Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van steeds onoplosbaarder/geaggregeerd alfa-synucleïne (α-syn) uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Door het gebruik van buffers met toenemende detergentsterkte en hoogsnelheids ultracentrifugeringstechnieken, kunnen de variabele eigenschappen van α-syn-aggregatie in zieke en niet-zieke weefsel worden onderzocht.

Abstract

Alfa-synucleïne (α-syn) eiwit wordt overvloedig tot expressie hoofdzakelijk in neuronen, en bestaat in verschillende vormen - monomeren, tetrameren, oligomeren en fibrillen. Tijdens ziekte, α-syn conformationele veranderingen ondergaat oligomeren en hoogmoleculaire aggregaten molecuulgewicht die de neiging hebben het eiwit meer onoplosbaar te vormen. Abnormaal geaggregeerde α-syn is een neuropathologisch kenmerk van de ziekte van Parkinson (PD), dementie met Lewy bodies (DLB) en meerdere systeem atrofie (MSA). Biochemische karakterisering en analyse van onoplosbare α-syn gebruiken buffers met toenemende detergent sterkte en high-speed ultracentrifugatie een krachtig instrument voor de ontwikkeling van α-syn pathologie geassocieerd met de progressie van de ziekte te bepalen. Dit protocol beschrijft de isolatie van steeds onoplosbaar / geaggregeerde α-syn uit post-mortem menselijk hersenweefsel. Deze methode kan worden aangepast met modificaties studies van normale en abnormale α-syn biologie in transgene diermodellen herbergen verschillende α-syn mutaties en andere neurodegeneratieve ziekten die afwijkende fibrillaire afzettingen van eiwitten in verband met hun functie pathologieën.

Introduction

Een van de belangrijkste pathologische kenmerken die bij verschillende neurodegeneratieve ziekten is de vorming van abnormale proteïneaggregaten die voorkomt in een eiwit / ziektespecifieke manier ^1. Er zijn dus de karakteristieke extraneuronale amyloid-beta plaques en geaggregeerde hypergefosforyleerd tau afzettingen in neuronen bij de ziekte van Alzheimer (AD); de geaggregeerde α-syn afzettingen in Lewy Bodies (LBS), die intraneuronale insluitsels zijn, en ook binnen dystrofische neuronale processen genaamd Lewy neurieten (LNS) in PD, PD dementie en dementie met Lewy bodies (DLBs) ^2-4. Abnormale α-syn deposito's zijn ook te zien in het keurmerk laesies van gliale cytoplasmatische inclusies in MSA ^5. Bij de ziekte van Huntington, zijn er de karakteristieke Poly-Q deposito's, en abnormale Tar DNA-bindend eiwit-43 en gesmolten in sarcoom eiwitten (FUS) worden gedeponeerd in frontotemporale dementie. Belangrijk voor PD, hebben α-syn genmutaties gevonden om cause autosomaal dominant PD ^11/06. Bovendien, α-syn gen verdrievoudigen ¹² en dubbel ¹³ veroorzaakt ook familiale PD aldus verhoogde α-syn expressie die linken naar de pathomechanismen van PD. Met name, zowel sporadische en familiale PD gevallen haven abnormale afzettingen van α-syn pathologie ^14. De huidige beschikbare behandelingen voor PD zijn alleen palliatief en hebben geen effect op het stoppen of vertragen van de onverbiddelijke progressie van de ziekte.

α-syn wordt overvloedig tot expressie gebracht in de menselijke hersenen en maakt ongeveer 1% van het totale eiwit hersenen. Het is aanwezig in het bijzonder binnen de neuronen, maar kunnen zij het in geringere hoeveelheden binnen gliacellen bestaan. Een omstreden punt is de natieve structuur van α-syn dat kan voorkomen als willekeurig monomeer ¹⁵ of ¹⁶ gevouwen tetrameer. Tijdens ziekte, α-syn verandert de conformatie die het mogelijk maakt om misfolded krijgen en dit proces wordt aangenomen dat de oorzaak van de ziekte te pathogeNesis. Ondanks een aantal jaren van onderzoek naar de pathofysiologische aspecten van α-syn en ziekte, hebben de precieze oorzaken van de ziekte mechanismen ongrijpbaar ¹⁴ gebleven.

