasie wordt beïnvloed door verschillende substraten 15. Werkwijze Onderstaande zal dus een kader voor de beoordeling kankercel invasie onder verschillende omstandigheden. In het algemeen werd gevonden dat niet alle cellijnen sferoïden creëren in de opknoping druppels en-epitheliale uit cellijnen meestal regelmatige bollen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Generatie van Sferoïden
- Bereid eencellige suspensie voor opknoping druppel kweken van los hechtende kanker celculturen van ~ 70% confluentie met een PBS wassen, gevolgd door blootstelling aan 0,05% trypsine-EDTA-oplossing.
- Neutraliseer de trypsine oplossing celkweek media en tel de cellen met een bekende hoeveelheid van de celsuspensie. Opmerking: De specifieke celkweek media is afhankelijk van de cellijn worden getest. Volg ATCC media aanbevelingen, waarbij de celkweek media is meestal DMEM + 10% FBS. Meer informatie kunt u vinden in de Materials tabel.
- Voer een verdunning mogelijk te maken voor het zaaien van 500-1.000 cellen per 20 ul druppel van media voor celkweek.
- Verwerven 10 cm schaal en voeg 5 ml steriel PBS onderaan. Opmerking: Deze stap beschermt de hangende druppels uit verdamping. Goedkopere "bacteriologische kwaliteit" gerechten kan worden gebruikt in plaats van celkweekniveau gerechten, cellen niet conthandelen van de cultuur oppervlak.
- Gebruik een multi-channel pipet 20 ul druppels van de verdunde celsuspensie dragen aan het binnenoppervlak van het deksel.
- Pipet 40 druppels (5 rijen 8 druppels) op het deksel van de 10 cm schaal.
- Keer de deksel en plaats over de cultuur schotel. Incubeer de opknoping druppel kweken bij 37 ° C gedurende 72 uur tot sferoïden genereren.
- Klap het deksel in een zelfverzekerde, maar gecontroleerde manier. Opmerking: omkeren het deksel te snel of te langzaam kan de druppels te verschuiven. Sommige cellijnen kunnen sferoïden in 48 uur of minder te vormen, terwijl andere meer dan 72 uur nodig om compacte aggregaten.
2. Inbedding van Sferoïden in 3D Matrix
- Dooi een hoeveelheid groeifactor verminderde basaalmembraan materialen bij 4 ° C overnacht voor inbedden van de sferoïden.
- Optioneel: Layer putten met ECM vooraf aan potentiële sferoïde interactie met het weefsel cultu voorkomenre oppervlak.
- Pipetteer 200 ul van ECM per well op een 24-wells plaat.
- Tilt de plaat zodat de ECM bedekt het gehele oppervlak goed.
- Verwijder overtollige ECM voorzichtig met een pipet.
- Incubeer de plaat tot de putjes droog: 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Optioneel: Layer putten met ECM vooraf aan potentiële sferoïde interactie met het weefsel cultu voorkomenre oppervlak.
- Verzamel de sferoïden door het kantelen van het deksel van de weefselkweekplaat en samenbrengen van de media. Breng de media met bolletjes in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Laat 10 min voor de bolvormige deeltjes bezinken op de bodem van de microcentrifugebuis. Sferoïden moet zichtbaar met het blote oog.
- Meng 100 ul van het basaal membraan materiaal met 100 pl koude (4 ° C) type I collageen in een afzonderlijke vooraf gekoelde buis. Laat het mengsel bij 4 ° C ofwel gel voorkomen voortijdig stollen.
- Gebruik pre-gekoelde pipet tips als het overbrengen van kleine volumes.
- Geef voorzichtig bijmengen van de basale membraan materialen en collageen type I te luchtbelvorming voorkomen. Let op: Luchtbellen kunnen imaging later belemmeren in het protocol als ze ingebed in de gel.
