Methodenartikel

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

DOI:

10.3791/53456

⸱

2 april 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, 2Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 3Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 4Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 5German Center for Neurodegenerative Diseases, 6Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo beeldvorming biedt ongekende toegang tot het dynamisch gedrag van cellulaire en subcellulaire structuren in hun natuurlijke context. Het uitvoeren van dergelijke beeldvormingsexperimenten bij hogere gewervelde dieren zoals zoogdieren vereist over het algemeen chirurgische toegang tot het onderzochte systeem. De optische toegankelijkheid van embryonale en larvale kievisjes maakt het mogelijk om dergelijke invasieve procedures te omzeilen en beeldvorming mogelijk te maken in het intacte organisme. Inderdaad is de kievis nu een goed gevestigd model om dynamisch cellulair gedrag te visualiseren met behulp van in vivo microscopie in een breed scala van ontwikkelingscontexten, van proliferatie tot migratie en differentiatie. Een recentere ontwikkeling is het toenemende gebruik van kievisjes om subcellulaire gebeurtenissen te bestuderen, inclusief mitochondriaal verkeer en centrosoomdynamiek. De relatieve gemak waarmee deze subcellulaire structuren genetisch kunnen worden gelabeld door fluorescerende eiwitten en het gebruik van lichtmicroscopietechnieken om ze af te beelden, transformeert de kievis in een in vivo model van celbiologie. Hier beschrijven we methoden om genetische constructen te genereren die organellen fluorescerend labelen, waarbij we mitochondriën en centrosomen als specifieke voorbeelden benadrukken. We gebruiken het bipartiete Gal4-UAS systeem in meerdere configuraties om de expressie te beperken tot specifieke celtypen en bieden protocollen om tijdelijk en stabiel transgene vissen te genereren. Ten slotte geven we richtlijnen voor het kiezen van lichtmicroscopiemethoden die het meest geschikt zijn voor het afbeelden van subcellulaire dynamica.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo beeldvorming verschaft directe visualisatie van cellulaire gedrag in de fysiologische context. De transparantie van de zebravis embryo's, hun snelle en externe ontwikkeling en een rijk scala aan genetische tools die tl-etikettering toe hebben bijgedragen aan het toenemende gebruik van in vivo microscopie om de dynamiek van de belangrijkste ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen op te helderen. Imaging studies van de ontwikkeling van het zenuwstelsel in de zebravis hebben bijvoorbeeld sterk uitgebreid onze kennis van het gedrag van neurale stamcellen en het lot van hun nageslacht met inbegrip van hun latere migratie, differentiatie en integratie circuit 1-8.

Het podium is nu ingesteld om de subcellulaire dynamiek ten grondslag liggen aan deze cellulaire gedrag te onderzoeken. Sterker nog, de zebravis worden reeds benut als instrumenten voor in vivo celbiologie. Het is nu mogelijk om mitochondriën 9-11 visualiseren, centrosomes 2,8,12-14, Golgi 15, De microtubule 4 en 16 actine cytoskelet, endosomen 17 en onderdelen van de apicale membraan complex 1,18, onder andere subcellulaire structuren in de zebravis embryo's in vivo. Tot dusver veel wat bekend is over de functie van deze organellen komt van het bestuderen van hun gedrag in gekweekte cellen. Terwijl in vitro studies enorme inzicht in celbiologie hebben opgeleverd, hebben de cellen in de cultuur niet volledig vertegenwoordigen de complexiteit van de in vivo situatie en dus niet noodzakelijk overeen met de functie en de dynamiek van subcellulaire organellen in vivo. Zebravis embryo's bieden een levensvatbare in vivo alternatief voor de behandeling van subcellulaire dynamiek.

Zoals vertebraten, zebravis bezitten vele orgaansystemen (bijvoorbeeld neurale retina) die homoloog zijn met die in zoogdiersoorten zijn. Bovendien zebravisembryo's worden in toenemende mate toegepast om menselijke ziekten 19,20 modelleren , ook op het gebied centrosomal functie (bijvoorbeeld, microcefalie 21 en congenitale amaurosis 22 Leber's) en mitochondriale functie (bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson 23, tauopathieën 10,24 en Barthsyndroom 25). In vivo beeldvorming op cellulair en subcellulair niveau in deze gevallen zal een beter begrip van de celbiologie ten grondslag liggen aan deze pathologische toestanden mogelijk te maken.

De algemene doelstelling van de hier beschreven methoden is om een uitgebreide gids te verstrekken aan organellen en andere subcellulaire structuren in de zebravis embryo's met behulp van in vivo lichtmicroscoop te onderzoeken. Het volledige work-flow die betrokken zijn bij het ​​visualiseren en het bijhouden van subcellulaire structuren in vivo wordt beschreven - van genetische labeling benaderingen, tot het genereren van transient uitdrukken en stabiele transgene vis, en ten slotte naar de beeldvorming met behulp van wide-field en confocale microscopie. Hoewel elk van deze procedures wordt gebruikt door talrijke laboratoria zebravis, worden de beschreven protocollen geoptimaliseerd en gestroomlijnde onderzoeken van de dynamica van subcellulaire structuren. Twee bijzondere aspecten van het hier beschreven werk garandeert vermelding: Ten eerste, het gebruik van het Gal4-UAS expressiesysteem in meerdere configuraties genetisch label organellen in specifieke celtypen. Ten tweede, een directe vergelijking van wide-field en confocale microscopie om de afbeelding subcellulaire structuren in vivo.

Huidige strategieën om genetisch label organellen en andere subcellulaire structuren in de zebravis ofwel gebruik maken van de afgetopte mRNA 1,4,8 of op basis van DNA-constructen, waar promotor elementen die rechtstreeks de expressie van fusie-eiwitten 9,14,15. In vitro getranscribeerd afgetopte RNA resultaten in te rijden snelle en brede expressie, die niet weefselspecifiek echter. Daarnaast expressie niveaus afnemen in de tijd als de afgetopte RNA wordt verdund of afgebroken. Waardoor het gebruik van RNA gebaseerdeconstrueert naar organel dynamiek in latere stadia van ontwikkeling is beperkt onderzocht (meestal tot 3 dagen na de bevruchting).