Studies met behulp post-mortem analyse van Parkinson hersenen tot dusver ontvangen belangrijke aanwijzingen betreffende de normale en abnormale biologie van α-syn zowel sporadische PD en ook Pd geassocieerd met mutaties in de LRRK2 gen ^17-22. Hier is een biochemische extractie protocol (zie schema in figuur 1) naar steeds onoplosbaar α-syn afzettingen uit menselijke post-mortem hersenweefsel PD α-syn aggregaten herbergen verschillende mate beschreven. Deze techniek kan ook worden aangepast met modificaties in buffer samenstellingen geaggregeerde eiwitten van andere neurodegeneratieve ziekten ^23,24 bestuderen en ook van de hersenen transgeen dier weefsel ^25-27. De belangrijkste overweging voor de aanpassingen zijn de verschillen in solubiteit en de totale hoeveelheden van de respectieve eiwitten waarvan sommige voornamelijk nucleaire en kunnen hoog-zout buffers nodig voor optimale extractie getoond FUS ^28.

Protocol

Post-mortem hersenweefsel werd geschonken aan Queen Square Brain Bank voor neurologische aandoeningen, University College London, Instituut voor Neurologie gebruik ethisch goedgekeurde protocollen en opgeslagen voor onderzoek onder een vergunning van het menselijk weefsel autoriteit (HTA) Groot-Brittannië (nr. 12198). Zie de lijst van de gevallen gebruikt voor dit protocol (Tabel 1).

1. Bereiding van Buffers

1. Bereid 1X TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing) buffer:
   1. Bereid 10X TBS als voorraadoplossing met 500 mM Tris-HCl pH 7,4 en 1500 mM NaCl.
      1. Weeg 60,5 g Tris-Cl pH 7,6 en 87,6 g NaCl in 800 ml zuiver water. Stel de pH met 1 M HCl en de uiteindelijke voorraad volume tot 1 L.
   2. Bereid de uiteindelijke concentratie van 1X TBS door verdunning van de stock 10 keer in gedestilleerd water.
   3. Voeg proteaseremmers (PI), (1 tablet per 50 ml buffer) en Phos-stop fosfataseremmer tabletten (1 tablet per 10 ml buffer) aantrekt hij de effecten van niet-specifieke enzymatische werking van proteasen en fosfatasen.
      Opmerking: Hier hebben we het enzym remmer tabletten uit Roche maar ook andere commercieel verkrijgbare remmers kunnen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant gebruikt.
2. Bereid TBS-SDS-buffer door het toevoegen van 5% g / v natrium dodecyl sulfaat (SDS) aan 1X TBS (pH 7,4) buffer. Verwarm de oplossing tot 60 ° C onder constant roeren met een magnetische roerder te solubiliseren SDS.
3. Bereid TBS-SDS-ureum buffer door ureum toe te voegen tot een eindconcentratie van 8 M w / v tot 1X TBS-SDS-buffer (pH 7,4). Verwarm de oplossing tot 60 ° C onder constant roeren op een magnetische roerder ureum lossen.

2. Steekproef homogenisering en Differential Ultracentrifugatie

Opmerking: De volgende deel van het werk omvat de behandeling van het menselijk hersenweefsel volgens de regels van de HTA UK. Lokale standaard operationele procedures worden gevolgd op alle times. Brain monsters worden ontleed uit bevroren hersenen blokkeert en weefsel materiaal gehomogeniseerd in een microcabinet gehandhaafd op negatieve druk. Wegwerp jassen handschoenen, face-maskers, over-schoen beschermers en een veiligheidsbril worden gedragen tijdens de gehele procedure. Menselijk weefsel afval wordt na autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten voor een veilige verwijdering weggegooid. Sharps (scalpelmesjes) worden aangebracht in een daarvoor bestemde container voor insluiting en veilige verwijdering.

