Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties

20.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/53422

⸱

14 januari 2016

 ,  ,  , 
1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid

In dit artikel

Samenvatting

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Samenvatting

Ingewikkelde gen-regulerende netwerken orkestreren biologische processen en ontwikkelingsovergangen in planten. Selectieve transcriptionele activering en silencing van genen bemiddelen de respons van planten op omgevingssignalen en ontwikkelingssignalen. Daarom zijn inzichten in de mechanismen die de genexpressie van planten regelen essentieel om een diepgaand begrip te krijgen van hoe biologische processen in planten worden gereguleerd. De hier beschreven chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) techniek is een procedure om de DNA-bindende sites van eiwitten in genen of genomische regio's van de model-soort Arabidopsis thaliana te identificeren. De interacties met DNA van eiwitten van belang zoals transcriptiefactoren, chromatine-eiwitten of post-translationeel gemodificeerde versies van histonen kunnen efficiënt worden geanalyseerd met het ChIP-protocol. Deze methode is gebaseerd op de fixatie van eiwit-DNA interacties in vivo, willekeurige fragmentatie van chromatine, immunoprecipitatie van eiwit-DNA complexen met specifieke antilichamen, en kwantificering van het DNA geassocieerd met het eiwit van belang door PCR-technieken. Het gebruik van deze methodologie in Arabidopsis heeft significant bijgedragen aan het onthullen van transcriptionele regulatoire mechanismen die een verscheidenheid aan biologische plantenprocessen regelen. Deze aanpak maakte de identificatie mogelijk van de bindingsplaatsen van het Arabidopsis chromatine-eiwit EBS naar regulatoire regio's van het master-gen van bloei FT. De impact van dit eiwit op de accumulatie van specifieke histonmarkeringen in de genomische regio van FT werd ook onthuld door middel van ChIP-analyse.

Inleiding

De laatste jaren uiteenlopende genetische, moleculaire en genomische instrumenten ontwikkeld in het model species Arabidopsis thaliana. Deze technologie is enorm vergemakkelijkt de vooruitgang in het begrijpen van hoe de ontwikkeling van de plant wordt geregeld. Onder de ontwikkelingsprocessen bestudeerd met behulp van Arabidopsis als een model, heeft de genetische controle van de bloeitijd is uitvoerig geanalyseerd. Deze studies hebben aangetoond dat planten moduleren zeer nauwkeurig het tijdstip van bloei in reactie op endogene signalen zoals hormonen en de leeftijd van de plant, en ook voor het milieu signalen zoals fotoperiode en temperatuur die synchroniseren bloeitijd met de natuurlijke cyclus van de seizoenen 1, 2. De isolatie en karakterisering van Arabidopsis mutanten met veranderingen in de tijd van de bloei is in de onthulling van een complex netwerk van genen die de bloeitijd te regelen in reactie op endogene en omgevingsfactoren bepalend geweest. Deze genetische circuitsgeïntegreerd op het niveau van een paar meester genen die fungeren als schakelaars van de bloei, en de exacte timing van de bloemen initiatie is afhankelijk van het saldo van de bloei bevorderen en het onderdrukken van activiteiten die stroomopwaarts van de bloemen integrator genen 1,3 werken.

De functionele karakterisering van genen die voor hun rol in de controle van de bloei initiatie, geholpen door het recente gebruik van genomische benaderingen gebleken de centrale rol van transcriptionele regulatie bij de modulering van de bloeitijd. In feite zijn veel van de meester genen bloeiende coderen transcriptiefactoren 4. Daarnaast is een aantal chromatine hermodellering eiwitcomplexen invloed op de expressie van genen meester van de bloei. Een aantal van de Arabidopsis mutanten die veranderde hun bloeitijd bleek mutaties in genen die coderen voor verschillende chromatine modifiers dragen. Verschillende chromatine remodelers die posttranslationele modificaties in histon introducerene staarten, herpositioneren nucleosomen ten opzichte van het DNA of wisselen canonieke histonen door histone varianten nodig voor de goede regulering van de bloei in Arabidopsis 5,6. Sommige chromatine hermodellering activiteiten katalyseren de afzetting of verwijdering van covalente modificaties zoals acetylering of methylatie specifieke histon residuen. Deze histon markeringen worden specifiek herkend door gespecialiseerde effectoren dat andere chromatine remodeling complexen, transcriptiefactoren of onderdelen van de transcriptie machinerie te werven om de transcriptionele activiteit van bloeiende genen reguleren.

Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) mogelijk maken om in vivo DNA-bindingsplaatsen voor eiwitten van belang (figuur 1). Deze procedure maakt gebruik van het vermogen van bepaalde chemische stoffen te verknopen de eiwitten aan het DNA. De resulterende DNA-eiwitcomplexen kan vervolgens worden geïmmunoprecipiteerd met specifieke antilichamen against transcriptiefactoren, chromatine-bindende eiwitten, of specifieke modificaties en heterologe epitopen (gewoonlijk aangeduid als "markeringen") bevestigd aan het eiwit van keuze. Het DNA gezuiverd uit deze immunologische neerslagen kunnen worden gebruikt als een matrijs in kwantitatieve PCR (qPCR) reacties beoordelen voor verrijking van specifieke sequenties van belang. Zo kunnen de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren of de verdeling van histon merken bepaalde genen worden vastgesteld 7,8. Bovendien, in combinatie met Next Generation Sequencing (NGS) dat massieve parallelle sequentiebepaling mogelijk maakt chiptechnologie is mogelijk genoom-brede identificatie van de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren en onthulling epigenomisch landschappen van histon wijzigingen. Verder is de gelijktijdige analyse van genexpressie voor het bewaken hoe de binding van transcriptiefactoren of de depositie van specifieke histon markeringen gecorreleerd met transcriptionele activity van genen 9.

Het gebruik van ChIP protocollen Arabidopsis is toegestaan ​​evaluatie van het effect dat verschillende transcriptionele regulatoren hebben voor de organisatie van de chromatinestructuur meester genen van bloei en hoe deze structurele veranderingen beïnvloeden genexpressie 5,6. Eerdere resultaten toonden aan dat de Arabidopsis locus EARLY builen IN korte dagen (EBS) fungeert als een repressor van bloei en mutanten in dit gen tonen een versnelling van bloei en opregulatie van de meester-gen van de bloei FT. Verder verlies-van-functie mutaties in FT volledig onderdrukken van de vroege bloei fenotype van de EBS mutante planten, wat aangeeft dat FT nodig is voor de voortijdige ontplooiing van EBS mutanten en dat EBS is voor de onderdrukking van deze meester gen van de bloei 10 , 11. EBS codeert voor een PHD-bevattend eiwit dat specifiek kan binden histon H3 di- en trigemethyleerd in the 4 lysine residu (H3K4me2 / 3), suggereert een rol voor EBS in de chromatine-gemedieerde repressie van FT 12. Het gebruik van de ChIP aanpak aangetoond dat de Arabidopsis-PHD bevattend eiwit EBS 10,11 bindt regulerende gebieden van de florale integrator gen FT haar uitspraken 12 onderdrukken. Aanvullende gegevens verkregen door toepassing van chiptechnologie toonde aan dat dit eiwit vereist is om lage niveaus van histone acetylering, een kenmerk van actieve transcriptie in het chromatine van deze meester gen van bloeiende behouden tijdens de initiële stadia van ontwikkeling Arabidopsis. Deze waarnemingen tezamen met genetische en genexpressie data aantonen dat Arabidopsis PHD-bevattende eiwit een centrale rol in de fijnafstelling van bloeitijd door het moduleren van de expressie van het gen floral integrator 12 FT. De hier gepresenteerde werk geeft een geoptimaliseerde werkwijze niet alleen bruikbaar voor de analyse van histonen, maar ook voor anderechromatine-geassocieerde eiwitten, en met een verhoogde efficiëntie en minder experimenteel tijd. Voorts is dit verslag illustreert hoe het gebruik van ChIP protocols nieuwe inzichten voorziet in de relatie tussen veranderingen in chromatine modificaties en transcriptionele toestanden van plantengenen, en hoe deze chromatine-gemedieerde controlemechanismen effect genexpressie op het begin van de bloei in Arabidopsis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Verknoping van het plantenmateriaal (1 uur)