Deze beperkingen kunnen worden overwonnen met behulp van DNA-constructen, waarin ruimtelijke en temporele controle van expressie wordt bepaald door promotor elementen. Wanneer DNA gebaseerde constructen worden gebruikt in het kader van het Gal4-UAS systeem aanzienlijk verbetert transgenexpressie gerespecteerd worden 26,27. In dit bipartiete expressiesysteem, celtype-specifieke promoter elementen drijven de expressie van een transcriptionele activator Gal4, terwijl reporter genen stroomafwaarts van het Gal4-bindende stroomopwaartse activerende sequentie (UAS) gekloneerd. Door het combineren van UAS verslaggevers met de juiste Gal4 drivers, kan expressie worden beperkt tot specifieke celtypen, het omzeilen van de noodzaak om de reporter genen te klonen achter verschillende promotors elke keer dat een specifieke uitdrukking patroon gewenst is. Bovendien kan de expressie van meerdere genen UAS reporteraangedreven door een enkele Gal4 activator. Het Gal4-UAS systeem verschaft aldus een veelzijdig en flexibel genetische benadering voor subcellulaire etikettering.

Wide-field en confocale microscopen zijn de werkpaarden van de meeste laboratoria. Breedveldbeeld systemen gebruiken typisch een booglamp als lichtbron en het uitgezonden licht te detecteren met een gevoelige camera die is geplaatst aan het einde van de lichtweg. Dit beeldvormende modaliteit wordt meestal beperkt tot dunne monsters als out-of focus licht verduistert in-focus informatie in dikkere monsters. Confocale microscopen verschillen van wide-field systemen in dat ze zijn gebouwd om signalen die afkomstig zijn van de focal plane over degenen die afkomstig zijn uit focus (dat wil zeggen, "optische sectie") 28 te bevorderen. Om optische sectie bereiken van een pinhole wordt in de emissie pad in een conjugaat staat de puntlichtbron. Lasers worden gebruikt als lichtbronnen en signalen worden gedetecteerd met fotomultiplicatorbuizen (PMT). Praktisch, een laserbundel wordt gehaald via sample point-by-point en de fluorescentie-emissie Bij iedere (pixel) wordt gedetecteerd door de PMT.

Hier beeld dat we precies dezelfde subcellulaire structuren in levende zebravis embryo's met behulp van zowel wide-field en confocale microscopie om een ​​directe vergelijking van beide microscopie modaliteiten te bieden. Het achterliggende doel van het verstrekken van dergelijke vergelijkingen is om richtlijnen voor het kiezen van de meest geschikte microscopie techniek voor de specifieke vraag bij de hand te bieden.

Met de hier beschreven tonen we aan Gal4 UAS-gebaseerde genetische kenmerken van mitochondria en centrosomes benaderingen. Deze organellen worden afgebeeld in verschillende celtypes van het zenuwstelsel en in spiercellen via wide-field en confocale microscopie om de geschiktheid van elke beeldvormende modaliteit tonen. De hier beschreven werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast voor het onderzoeken van andere organellen en subcellulaire structuren in levende zebravis embryo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de plaatselijke regelgeving van de regering van Opper-Beieren (München, Duitsland).

1. Etikettering Organellen en andere subcellulaire structuren

LET OP: Hier genetische reporter constructen die fluorescent label centrosomes, mitochondria en celmembranen worden beschreven.

  1. Gebruik conventionele klonen methoden 29 tot en fusie-eiwitten die fluorescent label centrosomes en mitochondriën te genereren. Kloon de coderende sequentie van zebravis centrin4 (cetn4) in-frame met een fluorescerend eiwit 2 (FP) zoals geel fluorescent eiwit cetn4-YFP genereren. Kloon het mitochondriale targeting volgorde van de subunit VIII van cytochroom c oxidase in-frame met een FP zoals cyaan fluorescente eiwit mitoCFP 9-11 te genereren.
  2. Om expressie van de fusie-eiwitten (cetn4-YFP of mitoCFP) beperken tot specifieke cellen van de zebrafish embryo (bijvoorbeeld neuronen of spiercellen) gebruik maken van de tweedelige Gal4-UAS expressiesysteem 26,27. Ten eerste het genereren van een UAS reporter construct. Gebruik conventionele methoden om de fusie-eiwit in een UAS expressie vector, stroomafwaarts van de Gal4-bindende UAS cassette klonen (varianten uiteen van 1x tot 14x UAS, zie Discussie) 26,27,30 en een minimale promotor (E1b basale promotor van de karper βactin gen), en het genereren van UAS: cetn4-YFP en UAS: mitoCFP.
    OPMERKING: Om UAS verslaggever bereiden constructen voor stabiele transgene lijn generatie extra elementen moeten worden gekloond (zie 3 hieronder)
  3. De cellulaire context waarin centrosomes of mitochondriën beschermde visualiseren, genereren UAS reporter constructen waarin celmembranen worden gelabeld door huisartsen. Kloon de eerste twintig aminozuren van zebravis Gap43 (met palmitoylatie sites) in-frame met een FP te richten dat FP aan de celmembraan (memFP) 31,32.
  4. obtain driver constructen of transgene lijnen waarbij celtype specifieke promoter elementen drijven de expressie van de transcriptionele activator Gal4-VP16 27, 33 of Gal4FF KalTA4 30.
  5. Combineer de UAS reporter constructen met een passende driver construct om uitdrukking aan de gewenste celtype van belang te beperken (bijvoorbeeld in neuronen of spiercellen). Om dit te doen co-injecteren Gal4 chauffeur en UAS reporter constructen aan de ene cel stadium van de bevruchte eieren (voor gedetailleerde instructies zie 2 hieronder) om kortstondig te genereren uiten van vis. Als alternatief, het genereren van een UAS reporter stabiele transgene lijn (voor gedetailleerde instructies zie 3 hieronder) en over te steken naar een Gal4 driver stabiele transgene lijn om nakomelingen met zowel transgenen te genereren.
    LET OP: Het is ook mogelijk om UAS reporter construct / s te injecteren in bevruchte eieren van een Gal4 driver stabiele transgene lijn of een Gal4 driver construct in meststofed eieren van een UAS reporter stabiele transgene lijn.
  6. Co-expressie van meerdere afzonderlijke fusie-eiwitten met het Gal4-UAS systeem gebruikt een Gal4 chauffeur en UAS reporter / s in een van de volgende configuraties: A. meerdere, afzonderlijke UAS reporter constructen (bijv UAS: mitoCFP en UAS: memYFP co -injected met chauffeur Gal4 construct) 10, B. Multiple UAS cassettes op één reporter (bijvoorbeeld UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Bi-directionele UAS reporter (bijv UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 1. Strategieën co-express fusieproteïnen met het Gal4-UAS systeem.
Co-expressie van meerdere fusie-eiwitten kunnen worden bereikt door UAS reporter cassettes in verschillende configuraties: (A) meervoudige, afzonderlijke UAS-driven constructs, (B) meerdere UAS cassettes op een enkel construct of (C) een bidirectionele UAS cassette op een enkel construct. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Genereer kortstondig uitdrukken Fish