1. Neem een stuk van bevroren menselijk weefsel (ongeveer 0,5 g gewicht van de basale ganglia regio) en snel gehakt in kleine fragmenten (ongeveer 1 mm ²⁾ op het ijs met een kleine petrischaal en een steriel scalpel. Gebruik een afzonderlijke petrischaal en scalpel voor elk monster. Verzamel de gemalen weefsel in een 15 ml buis en voeg 10 volumina ijskoude 1XTBS buffer aan de buis.
2. Homogeniseer de monsters onder toepassing van een mechanische homogenisator bij 20000 rpm gedurende 10 sec. Koelen op ijs gedurende 2 minuten. Herhaal deze stap drie keers.
   Opmerking: Dit wordt gedaan zodat de monsters niet worden opgewarmd onder homogeniseren.
3. Verhelderen door centrifugering bij 1000 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Gooi pellet van niet-gehomogeniseerde materiaal.
4. Neem supernatant (ruw homogenaat), toe te voegen aan centrifugebuizen (grootte van de buis hangt af van de grootte van de rotor) polycarbonaat en het evenwicht zorgvuldig. Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C.
5. Bewaar bovenstaande vloeistof aangezien dit de TBS-oplosbare fractie.
6. Was de pellet twee keer in vijf volumes 1X TBS buffer en centrifugeer telkens bij 100.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Gooi de supernatanten.
   1. Resuspendeer de uiteindelijke pellet door sonicatie de pellet gedurende 10 sec bij 20 KHz ongeveer 5 volumes 1X TBS-SDS bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Voor toevoeging van de SDS bevattende buffer monsters bij 10 ° C worden gebracht VIB neerslaan te voorkomen.
   2. Ultracentrifuge bij 100.000 xg gedurende 30 min bij 25 ° C.
7. Bewaar bovenstaande vloeistof aangezien dit the SDS oplosbare fractie.
   1. Was pellet tweemaal in 5 volumes 1X TBS-SDS-buffer bij kamertemperatuur. Centrifugeer telkens bij 100.000 xg gedurende 15 min bij 25 ° C.
   2. Oplosbaar de uiteindelijke pellet in 50 pl 1X TBS-SDS-buffer UREUM met een sonicator ingesteld op 20 kHz gedurende 10 seconden om volledige solubilisatie bereiken; Dit wordt genoemd het ureum oplosbare fractie.
8. Testen elke fractie voor totale eiwitgehalte onder toepassing van een commercieel eiwit assay kit volgens protocol van de fabrikant. Verdun TBS-SDS-ureum monsters 1: 1 met 1X TBS buffer verenigbaarheid met proteïne assay reagens mogelijk maken. Freeze monsters in kleine porties (20 pl) bij -80 ° C aan vries-dooi cycli verminderen.
   Opmerking: Het toevoegen van 10% glycerol monsters wordt aanbevolen voor langdurige opslag bij -80 ° C.

