Ontwikkeling van een colloïdaal goud-gebaseerde immunochromatographic teststrip voor detectie van walvisachtigen Myoglobin

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van twee IgG-klasse monoklonale antilichamen (mAbs) die sterk reageren op myoglobine van cetacean. Deze mAbs worden toegepast op een colloïdaal goud immunochromatografische teststrip op basis van het sandwich-formaat om het Mb van cetacean te onderscheiden van zeehond en andere dieren.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een immunochromatografische teststrip van colloïdaal goud op basis van het sandwich-formaat dat kan worden gebruikt om het myoglobine (Mb) van cetaceën te onderscheiden van dat van zeehonden en andere dieren. De strip biedt snel en ter plaatse screening voor cetaceënvlees, waardoor de illegale handel en consumptie ervan wordt beperkt. Er werden twee monoklonale antilichamen (mAbs) ontwikkeld met reactiviteit naar de Mb van cetaceën. De aminozuursequenties van Mb-antigene reactieve regio's van verschillende dieren werden geanalyseerd om twee synthetische peptiden (een algemeen peptide en een specifiek peptide) te ontwerpen en vervolgens de mAbs (subklasse IgG₁) te kweken. De mAbs werden geselecteerd uit hybridomen die werden gescreend door indirect ELISA, western blot en dot blot. CGF5H9 was specifiek voor de Mb's van konijnen, honden, varkens, koeien, geiten en cetaceën, terwijl het zwakke tot geen affiniteit vertoonde voor de Mb's van kippen, tonijn en zeehonden. CSF1H13 kan zich met sterke affiniteit binden aan zeehonden en cetaceën, maar vertoonde geen affiniteit voor andere dieren. Cetaceënmonsters uit vier families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae en Kogiidae) werden in dit onderzoek gebruikt, en de resultaten gaven aan dat deze twee mAbs een brede bindingscapaciteit hebben voor Mb's van verschillende cetaceën. Deze mAbs werden toegepast op een sandwich-type colloïdaal goud immunochromatografische teststrip. CGF5H9, dat veel soorten herkent, werd colloïdaal goud-gelabeld en gebruikt als detectie-antilichaam. CSF1H13, dat op de testzone werd gecoat, detecteerde de aanwezigheid van cetaceën en zeehonden Mb's. Spiermonsters van tonijn, kip, zeehond, vijf soorten landzoogdieren en 15 soorten cetaceën werden driemaal getest. Alle cetaceënmonsters vertoonden positieve resultaten en alle andere monsters vertoonden negatieve resultaten.

Inleiding

Histologisch gezien wordt walvissenvlees in veel delen van de wereld gegeten en deze consumptie gaat vandaag nog door¹. Vanwege het trofische niveau van walvissen, is het bekend dat hun vlees hoge niveaus van kwik en andere toxines bevat². Daarom kan de consumptie van walvissenvlees leiden tot gezondheidsproblemen, niet alleen voor risicogroepen zoals zwangere vrouwen, maar ook voor de algemene bevolking³. Bovendien kan de besmetting van walvissenvlees met zoönotische of potentieel zoönotische pathogenen ook optreden tijdens de verwerking en opslag⁴. Het is zelfs voor ervaren agenten moeilijk om walvissenvlees alleen aan zijn uiterlijk te identificeren. Daarom is een betrouwbare wetenschappelijke identificatiemethode vereist om walvissenvlees te onderscheiden van andere vleessoorten. Dit zou helpen om de consumptie van walvissenvlees te beperken.