OPMERKING: De volgende is een bewerking van eerder gepubliceerde protocollen 34,35. Een eenvoudige injectie setup moet een stereomicroscoop met een vergroting bereik tot 12x, een micromanipulator met een micropipet houder en een bron van luchtdruk. Bereid 2,1-2,5 van tevoren:

  1. Om ei micro-injectie kamers voor te bereiden, voor te bereiden van een oplossing van 1,5% (w / v) agarose in water. Voeg agarose poeder aan water en een magnetron tot de agarose volledig is opgelost. Vul een petrischaal (100 x 15 mm) met deze oplossing.
    1. Laat de agarose oplossing afkoelen tot approximately 45 o C Alvorens plastic micro-injectie mal (40 mm x 66 mm, met 6x 50 mm lange randen die 1,5 mm breed, 1 mm diep en afstand 3 mm van elkaar) op het oppervlak van het gesmolten agarose, zonder hierbij introduceren bubbels op het grensvlak.
    2. Na de agarose sets, bewaar bij 4 o CO / N. Verwijder voorzichtig de mal met behulp van een spatel. Bereid microinjectie meerdere kamers tegelijk, bewaren bij 4 ° C en herhaaldelijk gebruik gedurende enkele weken.
  2. Gebruik een micropipet trekker aan glas injectie capillairen te genereren met een lange schacht 36.
    NB: De specifieke instellingen gebruikt om injectie haarvaten te genereren moet empirisch worden bepaald. Injectie capillairen voren te trekken en opgeslagen voor gebruik.
  3. Meet de concentratie van plasmide-DNA (driver Gal4 en UAS reporterconstructen) voor micro-injectie onder toepassing van een spectrofotometer volgens de handleiding van de fabrikant. Maatregel60, de verhouding van de absorptie bij 260 nm en 280 nm (A260 / 280). Verdun het DNA tot een uiteindelijke concentratie van 100 ng / ul in nuclease-vrij water.
    LET OP: Een A260 / 280-verhouding van ~ 1,8 betekent pure DNA. Overwegen een commerciële kit (gebaseerd op silicabasis binding matrix) om het plasmide DNA te gebruiken voor injectie zuiveren. Plasmide-DNA moet goed zijn om toxiciteit te voorkomen.
  4. Bereid 10 pi injectie-mengsel door het combineren van DNA (0,5 tot 2,5 ul van een 100 ng / pl voorraad voor een uiteindelijke concentratie van 5 tot 20 ng / ul) oplossing Danieau's (0,33 pl 30x stock), fenolrood (0,25 pl, optioneel) en nuclease-vrij water tot 10 ul totaal volume.
    OPMERKING: Empirisch het gehalte aan DNA dat geschikte expressie oplevert. Gal4 chauffeur en UAS reporter plasmiden moeten worden mede-geïnjecteerd. Geen expressie zal volgen wanneer alleen de Gal4 bestuurder of UAS reporter plasmide in wild-type bevruchte eieren wordt geïnjecteerd. Als nochtans thij bevruchte eieren van een driver Gal4 lijn vervolgens injectie van één of meerdere UAS reporter plasmiden volstaat. Omgekeerd, als microinjecting een UAS reporter lijn, alleen de bestuurder Gal4 plasmide moet worden geïnjecteerd. Tenslotte, terwijl fenolrood sterk kunnen helpen om injecties te visualiseren, is een fluorescente verbinding zelf. Daarom kon Fenol Red visualiseren KP verduisteren als imaging is gepland voor 24 uur na de bevruchting (HPF), omdat het niet voldoende kan worden verdund door deze tijd.
  5. De avond voor injecties worden gepland, het opzetten van verschillende paren (typisch 5-10) van mannelijke en vrouwelijke zebravis voor de fokkerij. Gebruik kweekbakken met een insert met een gerasterde bodem en een afneembare tussenschot om de mannelijke en vrouwelijke vissen scheiden.
    NB: Mannelijke en vrouwelijke zebravissen kunnen over het algemeen worden onderscheiden door hun vorm van het lichaam. De mannetjes hebben de neiging om slank te zijn terwijl vrouwen de neiging om een ​​ventraal vooruitstekende buik vertonen. Mannetjes bovendien de neiging om een ​​geel-rode col hebbenoring op hun ventrale buikstreek.
  6. Onmiddellijk voorafgaand aan DNA-injectie, verwijder de verdelers om de mannelijke en vrouwelijke te paren. Ongeveer 15 tot 30 minuten na het verwijderen van de verdeler, controleer eieren op de bodem van de tank. Breng de volwassen vissen met een visnet om een ​​nieuwe kweekbak.
