Methodenartikel

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

DOI:

10.3791/53424

⸱

28 november 2015

 ,  , 
1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, Amsterdam

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specifieke metabole routes worden steeds meer erkend als kritische kenmerken van macrofaagsubsets. Terwijl LPS-geïnduceerde klassiek geactiveerde M1 of M(LPS) macrofagen pro-inflammatoire zijn, induceert IL-4 alternatieve macrofaagactivatie en deze zogenaamde M2 of M(IL-4) ondersteunen het oplossen van ontstekingen en wondgenezing. Recent bewijs toont de cruciale rol van metabole herprogrammering in de regulatie van M1 en M2 macrofaagpolarisatie.

In dit manuscript wordt een extracellulair fluxanalyzer toegepast om de metabole kenmerken van naïeve, M1 en M2 gepolariseerde muisbeenmerg-afgeleide macrofagen te beoordelen. Dit instrument gebruikt pH- en zuurstofsensoren om de extracellulaire acidificatiesnelheid (ECAR) en zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) te meten, die gerelateerd kunnen worden aan glycolytische en mitochondriale oxidatieve metabolisme. Als zodanig kunnen zowel glycolyse als mitochondriale oxidatieve metabolisme in real-time in één enkel assay worden gemeten.

Met behulp van deze techniek tonen we hier aan dat inflammatoire M1 macrofagen een verhoogde glycolytische stofwisseling en verminderde mitochondriale activiteit vertonen. Omgekeerd vertonen anti-inflammatoire M2 macrofagen hoge mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) en worden gekenmerkt door een verbeterde reserve ademhalingscapaciteit (SRC).

De gepresenteerde functionele assay dient als een raamwerk om te onderzoeken hoe bepaalde cytokinen, farmacologische verbindingen, genknockouts of andere interventies het metabolische fenotype en de inflammatoire status van de macrofaag beïnvloeden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terwijl macrofagen spelen een centrale rol in vrijwel alle ziekten, de moleculaire mechanismen die hun fenotype regelen nog steeds niet volledig ontrafeld. Macrofagen geven hoge heterogeniteit en in reactie op de micro-omgeving verschillende fenotypes 1 aannemen. LPS (+ IFNy) geïnduceerde klassiek geactiveerd M1 of M (LPS) macrofagen bevorderen ontstekingen en beschermt de gastheer tegen verschillende microbiële 2 bedreigingen. Anderen gebruiken IFNy alleen of in combinatie met TNF als stimuli M1 polarisatie wekken. IL-4 en / of IL-13 induceert alternatieve activering van macrofagen en deze M2 of M (IL-4) cellen zijn krachtige onderdrukkers en controllers lopende immune responsen 3. Gepolariseerde macrofagen vertonen een duidelijke regeling van de celstofwisseling met LPS-geactiveerde M1 macrofagen ondergaat een metabole switch naar verbeterde glycolyse 4-6. Omgekeerd verhoogde vetzuuroxidatie (FAO) en mitochondriale oxidatiefe fosforylering (OXPHOS) levert duurzame energie in IL-4-geïnduceerde M2 macrofagen 7-9. Aldus veranderd metabolisme niet alleen een kenmerk van macrofaag gepolariseerde subsets, is een voorwaarde voor een goede polarisatie en inflammatoire regelgeving. Belangrijk is dat de remming van de glycolyse of OXPHOS / FAO is aangetoond M1 of M2 activatie aantasting respectievelijk 8,10. Als zodanig kunnen identificeren metabole veranderingen in macrofagen worden toegepast als middel om de polarisatie toestand en inflammatoire potentieel evalueren.

Een consequente test die macrofagen metabolisme maatregelen kan dus worden gebruikt om te voorspellen of een geneesmiddel, gen knock down of andere behandelingen invloed macrofaag polarisatie en functie. In deze video wordt een extracellulair flux analysator gebruikt om de bio-energetica profielen van naïeve, M1 en M2 macrofagen karakteriseren.