  1. Groeien de Arabidopsis-lijnen die in het experiment (wild type - WT - versus mutanten, en / of lijnen expressie de gecodeerde versie van het eiwit van interesse tot expressie lijnen versus het label niet gefuseerd aan een eiwit) gedurende 12-18 dagen op grote petrischalen (150 mm) met MS-agar medium (1 L: 1x Murashige & Skoog zouten, 10 g sucrose, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Als alternatief, groeien planten op potten met 3: 1 mix van bodem en vermiculiet.
    LET OP! Formaldehyde is giftig bij inademing, aanraking met de huid, en moet in een chemische kap dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen worden behandeld. Stappen 1,2-1,6 moet onder de zuurkast worden uitgevoerd.
  2. Maak kleine gaatjes in het deksel van de 50 ml buizen met een laboratoriumbrander verwarmde naald. Voeg 40 ml 1x PBS buffer en 1,08 ml formaldehyde tot een eindconcentratie van 1% (37% stock sresolutie). Verzamel in die 50 ml tubes 1,5 gram plantenmateriaal. Houd de buisjes op ijs tijdens verknopen.
  3. Sluit de 50 ml buizen met deksel. Plaats de buizen in een exsiccator en toepassen vacuum. Vacuüm infiltreren het weefsel voor 10 min, laat dan het vacuüm voorzichtig, om te voorkomen dat karnen van de oplossing. Meng het monster. Herhaal tweemaal. Na infiltratie, acht het plantmateriaal en bevestigen dat het wordt licht doorschijnend en neigen te zinken naar de bodem van de buis (figuur 2).
  4. Voeg 2,5 ml van 2 M glycine tot een uiteindelijke concentratie van 0,125 M. worden gerealiseerd vacuüm gedurende 5 min. Glycine werkt als een competitieve remmer van formaldehyde crosslinking.
  5. Gooi de PBS formaldehyde-glycine-oplossing door het inverteren van de gesloten 50 ml buis met gaten in het deksel.
  6. Tweemaal met 1x PBS en eenmaal spoelen met water plantjes werp de wasoplossing zoals beschreven in stap 1,5. Droog ze op een papieren handdoek en bevriezen in vloeibare nitrogen.
    OPMERKING: Bevroren weefsel kan bij -80 ° C worden bewaard weken.

2. Bereiding van antilichamen (1 dag)

Opmerking: Voor immunoprecipitatie, wordt het gebruik van magnetische korrels geconjugeerd met antilichamen via een eiwit G of eiwit een linker met hoge affiniteit voor het constante domein van de zware keten antilichaam aanbevolen. De DNA-eiwitcomplexen kan niet-specifiek hechten aan het oppervlak van de beads-antilichaam conjugaten. Daarom is het noodzakelijk om controles uit te voeren zonder specifieke antilichamen tegen het niet-specifieke achtergrondbinding te kwantificeren.