  7. Giet het water, met daarin de nieuw gelegde bevruchte eieren uit de kweekbak in een zeef (bijvoorbeeld een plastic thee-zeef). Was de eieren in de zeef met behulp van een spuitfles bevattende oplossing Danieau's. Keer de zeef op een petrischaal en het gebruik van een spray flesje met een oplossing Danieau om alle eieren (meestal 50 tot 200 eieren per broedpaar volwassen vis) te herstellen.
  8. Met behulp van een microloader pipet, back-vullen met een verrekte injectie capillair met de DNA-injectie-mix. Monteer de injectie capillair in de houder van een micromanipulator en trim de tip, in het kader van de visuele controle van een stereomicroscoop, met behulp van een tang om een ​​micropipet die kan ie creërennetrate het chorion en cytoplasma terwijl de mogelijkheid om een ​​geschikte hoeveelheid van het DNA leveren.
    OPMERKING: De mate waarin de punt van de injectie capillair getrimd moet empirisch worden bepaald en kan het beste worden beoordeeld wanneer injecteren eieren.
  9. Het volume van DNA voor injectie bepalen ontladen een daling van de injectieoplossing in minerale olie. Meet de straal (r) van de druppel met een kalibratie micrometer en bereken het volume (4/3 π r 3). Moduleren volume door aanpassing van de injectiedruk en / of de duur van elke puls injectie.
  10. Met behulp van een plastic pipet alle verzamelde eieren (typisch 50-200, van 2,7 boven) in de loopgraven van een micro-injectie kamer. Onder visuele controle van een stereomicroscoop, een tang om de eieren zodat de cel cytoplasma (transparant) en eigeel (dichte, niet-transparant) is aan te wijzen oriënteren.
  11. Onder de visuele controle van een stereomicroscoop, injecteren van DNA in het cytoplasma van de bevruchte eicel, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de geïnjecteerde volume (1-2 nl) overeen met ongeveer 10% van het volume van de cel.
    OPMERKING: Fenol rood in de DNA-oplossing helpt bij de visualisatie van de geïnjecteerde volume.
  12. Na injectie, maak de eieren van de loopgraven van de spuitgietmatrijs door ze te spoelen met een spuitfles bevattende oplossing Danieau's. Vervolgens overbrengen eieren in een verse petrischaal met een plastic pipet overdracht en onderhouden in een 28,5 ° C incubator.
  13. Handhaaf-un geïnjecteerde eieren als controles om te bepalen of injecties dragen tot hoge sterfte, hetzij als gevolg van fysieke schade tijdens penetratie micropipet of DNA mix.
    LET OP: De hoge sterftecijfers volgende injecties kan worden veroorzaakt door tal van factoren, waaronder te hoge DNA-concentratie of de injectie volumes en / of plasmiden met verontreinigingengen. Om de toxiciteit van lage kwaliteit DNA preps te voorkomen, kan de commerciële kits (gebaseerd op basis van silica bindende matrix) worden gebruikt.
  14. Op regelmatige tijdstippen na injecties, gebruik dan een stereomicroscoop voor het screenen op onbevruchte eieren en dode of misvormde embryo's en gooi deze.
    LET OP: dat aan de eieren die lijken te zijn op de één-cel fase enkele uren na de bevruchting, als onbevruchte. Identificeer misvormde embryo's door grove anatomische afwijkingen zoals een gecompromitteerde anterior-posterior lichaam assen. Amorf materiaal in een chorion suggereert dat het embryo niet verder door ontwikkelingsstadia en stierf. Om vast te stellen of embryo's die werden gemicroinjecteerd ondergaan een normale ontwikkeling te raadplegen anatomische atlassen 37.
  15. Overdracht van de embryo's met behulp van een plastic overdracht pipet om de oplossing Danieau's bestaande uit 1x 1-fenyl 2-thioureum (1xPTU) tussen 10 en 24 HPF om pigment te voorkomen. Handhaving van de embryo's in Danieau's oplossing containing PTU gedurende de duur van het experiment.
    OPMERKING: Naast melanoforen kan iridophores op het oppervlak van de huid problematisch voor beeldvorming. Terwijl PTU iridophore vorming niet remt, mutante lijnen met verminderde aantallen iridophores zoals Roy Orbison (roy) bestaan ​​en kunnen worden gebruikt 38.
  16. Na embryo luik (meestal op de tweede of derde dag na de bevruchting, 2 of 3 DPF), gooi de chorions en wisselen de Danieau's oplossing bevat PTU.
    Opmerking: Deze stappen zijn belangrijk voor de kwaliteit van het embryo medium en de levensvatbaarheid van de gezonde embryo waarborgen.