Huidige methoden voor soortidentificatie omvatten moleculaire technieken en immunologische methoden. Moleculaire technieken, zoals polymerasekettingreactie (PCR) en DNA-sequencing, kunnen worden gebruikt om monsters te identificeren, niet alleen van rauw vlees⁵ en ontbonden monsters⁶, maar ook van verwerkte voedingsmiddelen zoals gekookte worst en voedermiddelen^7,8. Immunologische methoden, zoals enzymgekoppelde immunosorbeertest (ELISA), worden vaak toegepast in de voedselproductie om het vleesgehalte te detecteren van bijvoorbeeld varkensvlees⁹, rundvlees¹⁰ en meerval¹¹. PCR-gebaseerde DNA-analyse voor de identificatie van walvissenvlees is beschikbaar¹² en heeft geholpen bij het voorkomen van de illegale internationale handel in walvissenvlees in Japan, Zuid-Korea, de Filippijnen, Taiwan, Hong Kong, Rusland, Noorwegen en de Verenigde Staten¹. Deze methoden zijn effectief en betrouwbaar, maar ze kunnen uren of dagen duren om te voltooien en omvatten bewerkelijke stappen. De identificatie van walvissenvlees is meestal gebaseerd op moleculaire technieken en er is momenteel geen immunologische methode beschikbaar. Voor regelgevende instanties is het zeer wenselijk om een betrouwbare en snelle techniek te ontwikkelen die in het veld kan worden gebruikt om walvissenvlees te identificeren.

Immunochromaotgrafische strips worden gebruikt als detectiemiddelen met het voordeel dat ze snel resultaat produceren via een eenvoudig protocol dat geschikt is voor gebruik in het veld. De principes van de immunochromatografische strip en ELISA zijn zeer vergelijkbaar en omvatten antilichamen, antigenen en labels. Er zijn veel verschillende labels zoals colloïdaal goud, koolstof en latex gebruikt bij de ontwikkeling van immunochromatografische strips. Momenteel wordt deze methode veel gebruikt voor het detecteren van antibiotica, toxines, bacteriën en virussen¹³, maar het wordt zelden gebruikt voor het identificeren van eiwitten in vlees^14,15. Hier stellen we een lateral-flow chromatografische enzymimmunoassay voor voor de snelle detectie van walvissenmyoglobine (Mb).

Protocol

Ethiek Verklaring: De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met internationale richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van National Chiayi University, goedkeuring ID: 99022. De walvisachtige steekproef gebruik werd toegestaan ​​door de Raad van Landbouw van Taiwan (Research Permit 100M-02.1-C-99).

1. Muscle Monstervoorbereiding en SDS-PAGE

Opmerking: Muscle-monsters van 23 soorten, waaronder 16 soorten zeezoogdieren, 5 soorten landzoogdieren, tonijn en kip werden gebruikt in deze studie (tabel 1). De walvisachtige spier monsters werden verkregen van gestrande personen, visserij bijvangst, en confiscatie. Konijn, ratten, honden en kippen spierweefsel werden verkregen uit Animal Disease Diagnostisch Centrum van de Nationale Chiayi University. Monsters van rundvlees, varkensvlees, lamsvlees, tonijn en werden gekocht bij een supermarkt. De spier steekproef van gewone zeehond (Phoca vitulina ) werd verstrekt door Farglory Ocean Park. Natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) werd toegepast voor oplosbare eiwitten scheiden met verschillende molecuulgewichten in de spieren monsters.

1. Bewaar alle monsters bij -20 ° C tot gebruik.
2. Pre-cool mortel bij -20 ° C. Dan zet 3 g bevroren spier monster in.
3. Homogeniseer het monster met 10 ml koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met een weefselhomogenisator.
4. Centrifugeer het gehomogeniseerde monster bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof en het op -20 ° C tot gebruik.
5. Bereid 5 ml van 5% stacking gel (3,07 ml gedestilleerd water, 1,25 ml van 4x bovenste gel buffer van pH 6,8, 625 ui 40% acrylamide, 50 ui 10% ammoniumpersulfaat (APS) en 5 gl tetramethylethyleendiamine ( TEMED)) en 10 ml 15% scheiden gel (3,65 ml gedestilleerd water, 2,5 ml van 4x lagere gel buffer van pH 8,8, 3,75 ml 40% acrylamide, 100 pl 10% APS,en 4 pl TEMED).
   1. In de elektroforesecel, pour stapelgel (5% acrylamide) bovenop de scheidende gel (15% acrylamide) nadat dit gestold. Plaats een gel kam in het stapelen gel.
6. Voer PAGE volgens de volgende voorwaarden: eerste run conditie: 100 volt, 20 min en laatste voorwaarde: 120 volt, 40 min.
7. Vlekken op de gel met Coomassie brilliant blauw bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten totdat de gel gelijkmatig blauwe kleur.
   Opmerking: Kleuring is voltooid wanneer de gel niet meer zichtbaar is in de kleurstofoplossing.
8. Ontkleuring met azijnzuuroplossing (10%) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Bands zullen beginnen te verschijnen. Doorgaan ontkleuren wordt uitgevoerd bij 4 ° C gedurende de nacht, totdat de achtergrond is duidelijk.