Dit manuscript Gegevens een geoptimaliseerd protocol dat de meting toestaatvan alle relevante parameters glycolyse (glycolyse, maximale glycolyse en glycolytische reserve) en mitochondriale functie kenmerken (totaal ademhaling, basale mitochondriale ademhaling, ATP productie, proton lek, maximale ademhaling en reserveonderdelen respiratoire capaciteit) in één test. Met behulp van deze experimentele opstelling, kan bio-energetica worden vergeleken tussen controle en 'veranderde' (bijvoorbeeld gen knock down, transgene overexpressie of farmacologische behandeling) cellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het kweken en Polarizing Bone Marrow-afgeleide macrofagen

  1. Dag 0: Isoleer bovenbeen en onderbeen botten 6-10 weken oude muizen van belang (C57BL / 6 in deze test).
  2. Verwijder spierweefsel uit de botten en plaats de botten in een 9 cm petrischaal gevuld met ijskoude PBS.
  3. Breng de botten om een ​​gerecht 9 cm Petri gevuld met 70% ethanol en schud de plaat gedurende 30 sec.
  4. Breng de botten vers 9 cm petrischaal gevuld met ijskoude steriele PBS.
  5. Snijd de femur en tibia aan beide uiteinden met steriele scharen.
  6. Spoel de botten met 10 ml ijskoude steriele PBS met behulp van een 10 ml spuit en een 25 G naald. Verzamel het beenmerg in een 50 ml buis.
  7. Breng de beenmergcellen in nieuw 50 ml buis met behulp van een 23 G naald.
  8. Herhaal deze stap met een 25 G naald. Opmerking: Deze stappen zijn nodig om de cel klonten en bot te verwijderen.
  9. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  10. Gooi de supernatant en resuspendeer de cellen in 40 ml celkweekmedium (RPMI-1640 plus 2 mM L-glutamine, 10% FCS, penicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml) en 15% gefiltreerd L-929 cellen ( ATCC CCL-1) -geconditioneerd medium met M-CSF (of als alternatief 10 ng / ml recombinant M-CSF in plaats van L-929-cellen geconditioneerd medium).
    Opmerking: Het produceren van L-929-cellen geconditioneerd medium werd eerder in dit tijdschrift in 2013 11 gedetailleerd
  11. Kweken van de cellen van één muis in twee 15 cm petrischalen (niet gebruikte celkweek behandelde platen aangezien macrofagen niet losmaken van deze kunststof) in 20 ml kweekmedium per plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  12. Voeg 10 ml vers celkweekmedium op dag 3, zonder de oudere 20 ml celkweekmedium.
  13. Vervang het medium van elke plaat met 20 ml vers kweekmedium op dag 6. Hierdoor wordt niet-hechtende cellen worden verwijderd.
  14. Dag 8:
    1. Los cellen door incubatie hen 5 min bij 37 ° C in 10 ml citraat zoutoplossing (135 mM kaliumchloride plus 15 mM natriumcitraat in H 2 O, geautoclaveerd) en wassen met 10 ml PBS. Count volwassen beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) op dag 8 met behulp van een cel teller.
    2. Controleer de vorming van volwassen (CD11b + F4 / 80 +) BMDM door visuele inspectie of door flowcytometrie. Vak 10 5 cellen met 1/100 anti-CD16 / CD32 in PBS gedurende 20 min in 100 pi PBS, geïncubeerd met anti-CD 11 b 1/200-FITC plus 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 bij kamertemperatuur, wassen en analyseren door flowcytometrie.
      Opmerking: Het kweken van muis beenmerg afgeleide macrofagen werd eerder in dit tijdschrift gepubliceerd in detail door Ying et al 11..
  15. Seed 50.000 cellen (optimaal celtellingen moeten worden geoptimaliseerd) per putje in een celcultuur microplaat in 100 pl kweekmedium. Heeft cellen in de achtergrond correctie putten (A1, A12, H1, H12) geen zaad en zet alleen medium (geen cellen) in deze putten. Tip: Houd de pipet in een hoek eenbout halverwege de zijkant van de putten voor de meest homogene cellaag.
  16. Laat de cellen om zich te vestigen bij RT in een celkweek kap voor 1 uur. Dit bevordert zelfs mobiele distributie en de rand te verminderen. Monitor hechting met behulp van een microscoop en cultuur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  17. Drie uur na plateren stimuleren cellen gedurende 24 uur met 10 ng / ml LPS, of 20 ng / ml recombinant muis IL-4 aan M1 of M2 macrofagen respectievelijk genereren. Omvatten onbehandelde naïeve (M0) macrofagen als controle. Evalueer goede M1 en M2 macrofaag polarisatie door meting van LPS-geïnduceerde afgifte van IL-6, IL-12, TNF (ELISA) en IL-4 geïnduceerde arginase-1 activiteit en / of MMR (CD206) en MGL (CD301) oppervlakexpressie (stromingscytometrie) zoals eerder beschreven 3,11.
    Opmerking: Op dit punt kan cellen (pre) zijn -behandeld farmacologische verbindingen van belang of macrofagen worden gestimuleerd met andere factoren. Daar zou de variatie tussen de afzonderlijke putten zijn substantial, verdient het aanbeveling om ten minste 4 en bij voorkeur 6 putjes gebruikt per conditie.