3. Genereer Stabiele transgene lijnen

OPMERKING: Stabiele transgene lijnen efficiënt worden gegenereerd door het gebruik Tol2 transposon systeem. Een Tol2 transposon vector die het transgen van belang is co-geïnjecteerd samen met mRNA dat codeert voor het transposase enzym in bevruchtend eieren op de één-cel fase. Transposase-eiwit afkomstig van de geïnjecteerde mRNA katalyseert de excisie van het transgen cassette uit het transposon vector en de integratie in het genoom 39.

  1. Kloon het transgen reportercassette (bijv UAS: mitoCFP) tussen Tol2 omgekeerde eindstandige herhalingen in één van de Tol2 vectoren die tegenwoordig in de zebravis gemeenschap als beschreven 40.
    OPMERKING: Tol2 vectoren die een selecteerbare cassette waarin promotorelementen rijden FP expressie in orgaansystemen los van het aandachtsgebied (bijvoorbeeld hart 41 of de lens 42) zijn bruikbaar voor het screenen UAS reporter transgene lijnen in afwezigheid van Gal4 transactivatie.
  2. Met behulp van een commerciële kit (gebaseerd op silicabasis bindende matrix), zuivert het plasmide-DNA worden gebruikt voor injectie. Ervoor dat het plasmide DNA van hoge kwaliteit toxiciteit te voorkomen.
  3. Transcriberen Tol2-transposase coderend mRNA met behulp van eengeschikte transcriptie vector zoals PCS-TP 43. In het kort lineariseren PCS-TP en gebruik een commerciële kit op afgetopte mRNA te genereren en te volgen protocol van de fabrikant. Zorg om besmetting met RNases te voorkomen (bijvoorbeeld gebruik maken van RNAse-vrij pipet tips en tubes). Aliquot het RNA bij een concentratie van 100 ng / ul, voor eenmalig gebruik en bewaar bij -80 o C
  4. Op de ochtend van de injecties, ontdooien een portie van transposase mRNA op ijs. Meng de transposon DNA-vector (2 pl 100 ng / pl) en transposase mRNA (2 pi 100 ng / ul) in een 1: 1 verhouding en voeg 6 ul RNAse-vrij water tot het totale volume op 10 ui te brengen.
    OPMERKING: Een concentratie van 20 ng / ul wordt aanbevolen voor elke maar de optimale concentratie moet empirisch worden bepaald. Gebruik RNAse-vrij water voor verdunning. Gebruik handschoenen bij het hanteren van de DNA-RNA-injectie mix en houd het op het ijs voor de gehele periode van de injecties om de afbraak van de meter te voorkomenRNA.
  5. Met behulp van de gedetailleerde instructies in paragraaf 2 hierboven, injecteer de DNA-RNA-injectie mix in bevruchte eieren in de een-cel podium. Onder visuele controle van een stereomicroscoop richten op de cel cytoplasma bij de een-cel podium voor de hoogste percentages van transgenese efficiency. Handhaving van de geïnjecteerde embryo's bij 28,5 o C tot klaar om te screenen op transgene expressie.
    OPMERKING: PCR kan worden gedaan om te controleren op de efficiëntie van de Tol2 transposase zoals eerder beschreven 44.
  6. Scherm embryo's in een petrischaal voor transgenese met de oculairen van een fluorescentie stereomicroscoop.
    LET OP: Gebruik de juiste filter sets van de microscoop aan FP expressie van de selecteerbare cassette visualiseren (dat wil zeggen, fluorescentie in het hart of de lens) op 2 of 3 DPF. Identificeren van potentiële transgene embryo's door expressie (in het hart of de lens) en deze embryo's te verhogen tot volwassenheid (F 0 generatie) met behulp van standaardprotocollen 45. Als alternatief, het identificeren van potentiële transgene embryo's met behulp van PCR zoals beschreven in 46.
  7. Zodra de UAS verslaggever F 0 vis zijn 2,5-3 maanden oud, kruis ze (zie 2.5 voor details) om niet-transgene wild-type vis eieren naar een F 1 generatie vast te verwerven. Als alternatief, steek de UAS verslaggever F 0 vis om een driver Gal4 lijn naar een F-1 generatie vast te stellen. In het laatste geval kan de UAS-aangedreven transgen rechtstreeks worden bewaakt in de embryo's van het kruis.
  8. Gebruik een fluorescentie microscoop ontleden screenen F 1 embryo voor expressie van het transgen of instelbare cassette.
    OPMERKING: Wanneer expressie wordt bevestigd het transgen kan worden gezegd dat kiemlijn verzonden. Transgenese is niet-Mendeliaanse bij de F 0 podium. Het aantal embryo expressie het transgen kan variëren van een lage waarde om de overgrote meerderheid van afzonderlijke clutches. Transposon integratie in verschillende F 0 vis kan sterk variëren, wat resulteert in verschillende expressie patronen. Daarom handhaven F 1 vis uit verschillende F 0 oprichters als afzonderlijke sub-lijnen. Transposon integraties in F 1 vis zijn stabiel en worden op de volgende generaties doorgegeven in een Mendeliaanse manier.
  9. Handhaaf elke F 0 vis in aparte tanks opnieuw te identificeren transgene dragers.

4. Bereid Embryo's for Imaging op Upright Microscope

OPMERKING: De hier beschreven procedures zijn geoptimaliseerd voor weergave op staande microscoop met lange werkafstand water dompelen-cone doelstellingen.

  1. Gebruik een fluorescentie microscoop ontleden embryo's voor transgenexpressie screenen.
    OPMERKING: Expressie van een UAS reporter transgen zal afhangen van de specifieke Gal4 lijn driver gebruikt. Select embryo's voor imaging experimenten gebaseerd op gewenste expression patroon.
  2. Overdracht van de geselecteerde embryo met een kunststof pipet om een ​​afzonderlijke petrischaal die Danieau's buffer met 1x PTU en 1x tricaïne.
    OPMERKING: Wanneer de etikettering is schaars (slechts enkele cellen in een orgaan-systeem) monteren van de embryo's in agar (zie 4,3-4,7 hieronder) en het scherm voor transgenexpressie met behulp van een wide-field microscoop met een hoge vergrotingsfactor doelstellingen (zie 5.1 hieronder). Tricaïne verdooft de vis en effectieve binnen enkele seconden moeten zijn. Als vis niet geïmmobiliseerd is het waarschijnlijk dat de tricaïne heeft afgebroken. Mogelijke redenen voor deze achteruitgang zijn: een slechte opslag van tricaïne, dat is lichtgevoelige 47.
  3. Bereid de agarose om de vis te bedden door oplossen laagsmeltende agarose poeder in buffer Danieau tot een eindconcentratie van 0,7%. Aliquot (1 ml) en in een warmte-blok laten 40 ° C tot gebruik.
    OPMERKING: Hogere concentrationen van agarose (tot 1,5%) kan ook worden gebruikt om vis te verankeren.
  4. Voeg 50 ul van 20x voorraad tricaïne en 20 gl van een 50x voorraadoplossing van PTU tot 1 ml van laagsmeltende agarose en meng door de zijkant van de buis te tikken. Zet de buis naar de warmte-blok. Met een plastic pipet overdracht voorzichtig pipet enkele (1-10) verdoofd embryo in de agarose, overdragende vloeistof zo min mogelijk te vermijden verdunning van de agarose.
  5. Met een plastic pipet overdracht alle embryo's met een kleine hoeveelheid agarose met een glazen bodem petrischaal.
  6. Werken relatief snel een tang om de embryo's te positioneren in de gewenste oriëntatie, afhankelijk van de structuur af te beelden.
    LET OP: Orient embryo's op hun kant als het netvlies of Rohon-Beard (RB) sensorische neuronen moeten worden afgebeeld.
  7. Laat de agarose te stollen gedurende tenminste 15 minuten. Voeg Danieau's buffer met 1xPTU en 1xTricaine om de embryo's ingebed in Agaro dekkense. Plaats het schaaltje met-agarose ingebed embryo's in een incubator bij 28,5 o C tot klaar om de afbeelding.

5. Imaging Cellulaire en subcellulaire structuren met behulp van Wide-field of confocale microscopie

LET OP: Wide-field microscopie en point-scanning confocale microscopie zijn de meest gebruikte modaliteiten voor het fluorescent gelabelde zebravis embryo's Tabel 1 geeft een overzicht van de belangrijkste voor- en nadelen van beide systemen.. Beide vormen van microscopie, worden embryo gemonteerd in agarose zoals hierboven beschreven 4 en gehandhaafd op 28,5 ° C gedurende het beeldvormende experiment door een verwarmingskamer op het podium van de microscoop. Belangrijk is dat de schaal met agarose ingebedde embryo equilibreren tot 28,5 ° C voor de beeldvorming vangt aan temperatuurschommelingen drift in de z-dimensie veroorzaken. Bij het uitvoeren van de lange termijn imaging experimenten (meer dan several uur), plaats een plexiglas deksel over de petrischaal om verdamping van de buffer te verminderen.