2. Peptide Synthese en productie van monoklonale antistoffen

1. Haal de aminozuursequenties van Mb van GenBank waaronder tonijn, kip, struisvogel, gedomesticeerde zoogdieren, afdichting en 18 soortenvan walvisachtigen (tabel 2).
2. Lijn de sequenties met de juiste software ^16:
   1. Start de Alignment Explorer door de optie Align: Bewerken / Build Alignment op de startbalk; selecteer Create New Alignment en klik op OK. Er verschijnt een dialoogvenster de vraag "Bent u het bouwen van een DNA of proteïne sequence alignment? '
   2. Klik op de knop "Protein"; kies Data: Open: Ophalen sequenties uit bestand en selecteer volgorde file; selecteer de Edit: Kies Alle menu-opdracht om alle sites voor elke rij in de voor het creëren van een multiple sequence alignment gegevens te selecteren.
   3. Kies Alignment: Lijn door ClustalW in het hoofdmenu om de geselecteerde sequenties gegevens met behulp van de ClustalW algoritme af te stemmen; selecteer "BLOSUM" als de Protein Weight Matrix en klik op de knop OK.
3. Analyseer de sequence alignment:
   1. Focus op 5 antigene reactieve sites ^17: plaats 1 (AKVEADVA, 15-22), site 2 (KASEDLK, 56-62), plaats 3 (ATKHKI, 94-99), plaats 4 (HVLHSRH, 113-119) en plaats 5 (KYKELGY, 145- 151) en vind het fragment geconserveerd onder walvisachtigen. Een * (asterisk; consensus symbool in de uitlijning (Protocol 2.2.3)) geeft aan posities die een enkele, volledig geconserveerde resten te hebben. De volgende geconserveerde fragmenten in walvisachtigen werden gevonden: opeenvolging KASEDLKKHG (welke site 2 bevat) en de volgorde HVLHSRHP (welke site 4 bevat).
4. Synthetiseren kandidaat sequentiefragmenten volgens de sequentieanalyse en conjugaat met ovalbumine eiwit (OVA) als dragereiwit via andere voorzieningen.
   1. Voeg hydrofobe aminozuren (bijvoorbeeld methionine) aan de N-terminus van antigene reactieve plaats te voorkomen dat het peptide van ontleding (bijvoorbeeld M-KASEDLKKHG).
   2. Verleng de C-terminus van antigene reactieve plaats voor het belichten van de belangrijkste antigene plaats op de immunocyt. Bovendien conjupoort het peptide OVA door toevoeging van een cysteïne (Cys, C) aan de C-terminale (bijvoorbeeld M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
5. Emulgeren compleet Freund's adjuvans immunogeen voor 1 of incompleet Freund's adjuvans immunogeen voor 2 met een gelijk volume van elk synthetisch peptide in PBS (3 ml, eindconcentratie 30-50 ug / 100 pl).
6. Inoculeren immunogeen 1 (0,1 mg) subcutaan in elk van 5 BALB / c muizen.
7. Voer subcutane booster injecties vijfmaal behulp immunogeen 2 bij tussenpozen van twee weken en laat testsera door staart clip bemonstering van de muizen voor elke booster.
8. Bepaal sera titer voor de eerste screening.
   1. Oplossen 100 ug vrij peptide in 25 ml reactiebuffer en aliquot 50 ul van de oplossing in elk putje van een 96-wells plaat. Voeg 10 ul koppelingsreagens oplossing in elk putje en meng de plaat. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
   2. Verwijder de inhoud van de put,wassen elk putje 3 keer met gedestilleerd water, en blokkeert de plaat door toevoeging van 200 ul van blokkeeroplossing. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Verwijder de inhoud en was elk putje 3 keer met gedestilleerd water.