2. Bereiding van de extracellulaire Flux Assay

  1. Hydrateren de sensorcartridge een dag voor het uitvoeren van de test:
    1. Plaats de sensor cartridge ondersteboven naast het hulpprogramma plaat.
    2. Vul elk putje van het hulpprogramma plaat met 200 ul kalibratieoplossing en laat de sensor cartridge op het nut plaat onderdompelen de sensoren in de kalibratieoplossing.
    3. Controleer de kalibratieoplossing niveau hoog genoeg is om de verzonken sensoren en in een niet-CO 2 37 ° C incubator O / N houden.
  2. Bereid testmedium op de dag van de assay als volgt:
    1. Warm XF 50 ml basismedium tot 37 ° C.
    2. Voeg 500 ul 200 mM L-glutamine een 2 mM eindconcentratie te krijgen.
    3. Stel de pH tot 7,4 onder toepassing van 1 N NaOH en steriliseren met een 0,2 uM filter en houd het testmedium bij 37 ° C.
  3. Verwijder het celkweekmedium van de gepolariseerde macrofagen en het op -20 ° C voor toekomstig gebruik (bijvoorbeeld ELISA juiste macrofaag polarisatie te onderzoeken). Was de cellen met 100 ul assay medium, voeg 180 ul assaymedium per putje en controleren onder de microscoop dat cellen niet weg werden gewassen. Plaats de celkweek plaat in een 37 ° C incubator zonder CO 2 gedurende 1 uur voorafgaand aan de test run.
  4. Bereid 10 x injectie verbindingsmengsels A tot D zoals beschreven in tabel 1, warm tot 37 ° C, de pH op 7,4 en filter steriliseren.
    1. Maak alle verbindingen in deze mengsels 10x de eindconcentratie in de putjes celkweek en optimaliseren van deze concentraties voor elk celtype.
  5. Laad de sensorcartridge met de meegeleverde laad- geleiders aan aangegeven volumes (tabel 1) van de bereide 10x injectie verbindingsmengsels in poorten A, B, C en D, respectively.
Mengsel / Injection Verbindingen Volume toegevoegd aan 10x mengsel (pl) krijgen Volume bepaling (ml) Volume geïnjecteerd tijdens de run (pl) De eindconcentratie in de assay
EEN 2,5 M (45%) glucose 300 2.7 20 25 mM
B 5 mM oligomycin A (OM) 9 3.0 22 1,5 pM
C 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 pM
100 mM Natriumpyruvaat oplossing 300 1 mM
D 5 mM antimycin A (AA) 15 3.0 28 2,5 uM
5 mM rotenone (Rot) 7.5 1,25 uM

Tabel 1. Injectie mengsels.