3. Immunoblotting van monsters en het analyseren van resultaten

1. Lopen monsters van TBS, TBS-SDS en TBS-SDS-Urea extracten op 10-put 4-12% Bis-Tris polyacrylamidegelmet MOPS als loopbuffer met standaardtechnieken. Zie Gallagher en Chakravarti (2008) ^{29 voor} een gedetailleerde western blot protocol.
2. Belasting 10 ug eiwit uit elk monster in elke rij met een molecuulgewicht marker voor TBS en SDS en ureum fracties.
3. Run gel bij 200 V gedurende 1 uur of totdat de blauwe kleurstof uit laadbuffer heeft de bodem van de gel bereikte.
4. Transfer van eiwitten gels elektroforetisch naar nylon membranen ^28, eerst in 100% methanol en daarna vooraf bevochtigd in overdrachtbuffer bevattende 20% methanol. Geef een identificatiemerkteken op de blot om het eiwit kant en de oriëntatie van het molecuulgewicht size markers.
   1. Sandwich de gel met het membraan langs natte papieren filter. Correcte plaatsing van het membraan essentieel met het membraan tussen de gel en de anode. Voer de transfer voor 2 uur bij 40 V.
   2. Make up 1X PBS-tween (1X PBS-T) buffer: Los 1 tablet van PBS in 200 mlwater 0,01 M fosfaatbuffer, 0,0027 M kaliumchloride en 0,137 M natriumchloride, pH 7,4 verkregen.
   3. Blokkeer het membraan in 5% BSA-oplossing in 1 x PBS-T gedurende 30 min met schudden bij 70 rpm. Dit voorkomt niet-specifieke binding van primair antilichaam aan het membraan.
5. Probe het eiwit blot met 6 ml α-syn primair antilichaam Syn-1 (BD Biosciences, muis monoklonaal antilichaam) bij 1: 750 verdunning (O / N bij 4 ° C), gevolgd door een reeks wassingen met 1 x PBS-T ( 3 x 5 min per keer) ^28.
6. Incubeer de vlek met de geschikte HRP geconjugeerd secundair antilichaam bij 1: 2000 verdunning gedurende 30 min. Voer een reeks wassingen (3 x 5 min per keer) met 1 x PBS-T.
   1. Dompel blots in versterkte chemiluminescentie oplossing 15 seconden in een donkere kamer. Cover vlekken met een plastic folie en plaats autoradiografie films tegen de vlek met eiwit kant naar boven in een lichtdichte cassette naar de juiste signalen (juiste grootte bands) vast te leggen.
   2. Ontwikkelen autoradiografie films in een geautomatiseerd ontwikkelaar.
      Opmerking: Vlekken kunnen ook handmatig worden ontwikkeld met behulp van ontwikkelaar en fixeer van een commerciële bron in het geval van een automatische ontwikkelaar machine is niet beschikbaar.
7. Incubeer de western blot met 6 ml van western blot strippen buffer gedurende 10 min met een constante schudden om de vlek van α-syn antilichaam signaal strippen. Volg de stappen 3.43 tot en met 3.6.2 met behulp van beta-actine primaire antilichaam (muis monoklonaal) op 1: 8000 verdunning.
8. Scannen en converteren van de laatste afbeelding in een Tiff beeld en de maatregel dichtheden met behulp van NIH ImageJ voor kwantificering doeleinden (een gratis te downloaden software).
   Opmerking: De software maakt het lezen van dichtheden van relatieve interessegebied (de juiste grootte groepen) en de gegevens worden uitgedrukt als een verhouding van α-syn density / β-actine (a-huishoudgen gen) als willekeurige eenheden of zijn recht wanneer een huishoudpersoneel gen niet geldig (zoals in het geval van ureum oplosbare samples).

Results

TBS, SDS en ureum oplosbare eiwitten geëxtraheerd uit basale ganglia overeenkomstig de in figuur 1 protocol werden op gels en immunoblotting met de Syn-1 monoklonaal α-syn primair antilichaam. De TBS oplosbare fracties toonde de aanwezigheid van monomere α-syn (~ 14 kDa) in de PD en controle onderzochte gevallen (figuur 2A). De SDS oplosbare fracties toonden ook overvloedig monomere α-syn in alle drie subtypen gevallen bestudeerd als weergegeven in de lage belichting blot (figuur 2C). De PD gevallen bleek ook hoger molecuulgewicht (MW) α-syn soorten gezien op de hoge blootstelling blot, die waarschijnlijk oligomeren (figuur 2C) te zijn. De ureum oplosbare fracties uit PD gevallen vertoonden verhoogde hoeveelheden van α-syn monomeren, oligomeren en geaggregeerde species vergeleken met gevallen beheersen. De neocorticale idiopathische PD gevallen demonstreren hogere hoeveelheden aggreg ated α-syn soorten, terwijl het limbische gevallen tonen tussenliggende niveaus van onoplosbare α-syn. Zowel de SDS en ureum fracties uit idiopathische PD gevallen demonstreren variabele niveaus van afgeknotte α-syn producten bij 12 kDa en 6 kDa zoals beschreven ^20. Daarentegen vertoonde de controlegevallen geen onoplosbare of geaggregeerde α-syn (figuur 2E) tonen. Semi-kwantitatieve maatregelen dichtheid weerspiegelen de hoeveelheid LB belasting als categoriesd met α-syn immunohistochemie aantonen van de onoplosbaarheid van geaggregeerde α-syn (Figuur 2B, 2D, 2F) in neocorticale en limbische PD gevallen.