   3. Voer indirecte ELISA (Protocol 5,1-5,7) voor het bepalen sera titer voor de eerste screening. Kies de muis met de hoogste titer (hoogste optische dichtheid) voor de milt collectie.
9. Drie dagen vóór de milt verzamelen, enten 0,1 mg immunogeen 1 subcutaan in de muis met het hoogste titer.
10. Verzamel de miltcellen van de geïmmuniseerde muizen en geselecteerde zekering murine myeloomcellen F0 (SP2 / 0-Ag14) om hybridoma cellen te verkrijgen voor mAb productie ^18.
11. 14 dagen na de fusie, selecteert u de positieve klonen door het screenen van de reactiviteit van hybridomasupernatanten in de richting van vrije synthetisch peptide met behulp van indirecte ELISA (Protocol 5,1-5,7).
12. Verdun de cellen om een ​​geschikt aantal per goed voor maximizing het aantal putjes dat slechts één enkele kloon (verdunning klonering) bevatten.
    1. Voeg 100 pi celkweekmedium alle putjes in 96-well plaat, behalve goed A1 die leeg wordt gelaten.
    2. Voeg 200 ul van de celsuspensie goed A1. Vervolgens snel 100 ui overbrengen van A1 naar B1 en meng door voorzichtig pipetteren. Herhaal deze 1: 2 verdunningen over de gehele kolom, en verwijder vervolgens 100 pl van H1 zodat het eindigt met hetzelfde volume als de putjes erboven.
    3. Een extra 100 ul medium naar kolom 1 met een 8-kanaals micropipet. Vervolgens snel overbrengen 100 gl van elk van de wells in kolom 1 die in kolom 2 met dezelfde pipet en meng door voorzichtig pipetteren.
    4. Met behulp van dezelfde tips, herhaalt u deze 1: 2 verdunningen over de gehele plaat. Gooi 100 gl van elk van de putten in de laatste kolom.
    5. Breng het uiteindelijke volume van 200 pl putten door toevoegen van 100 ul medium in elk putje. Incubate plate ongestoord bij 37 ° C in een bevochtigde _CO2 incubator.
    6. Controleer elke goed en markeer alle putten die slechts een enkele kolonie bevatten. Voer twee of meer kloneringen totdat> 90% van de putjes die enkelvoudige klonen positief antilichaamproductie zijn.
13. Zeef de klonen door western blot en dot blot (protocol 3,1-4,6). Vervolgens subcultuur kolonies van de putjes in grotere vaten cellen voor het verkrijgen mAb breiden. Meestal elke kloon overgebracht naar een enkel putje in een 12- of 24-well plaat.
14. Meet de verwantschap tussen de mAb's en de spier uittreksels van koe, geit, varken, hond, konijn, tonijn, kip, seal, en vier representatieve soorten walvisachtigen door western blot en dot blot (protocol 3,1-4,6).
15. Inoculeren geselecteerde hybridoma cellen (maximaal 3 x 10 ⁶⁾ intraperitoneaal in muizen om ascites te induceren. Zwelling van de buik is meestal duidelijk binnen 7-10 dagen na hybridoma injectie. Verzamel vloeistof met behulp van een injectienaald(Minder dan 20 gauge).
16. Centrifuge ascitesvloeistof (10.000 g gedurende 10 min) om cellen en resten te verwijderen. Filtreer door een 0,45 pm filter. Voeg 1 tot 20 ml monster, 15 ml bindingsbuffer, en 3-5 ml elutiebuffer in het proteïne G Sepharose-kolom. Verzamel de elutie fractie die gezuiverd antilichaam uit muizen ascitesvloeistof.
17. Bepaal het antilichaam isotype van antilichaam Isotypering Kit middels instructies van de fabrikant.