  1. Voor elke immunoprecipitatie bereiden 15 ul van magnetische korrels in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Het aantal kralen afhankelijk van de hoeveelheid van het chromatine gebruikt voor immunoprecipitatie en ook de antilichamen.
  2. Te wassen, voeg 1 ml chromatine immunoprecipitatie (ChIP) verdunningsbuffer om de kralen, meng door rotatie en plaats de 1,5 ml microcentrifuge tuin een magnetisch rek. Wacht ongeveer 1 minuut te laten de kralen hechten aan de magneet. Met de 1,5 ml microcentrifugebuizen nog in het rek, verwijder het supernatant door pipetteren. Herhaal tweemaal.
    OPMERKING: Voor iedere plant lijn immunoprecipitatie twee sets nodig: één met de kralen en antilichaam (Ab) en een tweede geen antilichaam (No-Ab) controle met slechts magnetische korrels.
  3. Resuspendeer de kralen in 200 ul ChIP verdunningsbuffer. Voeg de vereiste hoeveelheid van de specifieke Ab een van de twee buizen voor ieder plantenlijn (de exacte verdunning verschilt per Ab en moet experimenteel worden geoptimaliseerd of, in het geval van commerciële antilichamen, de instructies van de fabrikant). Gebruik dit monster voor immunoprecipitatie. Voeg dezelfde hoeveelheid niet-specifieke IgG aan de andere buis, die zal worden gebruikt als negatieve controle.
  4. Incubeer O / N op een draaiend wiel bij 4 ° C te laten de antilichamen hechten aan de kralen.

3. Chromatine Extraction (4 uur)

  1. Maal grondig het bevroren plantmateriaal in vloeibare stikstof met behulp van vijzel tot het poeder wordt homogeen en lichtgroen. Breng het poeder om een ​​nieuwe 50 ml buis.
  2. Voor stappen 3,2-3,6, werk onder de zuurkast. Voeg 30 ml van Extractiebuffer 1 (ExB 1), en meng goed om het weefsel poeder weken. Vanaf deze stap, houd de monsters bij 4 ° C te allen tijde. Bevroren weefsel en vloeibare stikstof restjes zal de buffer te bevriezen. Zorg ervoor dat de bevroren weefsel volledig ontdooien door het omkeren van de buizen 4-5 keer om de 2 min.
  3. Schakel de suspensie door deze door een filtratie weefsel met poriegrootte van 22-25 urn in een nieuwe 50 ml buis en centrifugeer bij 1000 xg deze gedurende 20 min bij 4 ° C.
    Opmerking: In deze stap worden de kernen en de organellen zullen pellet. ExB 1 bevat voldoende sucrose tot hoge dichtheid verschaffen en te voorkomen dat verstoring van organel structuur.
  4. Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof door decanteren. Op dit staGE, zich aan een groene pellet van ongeveer 2 ml.
  5. Resuspendeer de pellet in 5 ml ExB 2. Resuspensie van de pellet moeilijk op dit punt. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    OPMERKING: ExB 2 bevat 1% Triton X-100 om te helpen barsten de chloroplasten open en verwijder chlorofyl.
  6. Resuspendeer de pellet in 300 pl extractiebuffer 3 (ExB 3).
  7. In een schone microfugebuis, voeg 600 pl ExB 3. Neem de geresuspendeerde pellet uit stap 3,6 en combineer het voorzichtig bovenop de schone ExB 3.
  8. Spin gedurende 1 uur bij 16.000 xg bij 4 ° C.
    OPMERKING: Deze stap helpt bij het verwijderen van het reinigingsmiddel uit het monster.
  9. Verwijder de bovenstaande vloeistof door afzuigen met een pipet. Resuspendeer de nucleaire pellet in 300 ui sonicatiebuffer door langzaam op en neer pipetteren om bellenvorming te vermijden, die sonicatie efficiëntie kunnen beïnvloeden. Zorgvuldig pipet uit de suspensie en overbrengen naar een schone 1,5 ml microcentrifugebuis.
    LET OP: Dezebuffer bevat SDS, om de kernen lyseren en laat de chromatine.
  10. Ultrasone trillingen van de schorsing van de kernen lyseren en willekeurig scheren het chromatine in kleine fragmenten. Gebruik sonicatie omstandigheden die chromatine verrijkt fragmenten tussen 200-800 bp (20-30 cycli met de instellingen 30 sec ON / OFF 30 sec bij 4 ° C voor de sonificatie-inrichting in de tabel van materialen / reagentia beschreven) maken. Controleer de efficiëntie van sonificatie door elektroforetische scheiding van de verkregen DNA-fragmenten op een agarosegel 13, laden 2 pl gesoniceerd chromatine (figuur 3).
    LET OP! Zorg ervoor dat het oor beschermingsmiddelen te dragen tijdens het sonicatie stap in het geval dat de echografie-apparaat niet is opgenomen in een geluiddichte kast.
    Cruciale stap! De chromatine fragmentatie is grotendeels afhankelijk van de ultrasoonapparaat apparatuur. De sonicatie voorwaarden moeten worden aangepast om verrijking bereiken in de geschikte DNA afmetingen. BekijkenFiguur 3 voor een voorbeeld van hoe de chromatine fragmentatie te optimaliseren.
  11. Draai de oplossing eenmaal bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng de supernatant door pipetteren een schone 1,5 ml microcentrifugebuis. Gooi de pellet. Neem 1/10 van het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis, markeren als input en bevriezen bij -20 ° C.
  12. Verdun het chromatine 10x met chip verdunning buffer te verdunnen SDS aan de uiteindelijke concentratie van 0,1%.
    Opmerking: De monsters kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -20 ° C gedurende enkele weken.