3. Bioenergetische Karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 BMDM met een extracellulaire Flux Analyzer

  1. Maak een test sjabloon met de test tovenaar met 2 minuten MIX en 3 minuten MEASURE keer en (minstens) 3 mix en snelheidsmetingen lussen voor elk van de 4 injecties (tabel 1) en na de laatste injectie.
    Opmerking: Deze concentraties gelden voor beenmerg afgeleide macrofagen en RAW264.7 macrofaag cellijnen, maar moet worden geoptimaliseerd voor elk celtype. Het toevoegen van pyruvaat in het FCCP mengsel nodig om maximale ademhaling brandstof.
  2. Start de run door de startknop onderkant en volg de instructies van het apparaat. Eerste lading van de autocartridge plaat met de gehydrateerde sondes om de kalibratie van apparatuur en volgende lading van de cel plaat mogelijk te maken.
  3. Na de test zorgvuldig alle testmedium ontdoen en opslaan geanalyseerd celkweek microplaat bij -20 ° C voor toekomstig cell normalisatie met de celproliferatie assay kit zoals beschreven door de leverancier.
    1. In het kort bereidt een 1x cel-lysis buffer door verdunning component B 20-voudig gedestilleerd water en verdunde verbinding A 400-voudig in 1x cel-lysis buffer. Voeg 200 ul per putje, incubeer 5 min bij RT en meten van fluorescentie met ~ 180 nm excitatie en ~ 520 nm emissie maxima.
      Opmerking: Bij het werken met niet-hechtende cellen of slechte hechting een probleem, de directe celproliferatie kit kan worden gebruikt als alternatief omdat dit protocol niet vereist weggooien alle testmedium. Maar deze directe protocol iets minder gevoelig ten opzichte van het protocol in dit lab.
  4. Na fluorescentiemeting normaliserenhet aantal cellen in elk putje als een verhouding waarbij het gemiddelde aantal cellen van naïeve macrofaag putjes wordt ingesteld op 1.
    Opmerking: Protein kwantificeren (bijvoorbeeld met een BCA assay) kan worden gebruikt als een alternatieve manier om cellen tellingen normaliseren. Maar in onze handen deze test minder gevoelig ten opzichte van de celproliferatie assay kit.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadat de extracellulaire flux analyse en kwantificatie cel kunnen gegevens worden genormaliseerd voor cellen en geanalyseerd. Dit zal typisch opbrengst ECAR en OCR plaatsen zoals getoond in figuur 1A en figuur 1B.

Na de injectie van glucose (A), de verhoging van ECAR is de glycolyse rate. De extra verhoging van ECAR na remming ATP synthase met oligomycin (B) geeft informatie over de glycolytische reserve en de capaciteit (Figuur 1A). Bij het analyseren van de OCR waarden oligomycin injectie (B) maakt de berekening van het zuurstofverbruik voor mitochondriale ATP-synthese. FCCP (C) koppelt mitochondriale ademhaling en de bijbehorende OCR metingen gegevens opleveren over de maximale capaciteit van de luchtwegen en reserveonderdelen. Tenslotte injectie van rotenon (Rot) en antimycin A (AA) blok mitochondriale complex I en III en de overblijvende OCR vertegenwoordigt de niet-mitochondriale zuurstof consumption (Figuur 1B).

figure-results-1
Figuur 1: Metabolic parameters uit een XF extracellulaire flux assay. (A) De volgende parameters van cellulaire glycolyse worden berekend uit de ECAR waarden (in mph / min): glycolyse, maximale glycolytische capaciteit en glycolytische reserve. (B) OCR metingen (in pmol / min) worden gebruikt om de volgende fundamentele parameters van mitochondriale functie te berekenen: basale ademhaling, ATP productie, proton lek, maximum ademhaling en reserve longcapaciteit. Gluc = glucose; OM = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide 4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon; AA = antimycin A; Rot = Rotenon Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na de run, ECAR en OCR metingen 1 till 15 voor elk putje kan als volgt worden geëxporteerd naar Excel en de volgende glycolytische parameters kunnen worden berekend uit de ECAR metingen:

Non-glycolytische verzuring = gem. ECAR (1,2,3)

Glycolyse = gem. ECAR (4,5,6) - gem. ECAR (1,2,3)