3. Western Blot

1. Bereid 2x laadbuffer bevattende β-mercaptoethanol (BME) door mengen van 950 ui van 2 x Laemmli monsterbuffer met 50 pl BME. Verdun de spier supernatanten (protocol 1,1-1,4) bij het laden buffer met geschikte verhouding voor het verkrijgen van een goede signalen: 01:50 (walvisachtigen en seal) en 1: 5 (huisdieren en tonijn) bij het gebruik van polyklonaal konijn anti-humaan antilichaam Mb, en 1: 1 (varken, konijn, kip en tonijn), 1: 5 (koe, geit en hond) en 01:25 (walvisachtigen en seal) wanneer eenntibody is van hybridoma supernatant.
2. Warmte monster bij 95 ° C gedurende 5 minuten. samples in de putjes van SDS-PAGE gel (4% acrylamide stapelen en 12% acrylamide scheidende) met molecuulgewicht merkers. Voer de elektroforese gedurende 5 minuten bij 50 V verhogen dan de spanning tot 150 V aan de punt af in ongeveer 1 uur.
3. Plaats de gel in 1x overdracht buffer gedurende 15 min. Breng de gescheiden eiwitten naar nitrocellulose (NC) membranen nadat ze zijn gescheiden door PAGE. Transfer kan worden gedaan bij 100 V gedurende 60-90 min.
4. Bereid blokkeeroplossing: 1x PBS met 0,1% Tween 20 met 5% magere melkpoeder. Blokkeer de NC membraan in 25 ml blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was driemaal gedurende 5 minuten elk met 15 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing met Tween 20 (PBST).
5. Incubeer het membraan en primaire antilichaam (ascitesvloeistof of hybridoma supernatant) in 10 ml antilichaam verdunningsbuffer verdund met 5% blokkeeroplossing bij 4 ° C overnacht.
6. Was de membraame driemaal opnieuw met PBST schoon te maken uit overmatige antilichaam.
7. Incubeer het membraan met alkalische fosfatase geconjugeerd geit anti-muis IgG 1: 1250 in blokkerende oplossing onder zacht schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
8. Was het membraan opnieuw en incubeer in het 5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat / p-nitroblauwtetrazolium chloride (BCIP / NBT) fosfatase substraat mengsel gedurende 10 tot 20 minuten tot kleurontwikkeling.
9. Stop de reactie door het wassen van het membraan verscheidene veranderingen gedestilleerd water.

4. Dot Blot

1. Verdun de spier supernatanten (protocol 1.1-1.4) in 5% runderserumalbumine (BSA) in PBST met geschikte verhouding voor het verkrijgen van goede signalen: 1: 5 voor huisdieren en tonijn en 1:25 voor walvissen en afdichting. Spot 5 pl van de monsters op het membraan. Minimaliseren het gebied dat de oplossing doordringt (gewoonlijk 3-4 mm diameter) door langzaam toe te passen.
2. Droog de ​​membraan bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld </ Em> in een laminaire stroom gedurende 30-60 min), blokkeren met blokkeeroplossing petrischaal gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en wassen met PBST.
3. Incubeer het membraan met primair antilichaam (mAb van hybridoma supernatant bij 1: 10.000 of ascitesvloeistof op 1: 100.000 verdund in 5% blokkeeroplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
4. Gebruik PBST het membraan drie keer wassen gedurende 5 minuten elk om overmaat antilichaam te verwijderen en daarna geïncubeerd met secundair antilichaam (aan alkalische fosfatase geconjugeerd geit anti-muis IgG 1: 1250 in 5% blokkeeroplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd .
5. Was het membraan opnieuw en incubeer in de BCIP / NBT fosfatase substraatmengsel binnen 10 tot 20 minuten tot kleurontwikkeling.
6. Stop de reactie door het wassen van het membraan verscheidene veranderingen gedestilleerd water.