4. Immunoprecipitatie van het eiwit van belang en de Redding van DNA (1 dag, 3 uur)

  1. Was de korrels gecoat met Ab uit stap 2,4 driemaal met 1 ml ChIP verdunningsbuffer om overmaat antilichaam te verwijderen, zoals beschreven in stap 2.2. Hersuspenderen in 200 pl ChIP verdunningsbuffer. Voeg 50 ul van geïsoleerde chromatine. Incubeer O / N op een draaiend wiel bij 4 ° C.
    OPMERKING: Controleer de concentratiop het chromatine in microvolume UV-Vis spectrofotometer. 50 pl geïsoleerde chromatine zou meer dan 10 ug DNA bevatten.
  2. Voor de stappen 4,2-4,5 werk in 4 ° C. Was de kralen tweemaal in 1 ml laag zout wasbuffer zoals beschreven in stap 2.2.
  3. Was de korrels eenmaal in 1 ml High Salt wasbuffer.
  4. Was de korrels eenmaal in 1 ml LiCl wasbuffer.
  5. Was de kralen tweemaal in 1 ml TE-buffer. Na de laatste wasbeurt, zorg ervoor dat de TE-buffer links in de buis volledig te verwijderen door aspiratie met een pipet.
  6. Haal de INPUT monsters (stap 3.9). Overdracht 5 pi van de invoer voor een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en verder zoals de ChIP monsters. Omgekeerde verknoping door toevoeging van 200 ul van 5% chelateringsionenuitwisselingshars en incubeer gedurende 10 min bij 95 ° C schudden elke 2-3 min. Spin neer op 16.000 xg gedurende 30 sec en de bovenstaande zorgvuldig te dragen naar een nieuwe microcentrifugebuis door pipetteren.
    OPMERKING: Terwijl de tranele werkwijze voor het verknopen omkering gaat om een ​​O / N incubatie met NaCl, de incubatie met een ion chelerende hars bij 95 ° C maakt efficiënte decrosslinking en elutie van DNA in 10 min, dus waardoor het protocol een dag korter.
  7. Voeg 2 pl proteinase K (10 mg / ml) en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min om eiwitten te verteren en vrij DNA.
  8. Stop de reactie door incubatie bij 95 ° C gedurende 10 min.
  9. Snel draaien bij 16000 g gedurende 30 sec en overbrengen supernatant naar een nieuwe buis door pipetteren.
  10. Reinig het DNA geïsoleerd met behulp van een standaard DNA-fragmenten zuiveringskit.
    OPMERKING: Ga volgens de instructies van de fabrikant.
  11. Breng de DNA bindende kolom uit de kit een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. Elueer het gezuiverde DNA door het toevoegen van 20 gl DNase-vrij water tot het midden van de kolom en centrifugeren bij 16.000 xg gedurende 60 sec. Stoppunt: monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende enkele weken.