Figuur 1. Schematische weergave van onoplosbare α -syn extractieprocedure.rGebruik = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Vertegenwoordiger immunoblots van α -syn niveaus van de PD en de controle van menselijk weefsel. TBS, SDS en ureum oplosbare fracties van de basale ganglia (een regio die α-syn pathologie havens in PD gevallen) van idiopathische PD gevallen en neurologisch normale (controle) hersenen werden geanalyseerd op de aanwezigheid van α-syn via Western immunoblot. 10 ug eiwit werd geladen op elke baan. In TBS fracties (A), voornamelijk α-syn monomeren zijn aanwezig in alle gevallen. In SDS fracties (C) worden enkele oligomeren van α-syn gezien met monomeren hoofdzakelijk in de PD weefsel. In ureum fracties (C) monomeren, oligomeren en geaggregeerde α-syn variabel worden uitgedrukt in de PD gevallen reflecting hun respectieve LB belasting. Het neurologisch normale controlemonsters tonen de aanwezigheid van slechts geringe hoeveelheden monomere α-syn. Let op eventuele afbraakproducten van α-syn gezien in sommige gevallen met hoge LB load. De vaste pijlpunt geeft de monomere vorm van α-syn. De * eventueel is een C-terminaal afgeknotte vorm van α-syn zoals eerder beschreven ^20,26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Geval	Seks	leeftijd bij overlijden yrs	post-mortem vertraging (uur)	pH weefsel
Neocorticale 1	M	82	40	6.3
Neocorticale 2	F	75	35.3	6.4
Limbisch 1	M	81	28.5	6.2
Limbisch 2	F	79	36.5	6.2
Controle 1	M	80	38	6.1
Control 2	F	83	32.5	6.3

Tabel 1. Beperkte demografie van de gevallen gebruikt

Discussion

Dit artikel beschrijft een biochemische protocol voor extractie en het onderzoek van de differentiële oplosbaarheid eigenschappen van de monomere, oligomere en geaggregeerd α-syn van zieke hersenen met behulp van denaturerende gel bedrijfsomstandigheden. Dit is een gevestigde techniek te bestuderen geaggregeerde α-syn ^{17, 18, ​​20, 21} een eiwit dat normaal oplosbaar is in zijn natieve vorm, maar krijgen amyloidogene of verhoogde aggregatie treffen met ziekteprogressie of genetische mutaties. Desondanks hebben sommige groepen kleine variaties in SDS-concentraties in hun buffers (8% of 10% in plaats van 5%) ^{21,22, 30.} De SDS is een anionisch detergens en oplosbaar maakt α-syn oligomeren die kunnen bestaan ​​membraangebonden vormen van α-syn, terwijl ureum, een chaotroop reagens denatureert de onoplosbare geaggregeerde en fibrillair of amyloïdogene vormen van α-syn ^20. In dit verband een systematische studie van Paleologou ea ³¹ onderzochten de stabiliteitvan α-syn oligomeren en fibrillen met verschillende concentraties ureum (6,5 - 8 M) of SDS (0,25-2%) en meldde dat oligomeren stabiel in SDS concentraties, maar niet bij hoge concentraties van ureum. Hun FILA-1-antilichaam, specifiek voor α-syn oligomeren en fibrillen waargenomen hogere concentraties van fibrillen in 6,5 M ureum concentratie onder niet-denaturerende omstandigheden. De buffer concentraties die in dit protocol getrouwe afspiegeling hetgeen beschreven in Culvenor et al. (1999) ^32.