Maximale glycolytische capaciteit = gem. ECAR (7,8,9) - gem. ECAR (1,2,3)

Glycolytische reserve = gem. ECAR (7,8,9) - gem. ECAR (4,5,6)

Van de OCR-tarieven, kan de volgende metabole kenmerken worden bepaald:

Niet-mitochondriale respiratie = gem. OCR (13,14,15)

Basale ademhaling = gem. OCR (4,5,6) - gem. OCR (13,14,15)

ATP productie = gem. OCR (4,5,6) - gem. OCR (7,8,9)

Proton lek =gem. OCR (7,8,9) - gem. OCR (13,14,15)

Maximale ademhaling = gem. OCR (10,11,12) - gem. OCR (13,14,15)

Spare luchtwegen capaciteit (SRC) = gem. OCR (10,11,12) - gem. OCR (4,5,6)

figure-results-2
Figuur 2:. Metabole eigenschappen van naïeve (M0), LPS (M1) en IL-4- (M2) gepolariseerde macrofagen Voor elke meting de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (SEM) van 8 afzonderlijke putjes wordt gepresenteerd. (A) Extracellulaire verzuring rates (ECAR, in mph / min) en (B) zuurstofverbruik (OCR, in pmol / min) worden gemeten differentieel gepolariseerd (M1 en M2) en naïeve macrofagen (M0). Alle metingen werden genormaliseerd voor celgetal (zoals gemeten met CyQUANT) en de gemiddelde celgetal van de naïeve macrofagen werd vastgesteld op 1.projectie A = glucose; B = oligomycin; C = FCCP; D = antimycin A + Rotenon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zoals getoond in figuur 2A, induceert activering van macrofagen met LPS verhoogde glycolytische stofwisseling. De verschillen tussen LPS en IL-4 behandelde macrofagen nog duidelijker als we kijken naar zuurstofverbruik (OCR) in figuur 2B. Inderdaad, terwijl de maximale oxidatieve metabolisme sterk onderdrukt M (LPS), IL-4 induceert basale vooral maximale ademhaling M2 macrofagen. Men moet er rekening mee dat de toegenomen glycolytisch is vrij uniek voor M (LPS) macrofagen en is niet noodzakelijk een kenmerk van M1 macrofagen sinds M (IFNy) macrofagen niet weergegeven verbeteren glycolyse.

Kortom, dit extracellulaire flux analyse toont that IL-4-geïnduceerde M2 ​​macrofagen worden gekenmerkt door verhoogde oxidatieve metabolisme en vooral een hoge reserve respiratoire capaciteit (SRC), terwijl LPS-geactiveerde macrofagen weergave verbeterde glycolytische stofwisseling en geen reserve-respiratoire capaciteit bezitten.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van ons laboratorium is te begrijpen hoe macrofaag polarisatie en functie te beïnvloeden met als uiteindelijke doel uitkomst van atherosclerose en andere ontstekingen 12 verbeteren. Macrofaag polarisatie bepalen, meet men gewoonlijk het LPS (+ IFNy) en geïnduceerde IL-4 geïnduceerde genexpressie van M1 en M2 merkergenen (qPCR) bepaalt IL-6, IL-12, TNF en NO secretie (door ELISA en Griess reactie) en onderzoekt IL-4-geïnduceerde CD71, CD206, CD273 en CD301 oppervlakte-expressie (door flowcytometrie) en arginase activiteit 3,13. Bovendien kan apoptose-assays (door Annexine-V / PI-kleuring), fagocytose assays (met fluorescerende kralen latex en / of pHrodo E. coli) en schuimcelvorming assays (op DII-oxLDL opname, LipidTOX neutraal lipide kleuring) worden uitgevoerd om evalueren macrofaag functionaliteit 14. Bovendien kan extracellulair flux analyse worden uitgevoerd om bio-energetica profielen van gepolariseerd mac metenrophages als een nieuwe en alternatieve functionele uitlezing.