5. Het meten van Overvloed van de bindingsplaatsen in de Immunologisch DNA door qPCR (4 uur)

OPMERKING: DNA geïsoleerd uit het neergeslagen chromatine moet worden geanalyseerd om te bepalen welke DNA-fragmenten ChIP-ed zijn van de totale chromatine, vanwege de binding aan het eiwit van belang.

  1. Ontwerp van primers voor genoomgebieden plaats met een smelttemperatuur (Tm) van 60 ° C en een GC-gehalte van 30% -80%. Zoals chromatine gefragmenteerd door sonificatie, moet de lengte van de geamplificeerde sequentie niet meer dan 150-200 nucleotiden (tabel 1) zijn.
    LET OP: Een handig hulpmiddel voor primer ontwerp is Primer 3-programma (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Aanvullende richtlijnen voor primer ontwerp zijn beschikbaar in eerdere rapporten 8, 14,15.
  2. Gebruik een BLAST programma om ervoor te zorgen dat de primers zijn specifieke (vooral promotors kan dit TF bindingssequenties delen) en test de primer efficiëntie using 01:10 verdunningen in water van de input DNA (stap 4.9). Bepaalde gebieden van het genoom beter dan anderen worden gezuiverd. Het is daarom belangrijk om PCR primers te ontwerpen en controleren van het verdunde ingang DNA.
  3. Verdun het gezuiverde DNA 1:10 met water en Pipetteer 5 ul van de verdunde DNA in een PCR-buis voor elke reactie.
    OPMERKING: Verdun alleen de hoeveelheid nodig omdat DNA kan hechten aan de wanden van de 1,5 ml microcentrifuge buisjes. Multiple-ontdooien bevriezen cycli toename van het aantal aangesloten DNA-moleculen. Voor elk primerpaar, versterking in de ingang, Ab-chip en geen Ab-chip moet worden geanalyseerd.
  4. Om de PCR mix af, voeg SYBR Green PCR Master Mix tot een uiteindelijke concentratie van 1x en 0,5 uM van elke primer. Vullen tot 20 ul met DNase-vrij water.
  5. Voer de qPCR reactie volgens de instructies van de SYBR Green PCR master mix fabrikant.

6. Data Analysis

OPMERKING: Onder de existing methoden voor de analyse ChIP-data, worden twee meest gebruikte. De eerste daarvan is de vouw verrijking methode, ook genoemd als "relatieve verrijking ',' signaal over achtergrond" of "ten opzichte van de niet-antilichaamcontrole. De tweede methode wordt genoemd als "% van de invoer".