Wide-field Point-scanning confocale
Kosten Relatief goedkoop Dure (ong. 5x meer)
Foto-bleken Laag Hoog. Het monster wordt blootgesteld aan laserlicht boven en onder het brandpuntsvlak.
Foto-toxiciteit Laag High (zie foto-bleken hierboven)
acquisitie snelheid Snel Langzaam
Resolutie in xy wet Abbe recht Abbe (kan worden verbeterd door toepassing 40% met een klein gaatje,. maar inde meeste instellingen dit heeft weinig praktische toepassing)
optische snijden arm Ja (kan worden aangepast door pinhole grootte)
penetratie Beperkt tot oppervlakkige structuren (bijv Rohon-Beard cellen of spiervezels) Beperkt tot <100 mm vanaf het oppervlak van het embryo

Tabel 1. Algemene vergelijking van wide-field en point-scanning confocale microscopie

  1. Wide-field microscopie
    LET OP: Hier richtlijnen zijn bedoeld voor het afbeelden van de zebravis embryo's met behulp van een rechtopstaande wide-field microscoop met lange werkafstand water-dipping-cone doelstellingen. De microscoop is uitgerust met een gekoelde CCD camera en filtersets voor het visualiseren verschillende fluoroforen gemonteerd op een geautomatiseerde filterwiel voor het snel verwerven van meerdere kanalen.Beeldacquisitie wordt gecontroleerd door μManager, een open source microscopie softwarepakket 48. Een specifiek voorbeeld voor het afbeelden mitochondria in RB sensorische neuronen is aangebracht. RB cellen zijn genetisch gelabeld met membraan gerichte YFP en hun mitochondria zijn GVB-tag (zie 1.1).
    1. Mount embryo aan hun kant in laagsmeltende agarose zoals hierboven beschreven 4.
    2. Laat de schaal met gemonteerde vis de temperatuur ervan op 28,5 ° C in een verwarmingskamer op het podium van de microscoop alvorens beeldvorming.
    3. Gebruik een lage vergroting water dompelen kegel objectieve kijk door de oculairs van de microscoop om een ​​gebied op het oppervlak van de embryo beeld te selecteren.
      LET OP: Als de stabiele transgene MitoFish reporter lijn, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6, wordt gebruikt in combinatie met een bestuurder lijn zoals HUC: Gal4 dan de meeste RB neuronen worden gelabeld, en verschijnen als een dichte mesh-werkzaamheden van neurieten cilinders op het oppervlak van het embryo. Als micro-injectie van DNA-constructen wordt gebruikt om schaars etikettering te bereiken (bijvoorbeeld Sensory: Gal4-VP16 met UAS: mitoCFP en UAS: MA-YFP), scherm embryo's voor dubbel-gelabelde cellen te identificeren.
    4. Open de microscoop software (μManager 1.4) en klik op 'Illumination' 'onder "Configuratie-instellingen" om de juiste filter sets te definiëren voor de golflengte van belang (YFP of GVB voor de huidige voorbeeld). Onder "Camera-instellingen" in te voeren de belichtingstijd die nodig is om een ​​geschikte afbeelding te verwerven.
      LET OP: De "Verlichting Settings" is vooraf ingesteld door de gebruiker bij de installatie van de software en wordt geladen bij het ​​openen μManager. Als de software niet is geconfigureerd voor het filterwiel controleren, handmatig filterwiel bewegen in de toren naar de gewenste positie.
    5. Ga verder met een lange-werkafstand water-dipping-cone doel, variërend van 40-100x vergroting. Kiezende doelstelling die de hoogste numerieke apertuur (NA) heeft en chromatisch gecorrigeerd (apochromaat).
    6. Op "live" naar het gezichtsveld kiezen: Bij de RB neuron, het mitochondriale transport op de steel axon, afkomstig van het cellichaam, of in de perifere as.
      OPMERKING: De perifere assen van RB neuronen in de staartvin vouw van het embryo een ideale mogelijkheid om het grote beeldveld wat vlak en kan dus meegenomen op een enkel beeld met een breed veld microscoop. Het is daarom belangrijk om de embryo mount zo vlak mogelijk op de zijkant zodat de staartvin vouw evenwijdig aan de bodem van de petrischaal is.
    7. Na het kiezen van een gezichtsveld, klik op de "rechthoekige selectie" knop in het menu ImageJ, een regio van belang (ROI) te definiëren en klik op "ROI" in het venster μManager. Na het selecteren van de ROI voor imaging, klikt u op "Stop" en "Opslaan" om take een afbeelding van de YFP kanaal naar de lokale morfologie van de neurieten / s opnemen.
    8. Om het beeld mitochondriale vervoer klik op de "Multi-D Acq." knop. Let op een extra venster ( "Multi-dimensionale Acquisition") en kies het aantal tijdstippen alsmede de interval tussen de tijdstippen in dit venster. Gebruik frame rates van 0,3-1 Hz. Voer opnamen ten minste 10 minuten om zoveel data-punten te verzamelen.
    9. In het venster "Multi-dimensionale Acquisition", klik op "Channels", toe te voegen en te definiëren de golflengte voor de beeldvorming (GVB voor mitochondria in dit voorbeeld) en de tijd van de blootstelling. Blijf belichtingstijden tot beneden 400 msec voor beeldvorming mitochondriale transport.
    10. Klik op de optie 'Save Images "in het venster" Multi-dimensionale Acquisition ", om de bestanden automatisch op te slaan in een bepaalde map die in het' Directory root '. Klik op "Acquire" in de rechterbovenhoek om tim beginnene-lapse imaging.
    11. Handmatig passen de focus tijdens het time-lapse-opname om te compenseren voor eventuele verschuiving in de z-dimensie.
      Opmerking: Deze parameters gebruikend mitochondriale vervoer RB neuronen kan worden afgebeeld zolang 4 uur.
  2. confocale microscopie
    LET OP: Hier richtlijnen zijn bedoeld voor beeldvorming met een rechtopstaande Olympus FV1000 confocale microscoop en lange-werkafstand water-dipping-cone doelstellingen. De microscoop is uitgerust met meerdere laserlijnen en meerdere detectors (conventionele PMT en gevoeliger galliumarsenide fosfide detectoren) waarmee voor multikanaals beeldvorming. Er wordt specifiek verwezen naar Olympus FluoView software. Wel dient de beeldvormingsparameters beschreven gemakkelijk overdraagbaar naar andere confocale systemen.
    1. Mount embryo in laagsmeltende agarose in een oriëntatie die geschikt is voor het orgaan / structuur af te beelden, zoals in 4 hierboven.
    2. Laat de schaal met gemonteerde vis de temperatuur ervan op 28,5 ° C in een verwarmingskamer op het podium van de microscoop alvorens beeldvorming.
    3. Gebruik lange-werkafstand water-dipping-cone doelstellingen voor de confocale microscopen in een rechtopstaande configuratie. Kies doelstellingen met de hoogst mogelijke NA de hoeveelheid fluorescentiesignalen die kan worden verzameld maximaliseren en de beste oplossend vermogen. Bij het verzamelen van beelden van meerdere kanalen kiezen chromatisch gecorrigeerd doelstellingen (Apochromat).
    4. Open de microscoop software en klik op "Trans Lamp" of "Epi Lamp" ofwel verzonden of fluorescentie licht respectievelijk gebruiken om de regio van belang te identificeren via de oculairs van de microscoop.
    5. Gebruik de software voor het opzetten van de volgende scanning parameters om het beeld stacks te verwerven:
      1. In het venster "Verwerving Setting" te controleren of de gekozen voor de beeldvorming doelstelling overeenkomt met de doelstelling die op de drop-dow verschijntn menu met beschikbare doelstellingen.
        LET OP: Dit is om ervoor te zorgen dat alle pre-berekende parameters voor een bepaald doel (bijvoorbeeld, laterale en axiale resolutie, grootte van de confocale diafragma etc.) opgaan en betrouwbaar kan worden gebruikt.
      2. Selecteer de juiste laser lijn / s, en excitatie en emissie dichroïde filters om het specifieke fluorescerend eiwit (s). Doe dit door te klikken op de "lijst Dye" knop in het venster "Image Acquisition Control" en kies de juiste fluorofoor / s. Of klik op de knop "Licht pad en kleurstoffen" om deze parameters handmatig in te stellen.
        Opmerking: Wanneer de "Dye List" toets de gekozen optie de software automatisch de juiste laserlijnen, excitatie en emissie filters en dichroïsche regelt de grootte van de confocale opening gepast.
      3. In het venster "Acquisition Setting", stel de "Zoom" factor en "Size aspect ratio "(dat wil zeggen, 512x512, 1024x1024 etc.) van het gescande beeld om de pixelgrootte verkrijgen die nodig is om de beste oplossen de structuren af te beelden. Stel de pixelgrootte tot ongeveer de helft van de theoretische resolutie van het doel, ter vorming na Nyquist steekproefcriteria . Om de pixelgrootte van de verworven beeld klik op de knop vast te stellen met het symbool voor informatie ( "i") in het venster "Image Acquisition control".
      4. Stel de scan snelheid naar de snelst mogelijke (2 ps / pixel) in het venster "Acquisition Setting".
      5. In de "Image Acquisition Control" venster op Kalman lijn middeling om noise.A factor verminderen van 2-3 meestal volstaat.
      6. Selecteer een sequentiële scan modus wanneer beeldvorming fluoroforen met overlappende spectra. Om dit te doen, klik op "Sequential" en "Line" in het venster "Image Acquisition Control".
      7. Stel het vermogen van de desbetreffende laserlijn / s (typischdan 5%). De specifieke waarden moet empirisch worden bepaald.
      8. Klik op "XY herhalen" of de "Focus x2" of "Focus x4" knop om de geselecteerde regio continu te scannen, terwijl het aanpassen van de detector instellingen voor elk kanaal. Adjust "HV", "Gain" en "Offset" voor elk kanaal aan beelden die het hoogste dynamische bereik van grijswaarden hebben te verwerven.
        NB: De specifieke waarden voor deze instellingen moeten empirisch worden bepaald. "HV" past de spanning op de detector om de gevoeligheid te veranderen, "Offset" stelt het uitgangssignaal van de detector en "Gain 'vermenigvuldigt het uitgangssignaal van de detector door een constante factor.
      9. Druk op Ctrl + H om de verkregen beelden via een opzoektabel (HiLo) dat aangeeft onder-verzadigd visualiseren (lijken blauw) en oververzadigde pixels (verschijnen rood), die beide moeten in het algemeen worden vermeden. Re-evaluatie van het vermogen van de betreffende laser line / s en detectorinstellingen.
        LET OP: Het gebruik van hoog laservermogen en een hoog niveau van de "HV" van de detector zal leiden tot meer signaal. Hogere laservermogen zal echter leiden tot een verhoogde bleken en foto-toxiciteit. Het verhogen van de "HV" zal leiden tot meer lawaai. Daarom is een compromis worden gevonden bij het ​​instellen van laservermogen en "HV" om beelden met een aanvaardbaar niveau van lawaai te verwerven terwijl het voorkomen van foto-schade (zie ook tabel 1).
      10. Verzamel beelden van een bepaald volume door te focussen op de bovenste en onderste grenzen van het gebied van belang. In de "Acquisition Setting" venster klik op de "End Set" en "Start Set" set knoppen van de z-stack raam op de bovenste en onderste grenzen van het volume af te beelden. Selecteer een stapgrootte die de helft van de z-resolutie voor het gegeven doel (bijv., Als z resolutie 2 urn kiezen 1 pm). Om de z-resolutie van de objectiviteit te bepalene klik op de knop met het symbool voor informatie ( "i") in het venster "Image Acquisition Control".
      11. Stel een tijdreeks om z-stacks verzamelen in een temporele frequentie die geschikt is voor de dynamiek van de sub-cellulaire structuur wordt afgebeeld is. In de "TimeScan" subvenster Voer de frequentie waarmee z-stacks worden verkregen ( "Interval" ') en het aantal keren dat de beelden worden verkregen ( "Num").
      12. Klik op de "diepte" en "Time" knoppen in het venster "Image Acquisition Control" om te bevestigen dat een z-stack en time-serie zal worden verworven. Klik tenslotte op de "xyzt" knop om te beginnen met het verwerven van time-lapse beelden.
      13. Na afronding van het beeld overname, observeren "Reeks Done" op de software-interface. Klik erop en de beelden in "OIB" formaat op te slaan om de beelden en metadata in verband met hen op te nemen.
        OPMERKING: Beelden verkregen opwide-field microscoop en confocale microscoop kunnen worden gevisualiseerd en geanalyseerd met behulp van software zoals Fiji, een gratis openbaar domein beeldbewerkingsprogramma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier is het gebruik van wide-field en confocale microscopie om de afbeelding mitochondria en centrosomes in levende zebravis embryo's is direct vergeleken en gecontrasteerd. Afhankelijk van de locatie van de cellen waarin organel dynamiek te onderzoeken en de eigenfrequentie van de specifieke subcellulaire gebeurtenissen, algemeen hetzij wide-field of confocale microscopie is de betere keuze. We afgebeeld organellen in RB neuronen op het oppervlak van het embryo en retinale cellen di...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen we de veelzijdigheid van het Gal4-UAS expressiesysteem om fluorescent label mitochondria, centrosomes en de cellulaire membranen van specifieke celtypen in vivo in zebravisembryo's. Veel fluorescerende fusie-eiwitten die andere organellen of subcellulaire structuren label kan worden gevonden in de gepubliceerde literatuur en kunnen worden verkregen bij het ​​desbetreffende laboratorium, commerciële bronnen of niet-commerciële plasmide depots (bijvoorbeeld Addgene). In nieuw fluorescent f...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.E. wordt ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 en de Graduate School van de Technische Universität München (TUM-GS). G.P. werd ondersteund door TUM-GS. L.T. wordt ondersteund door een EMBO-beurs (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'s werk aan zebravissen werd ondersteund door de DFG via de Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); het Center for Integrated Protein Sciences (Munich) en het Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) van de Europese Gemeenschap onder subsidieovereenkomst nr. 200611 (MEMOSAD). Hij is momenteel een New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow en werd ondersteund door een beurs van de Duitse Academie van Wetenschappen Leopoldina. L.G. wordt ondersteund door financiering van de DFG via SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11.