5. Indirecte ELISA

1. Bereid wasbuffer (0,002 M imidazool gebufferde zoutoplossing met 0,02% Tween 20). Was de plaat 3 keer met het wassenbuffer tussen elke volgende stap (protocol 5,2-5,5).
2. Bereid 1:25 verdunning van de spier supernatanten (protocol 1,1-1,4) in coating buffer. Coat een 96-well ELISA-plaat met 100 gl verdunde supernatant bij 4 ° C gedurende de nacht en geblokkeerd met blokkeerbuffer (1% BSA in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
3. Bereid 1: 2000 verdunning van het gezuiverde mAb met verdunde buffer en voeg 100 pl verdund mAb aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
4. Add geit anti-muis IgG geconjugeerd met mierikswortel peroxidase (1: 200 verdunning in buffer verdund) voor verdere incubatie.
5. Voeg peroxidase substraat aan elke well (100 ul / well) en geïncubeerd gedurende 10-15 min.
6. Stop de reactie door het enzym peroxidase stopoplossing (100 gl / putje) bij kleurontwikkeling waargenomen.
7. Lees de optische dichtheid bij 450 nm met behulp van een microplaat spectrofotometer.

6. Bereiding van colloïdaal goud-gelabelde mAb

Opmerking: De kleur van colloïdaal goud oplossing en het mengsel altijd rood. Stel de pH, concentratie van mAb, centrifuge snelheid bij het zwarte neerslag wordt opgemerkt. 6.1 en 6.2 zijn optimalisatie stappen.

1. Voeg detecteren gezuiverde mAb (50 ug / ml, 3 ui) aan 100 ui colloïdaal goud oplossing met een pH variërend van 5-9. De minimale pH dat de kleur rood blijft gedurende twee uur wordt beschouwd als de optimale pH. Opmerking: In deze studie werd 0,1 M kaliumcarbonaat gebruikt colloïd goud (40 nm) tot pH 8,0 (optimale pH) passen.
2. Voeg verschillende hoeveelheid gezuiverde mAb detecteren (500 ug / ml, 1-20 ul) aan 100 ui colloïdaal goud oplossing bij pH 8,0. Opmerking: De optimale concentratie in deze studie is 6 ug / ml (geen zwarte neerslag).
3. Volgens de bovenstaande resultaten, voeg 60 ug gezuiverd detecteren mAb druppelsgewijs aan 10 ml colloïdale goudoplossing. Emulgeren van het mengsel langzaam bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Advertentied 2 ml 5% BSA-oplossing in PBS (pH 7,4) aan het mengsel en emulgeren voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 15 min achtergrondinterferentie verminderen.
4. Centrifugeer het mengsel bij 10.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
5. Verwijder het supernatant met ongeconjugeerde antilichaam zorgvuldig en schorten de verkregen pellets in 4 ml PBST dat 1% BSA en 0,1% Tween 20, en herhaal centrifugeren en suspensie meerdere malen.
6. Schorsen de laatste neerslag in 1 ml PBST en het op 4 ° C tot gebruik.

7. Bouw van Immune Strip

Opmerking: Figuur 1 toont het immuunsysteem strip ontwerp. Voorbereiden en monteren van de strips in een lage luchtvochtigheid laboratorium milieuconditie (<20% relatieve vochtigheid) voor langere houdbaarheid (> 1 jaar). De afmetingen van de pads en het membraan zijn: conjugaatpad 300 mm x 10 mm, absorberend kussen 300 mm x 24 mm, sample pad 300 mm x 24 mm, NC membraan 300 mm x 25 mm, plakbord 300mm x 80 mm.

1. Add colloïdaal goud gelabelde mAb oplossing van stap 6.6 met een micropipet op het conjugatiekussentje verzadigen en vervolgens drogen bij 37 ° C gedurende 1 uur vóór montage.
2. Verdeel het specifieke antigeen vangen mAb (500 ug / ml) op de testzone, en konijn anti-muis IgG (500 ug / ml) op de controlezone voor het detecteren van mAb op het NC-membraan met behulp van een pipet of immunostrip printer. Afstand bewaren (> 5 mm) tussen de twee zones om interferentie te voorkomen.
3. Plak de geconjugeerde pad, absorberend en NC membraan op het plakbord met dubbelzijdig tape.
   Opmerking: Overlap de elektroden aan weerszijden van het NC-membraan met ongeveer 2 mm. Ongepaste strip bouw zal leiden tot een onvolledige proef.
4. Het monster pad over het conjugaat pad (2 mm) en plak het op het plakbord.
5. Maak 6 mm brede stroken met een papieren cutter. Verpak de stroken in de aluminium folie zak met droogmiddel en bewaar ze bij 4 ° C tot gebruik.