Dit manuscript blijkt dat macrofaag polarisatie induceert metabole herprogrammering met LPS geïnduceerde macrofagen schakelen verhoogde glycolyse als hun energiebron. Omgekeerd, IL-4 geïnduceerde M2 ​​macrofagen gebruiken mitochondriale oxidatieve fosforylering als de belangrijkste bron van ATP. Belangrijk metabole herprogrammering niet alleen energie voor de specifieke eisen van M1 en M2 gepolariseerde macrofagen. Inderdaad, metabole veranderingen beïnvloeden metabolietconcentraties dat de directe regulatoren van de macrofaag fenotype 10,15,16 zijn. Daarom macrofaag metabolisme niet alleen een kenmerk (zoals hier in figuur 2), maar ook een bestuurder afzonderlijke macrofagen polarisatietoestanden en deze kennis achter de snelle groei van de immunometabolism onderzoeksgebied gedurende de laatste jaren.

Echter, robuuste metingen van metabole profielen in macrofagen bleef moeilijk en hadden hun beperkingen. In deze studie wordt een extracellulair flux analysator toegepast robuuste meten glycolyse, glycolytische reserve, maximale glycolytische capaciteit niet glycolytische verzuring, basale en maximale ademhaling, ATP productie, spare ademhalingscapaciteit, proton lek en non-mitochondriale ademhaling in real-time in een minimale hoeveelheid macrofagen.

Daarom hebben we aangepast en verbeterd protocollen van de producent volgende. De standaard Mito Stress Test (# 103015-100) suggereert met medium met glucose en pyruvaat en een protocol met 3 injecties (OM, FCCP, AA / Rot). We kiezen voor de test met glucose / pyruvaat-vrij medium te starten, voeg glucose als eerste injectie bij poort A (zoals in de glycolyse Stress Test # 103020-100) en voeg pyruvaat met de ontkoppelaar FCCP in port C. Hiermee alle relevante glycolyse parameters zijn afgeleid van de ECAR metingen 1-9 en alle relevante informatie over mitochondrial functie van OCR metingen 4-15.

Merk op dat het van cruciaal belang om pyruvaat samen injecteren met FCCP om maximale ademhaling brandstof op ontkoppeling. Alvorens deze gecombineerde protocol, moet men ook na of 2-deoxy-D-glucose (2-DG) verlaagt ECAR niveaus na de test om de basiswaarden (1-3) en dat de geregistreerde ECAR tarieven 4-6 zal immers glycolyse. Bovendien moet men begrijpen dat de verbinding concentratie en celaantallen in dit manuscript gelden voor beenmerg afgeleide macrofagen en RAW264.7 macrofaag cellijnen en worden geoptimaliseerd voor andere celtypen. Bovendien moet men er rekening mee dat M-CSF dat gebruikt wordt voor beenmerg afgeleide macrofagen genereren bevordert een M2-achtige anti-inflammatoir fenotype. De gepresenteerde resultaten uit beenmerg afgeleide macrofagen kunnen derhalve niet volledig vergelijkbaar metingen met primaire weefsel macrofagen of macrofagen cellijnen die geen M-CSF vereisen tijdens cell culturing.

Vergeleken met bestaande methoden, dit protocol vereist minimale hoeveelheden macrofagen en snel biedt vrijwel alle fundamentele metabolische cel kenmerken. Dit resulteert in voldoende overschot cellen om andere immunologische assays en zelfs de cellen die voor bioenergetica profilering nog kunnen worden gebruikt voor andere opzettelijke na de assay uit te voeren. Bovendien is de specifieke 96 well plaat formaat kan beoordelen van meerdere voorwaarden in real time tegelijkertijd. Toch kan de variatie tussen individuele wells aanzienlijk en derhalve het gebruik van ten minste 4 putjes per aandoening wordt vaak gewenst. Genomen deze beperking in aanmerking beschreven extracellulaire flux analyse laat nog meer dan 10 proefomstandigheden werking (n = 6) in een keer, wat veel meer is dan traditionele technieken.