De anatomische gebieden van de hersenen voor biochemische extractie van onoplosbare α-syn moet zorgvuldig worden geselecteerd en dit moet α-syn LB en LN belasting reflecteren afhankelijk van progressie van de ziekte ^33,34. De gevallen die hier gebruikt zijn basale ganglia monsters uit de neocorticale en limbische subtypes van PD reflecterende laat en tussenstadia van PD progressie volgens McKeith ctriteria ^34. Op de Queen Square Brain Bank, de ene helft van de hersenenroutinematig gefixeerd in formaline voor histochemische analyse en de andere helft wordt zorgvuldig ontleed in verschillende anatomische gebieden en flash bevroren en opgeslagen bij -80 ^{° C} vriezer voor verdere biochemische en DNA / RNA-analyse studies. Volgende formaline fixatie van de hersenen en de dissectie door neuropathologists, wordt immunohistochemie uitgevoerd met behulp van α-syn antilichaam en resultaten gearchiveerd. Ook als routine procedure, de pH van het hersenweefsel wordt gemeten bij aankomst als maat agonale toestand van het hersenweefsel. Dit vormt een stevige basis voor de kwaliteit van weefsel bewaren van biochemische analyse.

Onze gegevens Hier blijkt dat er meer oplosbaar SDS α-syn monomeer in PD gevallen in vergelijking met controles; met name de neocortical PD gevallen een hogere α-syn load opzichte van de limbische PD ras. De neocorticale gevallen vertegenwoordigen meer progressie van de PD α-syn pathologie in de neocorticale regio's zoals de frontale en pariëtale corTices ^33,34. De limbische PD gevallen hoger LB scores in de basale voorhersenen / limbische gebieden gebieden zoals de amygdala, transentorhinal en cingulate regio. Voor zinvolle gegevens en statistische analyse, moet men minstens 4 gevallen van elk cohort draaien. Eveneens hebben we geen statistische analyse van de vlek hier gepresenteerde gegevens geprobeerd.

Er moet worden opgemerkt dat verschillende antilichamen verschillende vormen / samenstelling van hogere orde α-syn oligomeren herkent en ieder kan zijn eigen relatieve gevoeligheid en de voorkeur hebben. Dit blijkt uit de resultaten van Tong et al. ²⁹ wanneer zij aantonen dat 4 verschillende α-syn-antilichamen (Syn-1, SS, Onco en LB509) werd verkregen resultaten veranderlijk althans α-syn oligomeren / aggregaten. De α-syn monomeren in vergelijkbare mate herkend door alle 4 antilichamen hoewel deze variatie kunnen hebben naargelang de α-syn antilichaamepitoop bevindt zich ofwel in het N-eindstandige of Cterminale ^29. Evenzo specifieke antilichamen voor fosfo-alfa- synucleine bepalen afzonderlijke hoogmoleculaire α-synucleïne species ^20,21. In de hier beschreven protocol, heeft de sterk gekenmerkt antilichaam Syn-1 toegepast _^19-21.

Het is echter belangrijk om te overwegen nieuwe antilichaam op Western blots validatie door middel van antilichaam pre-absorptie experimenten en ook overexpressie en knockdown van het eiwit in cellen.

Het is belangrijk om andere variaties die door onderzoekers hebben toegepast overwegen om kleinere fragmenten van α-syn en tetramere of instabiele α-syn vormen te bepalen. Dit kan onder milde fixatie van membranen met 0,4% PFA in PBS met afgeknotte vormen van α-syn ³⁵ of behandeling van het monster homogenaten met cross linkers behouden om tetrameren ³⁶ stabiliseren.