  1. Data-analyse door voudige verrijking methode.
    1. Maak een spreadsheet met samples namen en ruwe Ct-waarden die zijn verkregen na qPCR reactie.
    2. Voor elk monster af te trekken van zijn ruwe Ct-waarde van de ruwe Ct-waarde verkregen voor de overeenkomstige No-Ab controle. NB: Na deze wiskundige bewerking, zal Ct waarde voor No-Ab sample gelijk aan 0.
    3. Bereken voudige verrijking met machtsverheffing bediening met base 2 en exponent (power) gelijk aan de negatieve rest verkregen in stap 6.1.2 (tabel 2).
      voudige verrijking = 2 - (Ct (monster) - Ct (No-Ab))
      LET OP: In deze method de overvloed van een specifiek DNA-fragment in de ChIP-ed monster wordt vergeleken met de overvloed van dit fragment in No-Ab controle. De aanname van deze methode is dat het niveau van achtergrondsignaal reproduceerbaar verschillende primer sets, monsters en repliceren experimenten. Echter, dit'noise' signaal niveaus variëren tussen de primer sets, monsters, en experimenten.
  2. Data-analyse door% van de input-methode.
    1. Maak een spreadsheet met samples namen en ruwe Ct-waarden die zijn verkregen voor hen na qPCR reactie.
    2. Pas ruwe Ct-waarden voor ingangsmonsters door het aftrekken van een waarde van 2 logaritme van de fractie van het totaal geëxtraheerde chromatine dat werd genomen als input.
      NB: In dit protocol is gelijk aan de afgetrokken waarde 3,32, als 10% van de totale chromatine werd genomen als input in dit protocol. Log 2 (10) gelijk aan 3,32.
    3. Bereken% van de input door vermenigvuldiging met 100 de waarde van machtsverheffing bediening met base 2 en exponent (power) gelijk aan resterende aangepaste invoerwaarden afgetrokken van ruwe Ct-waarden van de steekproef (Tabel 3).
      % Van de input = 100 * 2 (aangepaste ingang - Ct (monster))
      OPMERKING: Bij deze procedure wordt de relatie tussen specifieke DNA overvloed in het ChIP-ed monster op de totale geïsoleerde chromatine (ingangsmonster) berekend. Aanvullende informatie over ChIP gegevensanalyse u naar Haring et al. 8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Acht belangrijke stappen kunnen uitgevoerd worden uitgekozen in dit ChIP protocol voor het identificeren van in vivo eiwit-DNA-interacties, waaronder kweken en oogsten van plantenmateriaal, verknoping van chromatine, chromatine isolatie, chromatine fragmentatie, selectieve isolatie van de complexen tussen DNA en het eiwit van belang door immunoprecipitatie, eiwitvertering, DNA-zuivering, en qPCR analyse (Figuur 1). Een cruciale stap in de ChIP protocol is de fixatie van DNA-eiwit interacties in...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De ChIP protocol beschreven is een reproduceerbare en krachtige techniek interacties tussen eiwitten en specifieke DNA-sequenties in vivo analyse in Arabidopsis planten. Een succesvolle identificatie van bindingsplaatsen voor de eiwitten van belang vereist een adequate selectie van plantaardige organen of ontwikkelingsstadia waar de relevante interacties daadwerkelijk plaatsvinden. Bovendien is het essentieel om de juiste fixatie van het plantenmateriaal en een optimale afschuiving van het chromatine door sonic...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen The Plant Cell bedanken voor het toestaan van het gebruik van enkele gegevens die in dit tijdschrift zijn gepubliceerd om de representatieve resultaten hier beschreven in Figuur 4 uit te werken. Dit werk werd ondersteund door het EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), en door het Spaanse Ministerio de Economía y Competitividad (grants BIO2010-15589 en BIO2013-43098-R).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MESSigmaM8250
MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)SigmaM5524
Formaldehyde 37% SigmaF8775-25Gebruik onder de afzuigkap
Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-vrij, EASYpackRoche5892791001
Bioruptor Standard sonicatieapparaatDiagenodeB01010002 (UCD200TO)
GlycineSigma50046
QIAquick PCR-zuiveringskitQiagen28104
Dynabeads magnetische kralen gekoppeld met proteïne A of proteïne GLife Technologies10003D/10001DControleer de handleiding van de fabrikant voor de affiniteit van het antilichaam
MiraclothMerck Millipore475855
Triton X-100 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies85112
(muis, rat, konijn…)-IgGDiagenodeC15400001, C15420001, C15410206
Magnetische houder - DynaMag-2Life Technologies12321D
H3K9/14ac polyklonaal antilichaam - Premium DiagenodeC15410200-10
Chelex 100 ResinBio-Rad142-2832
Proteinase KLife Technologies17916
Anti-Myc Tag Antilichaam, clone 4A6Millipore05-724
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001

Referenties

  1. Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
  2. Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
  3. Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
  4. Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
  5. He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
  6. Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
  7. Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).
  9. Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
  10. Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
  11. Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
  12. Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998(2012).
  15. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  16. Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
  17. Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
  18. Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
  19. Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).
  20. Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
  21. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  22. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  23. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
  24. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  25. Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Arabidopsis thalianabinding van transcriptiefactorenanalyse van histonmodificatiecross-linkingproceduresonicatiefragmentatieimmunoprecipitatie met magnetische beadsqPCR-kwantificeringFT-genregulatie
Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.