Kortom, dit artikel biedt een eenvoudige en reproduceerbare functionele test die het mogelijk maakt het meten van alle relevante glycolyse en mitochondriale parameters in gepolariseerd macrofaag subsets. Deze techniek kan dienen als een toekomstige toepassing macrofaagfunctie beoordelen en om het effect van verschillende manipulaties (bijv gen neerslaan, nieuwe geneesmiddelen, enz.) Op de macrofagen (metabolisch) fenotype te evalueren. Als zodanig kan extracellulair flux-gegevens worden gecombineerd met andere assays om diepgaande karakterisering van de macrofaag activatie kunnen weergeven.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Seahorse Bioscience.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan Van den Bossche ontving een Junior Postdoc-beurs van de Netherlands Heart Foundation (2013T003) en een VENI-beurs van ZonMW (91615052). Menno de Winther is een Established Investigator van de Netherlands Heart Foundation (2007T067), wordt ondersteund door een Netherlands Heart Foundation-beurs (2010B022) en bezit een AMC-fellowship. We danken ook de steun van de Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, de Netherlands Organization for Health Research and Development en de Royal Netherlands Academy of Sciences voor het GENIUS-project “Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis” (CVON2011-19). We danken Seahorse Bioscience voor het mogelijk maken van open access publicatie. De auteurs danken Riekelt Houtkooper en Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) voor alle eerdere assistentie met de Seahorse-analyzer.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
23G en 25G naaldenBecton Dickinson#300800 en #300600Om beenmerg door te spoelen
10 ml spuitenBecton Dickinson#307736Om beenmerg door te spoelen
PetrischalenGreiner#639161Om beenmergcellen te kweken
CyQUANT Celproliferatie Assay kit Molecular Probes#C7026Voor celkwantificering op een later tijdstip (werkt alleen voor adherente cellen)
CyQUANT Direct Celproliferatie Assay kit Molecular Probes#35011Voor celkwantificering direct na het assay (niet-adherente cellen)
XFe96 celcultuur microplaatSeahorse Bioscience#101085-00496-wellplaat waarin cellen worden gekweekt en waarin het assay wordt uitgevoerd
recombinant muis interleukine-4 (IL-4)Peprotech#214-14-BWordt gebruikt om alternatieve macrofaagactivering te induceren
lipopolysacharide (LPS)Sigma#L2637Pro-inflammatoir stimulus
Seahorse Sensor Cartridge Seahorse Bioscience#102416-100Bevat de sondes voor pH- en O2-meting
Seahorse XF Calibrant Seahorse Bioscience#100840-000Nodig om de sondes een nacht te hydrateren 
XF basismedium Seahorse Bioscience#102353-100Buffer-vrij medium dat een efficiënte meting van pH-veranderingen mogelijk maakt
L-glutamineLife Technologies#25030-081
D-(+)-GlucoseSigma#G8769Brandstof voor glycolyse eenmaal toegevoegd aan de cellen
oligomycine ASigma#75351Remt mitochondriale ATP-synthase
FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon)Sigma#C2920Ontkoppelt mitochondriale ademhaling
100 mM natriumpyruvaat oplossingLonza#BE13-115EMaakt maximale mitochondriale ademhaling mogelijk zonder de behoefte aan glycolyse
Antimycine ASigma#BE13-115EA8674Remt complex III van de mitochondriën
RotenoneSigma#BE13-115EA8674R8875Remt complex I van de mitochondriën
Casy Cell CounterRoche Diagnostics#05 651 697 001Instrument om cellen te tellen
anti-CD16/CD32eBioscience#14-0161Fc receptor blokkeer flowcytometrie
anti-F4/80-APC-eFluor780eBioscience#47-4801Antilichaam om macrofagen te kleuren
anti-CD11b-FITCeBioscience#11-0112Antilichaam om macrofagen te kleuren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436(2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420(2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

M1 macrofaagpolarisatieM2 macrofaagpolarisatieglycolisch metabolismemitochondriaal oxidatief metabolismezuurstofconsumptiesnelheidextracellulaire verzuringssnelheidreserve respiratoire capaciteitreal time metabole assay

Gerelateerde artikelen