8. Cross-reactiviteit Test

1. Homogeniseren 0,03 g ruwe spier monster met 1 ml PBS (met 0,1% BSA) in een 1,5 ml centrifugebuis met een bamboestok of malen staaf.
2. Houd de strip aan het eind tegenover de testgebieden en dompel de sample pad gedeelte in het model voor 5-10 min en direct waar te nemen van het resultaat.
   1. Optioneel: Verzamel 500 ul supernatant en overbrengen naar een nieuwe centrifugebuis.
      Opmerking: Deze stap wordt voorgesteld als het signaal niet duidelijk wanneer de strook direct geweekt in de supernatant.
3. Test verschillende spier monsters in drievoud.
   Opmerking: Hier hebben we getest tonijn, kip, seal, 15 soorten walvisachtigen en 5 soorten landzoogdieren.
4. Hebben vijf onafhankelijke inspecteurs herhalen 8.3 voor vijf keer, dat wil zeggen, gebruik maken van 575 strips in totaal.

Resultaten

Monoklonaal antilichaam karakteristieken

We ontwikkelden twee IgG ₁ mAb's (CGF5H9 en CSF1H13) de erkenning van twee synthetische peptiden (MKASEDLKKHGNTVLC en AIIHVLHSRHPAEFGC), respectievelijk van walvisachtigen Mb, en deze werden gebruikt om een sandwich-type colloïdaal goud immunochromatographic teststrip te construeren voor de snelle opsporing van walvisachtigen Mb. figuur 2 toont dat CGF5H9 detecteert walvissen en andere zoogdieren een be...

Discussie

Met behulp van een synthetisch peptide geconjugeerd aan dragereiwit opmerkelijk effectiever vergeleken met de verwante eiwit. Voor een sandwich gebaseerde techniek, omdat het mAb wordt ontwikkeld met behulp van epitopen met bekende relatieve locaties, beide mAbs in dit onderzoek waarschijnlijk niet interfereren met elkaar interactie met het doelantigeen epitoop. Bovendien kan de reactiviteit tussen het natieve eiwit en antilichaam van muizen geïmmuniseerd met het synthetische peptide-conjugaat sterker dan de reactivitei...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Phosphate buffered saline	AMRESCO	J373
Protein G HP SpinTrap	GE Healthcare	28-9031-34	spin column bevattende Protein G Sepharose
IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit	Roche	11493027001	Isotype strips, voorgecoat met subklasse- en lichtketenuitspecifieke anti-muis-Ig antilichamen
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
Nitrocellulose membraan	Whatman	Z613630
Antibody blocker oplossing	LTK BioLaboratories		Om niet-specifieke bindingsinteracties van niet-specifiek IgG in de monsters te minimaliseren
BCIP/NBT fosfatas substraat	KPL	50-81-00
Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Muis	KPL	54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plaat	Thermo Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan EX ELISA lezer	Thermo Electron Corporation	51118170
Colloïdaal goud (40 nm) oplossing	REGA biotechnology Inc.		40-50 nm is geschikt voor immunostrip
Bovine serum albumine	Gibco	15561-020
Rapid test immno-strip printer	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000	Alleen geschikt voor kleinschalige productie van immunostrips voor onderzoeks- en ontwikkelingsdoeleinden
Strip componenten (NC membranen, monsterpads (#33 glas, S&S), conjugaatpads (#16S, S&S) en absorberende pads (CF6, Whatman))	REGA biotechnology Inc.
Freund’s adjuvant en incompleet Freund’s adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	Wordt gebruikt om water-in-olie emulsies van immunogenen te produceren
Acrylamid, gel buffer, ammoniumpersulfaat (APS), tetramethyleendiamine (TEMED)	Protech		Gelvoorbereiding voor SDS-PAGE
Coomassie briljante blauw R-250	Bio-Rad	1610436	Eiwitkleuring in SDS-PAGE gels
Laemmli monster buffer en β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610737, 1610710	Verdun eiwitmonsters voordat ze op SDS-PAGE gels worden geladen