- Zuig het sferoïden van 40 ul bodemgedeelte van de microcentrifugebuis en combineren met het basaal membraan materiaal / type I collageen mengsel. Wees voorzichtig om de vorming van luchtbellen bij het mengen te voorkomen. Opmerking: De oplossing bevat van 100 gl basaalmembraan materialen, 100 ul collageen Type I en 40 pl van de sferoïden genoeg materiaal te maken voor 4 onafhankelijke 3D culturen. Dit kan worden opgeschaald of omlaag.
- Pipetteer 40 ul druppels van de viskeuze mengsel in de centra van putten op een 24-wells plaat. Laat de plaat vlak te voorkomen dat het mengsel wordt uitgevoerd in de zijkant van de put. Opmerking: Een enkele kolom op de 24-well plate - 4 wells - wordt aanbevolen voor elke conditie te testen.
- Plaats de plaat into een 37 ° C incubator en laat ongestoord gedurende 30 min. De 3D cultuur polymeriseren in deze periode.
- Langzaam onderdompelen 3D culturen in 1 ml van media voor celkweek.
- Zorg ervoor dat de media is warm bij het toevoegen van het in de putten verder te bevorderen gel polymerisatie.
- Kritische stap: voeg voorzichtig de media om de 3D-culturen. Pipetteren de media te snel in de putten kan leiden tot onthechting van de 3D culturen uit de weefselkweek oppervlak.
3. Toezicht en analyseren Sferoïde Invasion
- Afbeelding invasie van de bolvormige deeltjes in de omringende 3D matrix op tijdstippen bepaald door de onderzoeker. Verwerven van foto's met behulp van een omgekeerde microscoop met 20x objectief. Opmerking: Ideale tijdstippen zal verschillen, afhankelijk van de cellijn wordt getest. Meer invasieve cellijnen hun uittreden uit de sferoïden kort na plating beginnen en derhalve neemt aanvankelijk fotos binnen een paar uur na plating. Over het algemeen worden foto's genomen op 0 uur (na plating), 24 uur en 48 uur. Invasie concludeert meestal 24 tot 48 uur na plating.
- Kwantificeren invasieve vermogen met behulp van beeldanalyse-software zoals Image J.
- Analyseer invasie als de cel afstand van de rand van de sferoïde.
- Gebruik de straight draw Tool om de straal en / of maximale invasieve afstand te markeren.
- Klik op "Analyseren" in het bovenste menu en klik vervolgens op "Measure" om de lengtemeting te geven.
- Analyseer invasie als de totale invasieve gebied buiten de sferoïde.
- Gebruik de Freehand Draw Tool om de grens van de bolvormige en / of invasieve totale oppervlakte traceren.
- Klik op "Analyseren" in het bovenste menu en klik vervolgens op "Measure" om het gebied te meten geven.
- Gebruik een plugin zoals ROI Manager Tools om de metingen te maken voor een stapel foto's.
- Analyseer invasie als de cel afstand van de rand van de sferoïde.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De sferoïde invasie assay (figuur 1), een paneel van kankercellijnen getest op hun vermogen om sferoïden, alsmede het aantal cellen uitgang vertoonde na implantatie in een 3D matrix bestaande uit kelder membraanmaterialen en type I collageen te vormen (Tabel 1). Deze resultaten tonen aan dat niet elke kanker cellijn zal goed gevormde bolvormige deeltjes, waarbij cellijnen bezitten een epitheliale morfologie in vitro neiging om regelmatige en soepele aggregaten maken. Het vermog...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie evalueerde de uitvoering van een paneel van kankercellijnen in een sferoïde invasie assay (Tabel 1). In het algemeen vinden we dat bolvormige formatie wordt versterkt in de meer-epitheliale uit cellijnen, waarbij de aanwezigheid van cel-cel contacten bevordert de vorming van een sferoïde-achtige architectuur. Bekende cellijnen die een epitheliale-mesenchymale overgang hebben ondergaan, zoals MDA-MB-231-cellen niet sferoïden in de hangende druppel cultuur waarschijnlijk vormen vanwege hun ger...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Ondersteund door NIH subsidies P30 CA051008 en T32 CA009686 (ATR).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
Referenties
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