Nauwkeurige biochemische evaluatie van de eiwitten met behulp van post-mortem tissue vereist minimalisering van enzymatische eiwitafbraak en modificatie. Het is daarom raadzaam om weefsel te gebruiken met de kortste postmortale vertragingen en / of selecteer geëvenaard monsters binnen het geval cohorten. Immunohistochemie met standaard antilichamen α-syn immunohistochemie dient voorafgaand aan het isoleren protocol worden uitgevoerd. De omvang van α-syn pathologie is zeer variabel en kan per geselecteerde gebieden. Het is raadzaam om de regio's met een overvloed aan pathologie te selecteren als een positieve controle voor een optimale opbrengst bij elke run. Het gebruik van proteaseremmers en eventueel fosfatase remmers voor ongewenste enzymatische afbraak te voorkomen na de vrijgave van intracellulaire proteasen of fosfatasen die tijdens cellysis en handhaven van de monsters bij 4 ° C cruciaal.

Het is belangrijk dat alle monsters in de batch experimenten gelijkmatig en consistent worden behandeld met intra-user variaties voorkomen; meerdere freeze-dooi cycli moet worden vermeden omdat dit kan mogelijk intrekken posttranslationele modificaties zoals fosforylering. Een kritisch punt in gedachten te houden bij het onderzoek van een groot aantal monsters is dat de gegevens van immunoblots genormaliseerd zou moeten zijn om één monster, dat moet parallel lopen aan alle andere monsters op de gels, en alle gegevens gerefereerd aan dat monster. Dit wordt gedaan om normalisatie van immunoblot gegevens te garanderen tussen verschillende vlekken. Dit is het in onze recente studie ²² gevolgde methode.

Opgemerkt zij dat voor de achtergrond ECL laag te houden, de blots mag niet uitdrogen op elk moment tijdens de western blot protocol. Bovendien moet zeer lange blootstelling (> 10 min) aan autoradiografie films worden vermeden omdat dit zal leiden tot verzadiging van ECL-signaal en zullen leiden tot onnauwkeurige kwantificering.

Dit bovenstaande protocol is een relatief eenvoudige techniek met behulp van gemeenschappelijke laboratorium reagentia en inmenten en kunnen een waardevol instrument voor het onderzoeken van de pathofysiologie van α-syn eiwit PD onderzoek. Deze methode kan alleen worden uitgebreid met geschikte aanpassingen aan de studie van α-syn biologie α-syn transgene dieren, maar ook voor andere neurodegeneratieve aandoeningen die abnormale afzettingen van geaggregeerde eiwitten zoals AD, MSA, DLB, HD en frontotemporaldementias. Echter de Western blot data beschreven kunnen ook worden gevalideerd middels enzymgekoppelde immunosorbent assays met behulp van antilichamen voor specifieke vormen van α-syn ^31.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCL	Sigma	T5912
sodium chloride	VWR	27800.291
SDS	Fluka	71727
Urea	Sigma	U5378
Protease inhibitor tablets	Roche	04 693 116001
Phosphatase inhibitor tablets	Roche	04 906 837001
Phosphate buffered saline tablets	Sigma	P4417
Tween-20	Sigma	P9416
NuPAGE MOPS SDS running buffer	Invitrogen	NP0001
NuPAGE transfer buffer	Invitrogen	NP0006-1
Hybond-P membrane	GE Healthcare	RPN303F
Whatman 3MM filter paper	Sigma	WHA30306185
Bis-tris gels 4-12%	Invitrogen	NP0322BOX
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
Bio-RAD DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes	Beckman	355630
Western blot stripping buffer	Thermo scientific	46430
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal)	BD Biosciences	610786
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal	Sigma	A5441
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody	Santa Cruz	sc-2031
Bovine serum albumin	Sigma	A7030
Instrument	Company	Rotor/ model no
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max	Beckman	MLA-80
Sonicator	Heat Systems	XL20-20
Homogeniser	Jenke and Kunkel	TP18/10