We zijn dankbaar aan Kristina Wullimann voor het onderhouden van onze visfaciliteit, Yvonne Hufnagel voor technische ondersteuning en Thomas Misgeld voor opmerkingen over het manuscript. We zijn dankbaar aan R. Köster (Technische Universität Braunschweig) voor het verstrekken van de M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) waaruit we Centrin-YFP hebben gekloond en S.C. Suzuki en T. Yoshimatsu (University of Washington) voor het verstrekken van de 14xUAS:MA-cerulean cassette die we hebben gebruikt om het reporterconstruct te genereren om CentrinFish te maken. We danken ook S.C. Suzuki en T. Yoshimatsu (University of Washington) voor de Otx2:Gal4 transgene lijn, A. Sagasti voor de Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) en M. Nonet (Washington University in St. Louis) voor de pCold Heart Tol2 vector. We erkennen Bettina Schmid, Alexander Hruscha en Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich - DZNE) voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van MitoFish.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose (2-hydroxyethylagarose)Sigma-AldrichA4018-10GLow-gelling temperature Type VII
Block heaterEppendorfThermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996% Aldrich202967-50gTo prepare 30x Danieau's
CCD cameraQimagingRetiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 ForcepsDumont - Fine Science Tools11252-50#5 Forceps
Confocal laser-scanning microscopeOlympusFV1000 Fluoview
Culture dish heaterWarner Instrument CorporationDH-35Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate saltPharmaQTricaine PharmaQ-25gTricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscopeLeicaM205 FA
GeneClean kitMP Biomedicals111001200
Glass Bottom Culture DishesMatTek CorporationP35G-0-14-C35 mm petri dish, 14 mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needlesWorld Precision Instruments Inc. TW100F-4For microinjections
HEPESSigmaH3375-250gTo prepare 30x Danieau's
High vacuum greaseDow Corning DCC000001242 150gSilicon dioxide grease
KCl 99%Sigma-AldrichS7643-5kgTo prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagentSigma-Aldrich230291-500gTo prepare 30x Danieau's
Microinjector EppendorfFemtoJet
Microloader tipsEppendorf9300010070.5-20 ul
MicromanipulatorMaerzhaeuser WetzlarMM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holderIntracelP/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription KitAmbionAM1340To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5%Sigma-AldrichP9541-1kgTo prepare 30x Danieau's
NanophotometerTo measure DNA/RNA concentration
Needle pullerSutter InstrumentP-1000Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W NikonWater-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98%SigmaP7629-10GPTU (prevents pigmentation)
Petri dishesSarstedt AG 82147292 x 16mm 
Plastic molds Adaptive Science ToolsTU-1For microinjections
Plexiglas cover-with a holeCustom-madeThe hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic)To collect zebrafish eggs
Temperature controllerWarner Instrument CorporationTC-344BDual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettesSarstedt AG 86.11713.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00WOlympusWater-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W OlympusWater-dipping-cone objective
Widefield microscopeOlympusBX51WI
PTU (50x Stock)Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock)Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock)1,740 mM  NaCl 
21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2O 
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM     HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 oC 
Use at 0.3x working solution

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191 (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56 (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15 (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2(2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45 (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32 (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33 (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11 (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70 (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30 (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240 (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142 (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163 (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3 (10), 130065(2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20 (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74 (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99 (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80 (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108 (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341 (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184(2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (3), prot5586(2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42 (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21 (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. , 14.20(2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. , 21.4(2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556(2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33 (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Subcellulaire beeldvormingmitochondriaal transportcentrosoomdynamicaGal4 UAS systeemfluorescente labelingwide field microscopieconfocale microscopietime lapse beeldvormingin vivo microscopie

Gerelateerde artikelen